论文摘要
木质纤维素是地球上最丰富的可再生生物质。天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等,纤维素在木质纤维素中为最简单的成分,半纤维素和木质素包裹在纤维素的外面,形成了一种天然屏障,这层天然屏障在保护植物的同时,使得人工进行生物降解转化的效率很低,无法适应大规模工业化的要求。自然界中存在一些降解木质纤维素材料的生物系统,白蚁也为一种,白蚁和共生细菌由来木质纤维素酶具有较高的酶活和良好的耐碱性。本文以白蚁和共生细菌为对象,探究了几种木质纤维素酶的协同作用,同时对实验室前期分离得到的厌氧菌Dysgonomonas macrotermitis开展了相关研究,该属为黄翅大白蚁（Macrotermes barneyi）肠道第二优势菌群,具有纤维素活性,为了得到酶学性质较好的木质纤维素酶,进而加快其在工业领域的应用,我们进行了如下研究:M barneyi后肠D.macrotermiD.木聚糖酶的异源表达。通过基因组测序、blast比对分析和分子生物学方法,找到5个木聚糖酶基因,并在E.coli JM109中克隆表达,发现只有DysxynB（orf-00078）和DysxynE（orf-03642）具有木聚糖酶活,蛋白分子量为40kDa和33kDa,分别属于GH10、GH11家族。通过酶学活性分析,酶比活分别为:259.5 U/mg和151.2 U/mg,最适温度和pH均为45℃和7.0,有较强的耐碱性,在pH5.0-9.0环境下处理仍能保持50%以上的酶活。通过TLC分析,发现DysxynB和DysxynE均不具有β-木糖苷酶的活性。M barneyi后肠D.macrotermitis β-1,4-内切葡聚糖酶的异源表达。通过基因组测序、blast 比对分析和分子生物学方法,找到6个β-1,4-内切葡聚糖酶。并在E.coll JM109中克隆表达,只有DysengE（orf-01678）具有EG酶活,其分子量为20 kDa,属于GH5家族。通过酶学活性分析,该EG酶的酶比活为0.58 U/mg,最适温度和pH分别为40℃和8.0,耐碱性强,在pH4.5-9.0之间仍能保持90%以上的活力。对其进行生物信息学分析,发现是目前为数不多的白蚁肠道共生菌来源的GH5家族EG酶。同时,本文采用多质粒（pETDuet-1和pRSFDuet-1）策略,在大肠杆菌中共表达白蚁及其肠道微生物来源的β-葡萄糖苷酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、漆酶和木聚糖酶共4种木质纤维素酶,经过SDS-PAGE分析得到与理论值一致的蛋白条带,且均具有酶活性。以磷酸处理的微晶纤维素（PASC）为底物,测定了共表达酶粗酶液与单独表达酶混合液的协同作用因子,从还原糖的产量上经计算共表达的粗酶液比单独表达酶的混合液对PASC的降解协同作用提高44%;以滤纸和磷酸处理的玉米芯为底物,测定降解协同作用,分别提高34%和20%。结果表明,共表达酶的降解效率要高于混合的单组分酶液降解效率的总和。M Barneyi后肠类芽孢杆菌来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达。木聚糖酶有较广的工业应用范围,酵母细胞有较强的分泌能力和后加工能力,分泌表达能够降低生产成本。本文使用pPICZα-A质粒对木聚糖酶Xy1Mb1,进行了分泌表达。在GS115中表达的XylMb1,其蛋白分子量的大小比理论值（20kDa）偏大,为35kDa。总之,本文克隆表达了D.macrotermitis来源的木聚糖酶和EG酶,对其酶学性质分析研究;同时对白蚁和共生菌来源的木质纤维素酶进行了共表达,并测定了其对一些天然底物的降解协同作用。同时为了加快木质纤维素酶在工业领域的应用,在毕赤酵母系统中实现了木聚糖酶Xy1Mb1的分泌表达。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 杜娇
导师: 倪金凤
关键词: 黄翅大白蚁,木质纤维素酶,共表达,协同作用
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
分类号: Q78
总页数: 91
文件大小: 5795K
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