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用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用

2020-12-02阅读(620)

用于棉花抗黄萎病育种的根系特异性启动子的克隆与应用

论文摘要

棉花是我国重要的经济作物,大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病一直严重影响着棉花的产量与品质。由于棉花抗黄萎病种质资源的匮乏,传统育种和栽培技术的改进并不能有效对棉花黄萎病进行预防和控制。因此通过现代基因工程技术选育抗病新品种是提高棉花黄萎病抗性的最有效方式。根特异性启动子可以使外源基因仅在受体植物的根部特异表达,从而减少外源基因在受体植物中非特异性表达所造成的浪费以及杜绝外源基因多部位表达对受体植物正常生长的干扰,但现阶段对于棉花根特异性启动子的研究还较为少见。本研究根据已报道的根特异性基因设计引物,利用PCR扩增技术从棉花中克隆获得了四个启动子MIC-3、WRK Y54、TIP-2和PRP-2。启动子序列分析结果表明,四种启动子中都含有ROOTMOTIFTA POX1、OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE等根特异性表达元件,推测四种启动子为根特异性启动子,其均能够驱动外源基因在植物根部特异性表达。本研究以双元表达载体pCOMBIA1301为模板,通过酶切-连接的方式将pCOMBIA1301载体中的组成型启动子CaMV35S替换为四种棉花根特异性启动子,从而获得了棉花根特异性启动子驱动G US基因表达的重组表达载体,分别命名为MIC-3::GUS、WRKY54::GUS、TIP-2::GUS和PRP-2::GUS,通过根癌农杆菌介导法将重组表达载体转化拟南芥。对转基因植株进行GUU S组织化学染色,结果表明GUS报告基因主要在转基因植株的根部特异性表达,说明MI C-3、WRKY54、TIP-2和PRP-2四种启动子具有较强的根特异表达性。BTD-S为本实验室研究设计的人工合成抗菌肽基因,其对棉花黄萎病具有显著的抗病功能。本研究以重组表达载体MIC-3::GUS为模板,通过酶切-连接的方式将MIC-3::GUS表达载体中的GUS报告基因替换为人工合成抗菌肽基因BTD-S,从而获得了 MIC-3启动子驱动人工抗菌肽基因BTD-S的重组表达载体,命名为MIC-3::BTD-S,通过根癌农杆菌介导法将其转化拟南芥。对转基因植株中的BTD-S抗菌肽基因表达水平进行定量RT-PCR分析,结果表明BTD-S抗菌肽基因主要在转基因植株的根部表达,其根部表达量明显高于叶片等部位,说明MIC-3启动子能够驱动BTD-S抗菌肽基因在植物根部的特异性表达。对转基因植株进行离体抑菌效果鉴定,其结果表明转基因植株根部蛋白粗提取液能够有效抑制大丽轮枝菌菌丝及孢子的生长,说明MIC-3启动子能够驱动BTD-S抗菌肽基因在植物根部产生棉花黄萎病抗性。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词表
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 植物启动子概述
  •     1.1.1 植物启动子的结构
  •       1.1.1.1 核心启动子区
  •       1.1.1.2 上游活性序列
  •     1.1.2 植物启动子的类型
  •       1.1.2.1 组成型启动子
  •       1.1.2.2 组织特异性启动子
  •       1.1.2.3 诱导型启动子
  •   1.2 根特异性启动子研究进展
  •   1.3 现代基因工程技术在棉花抗黄萎病育种中的必要性
  •   1.4 抗菌肽概述
  •     1.4.1 抗菌肽的种类
  •     1.4.2 人工合成抗菌肽基因BTD-S对棉花黄萎病的抗性
  •   1.5 本研究的目的与意义
  • 第二章 棉花根特异性启动子的克隆及序列分析
  •   2.1 材料与试剂
  •     2.1.1 试验材料
  •     2.1.2 试验试剂
  •     2.1.3 引物设计和启动子测序
  •     2.1.4 实验所用到的软件工具
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 棉花基因组DNA的提取
  •     2.2.2 棉花根特异性启动子的克隆
  •     2.2.3 启动子片段的回收
  •     2.2.4 连接T载体
  •     2.2.5 转化大肠杆菌
  •     2.2.6 重组载体质粒的扩增及提取
  •     2.2.7 启动子序列分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 根特异性启动子的获得
  •     2.3.2 启动子序列的同源性比对
  •     2.3.3 MIC-3（1204bp）启动子序列分析
  •     2.3.4 TIP-2（802bp）启动子序列分析
  •     2.3.5 PRP-2（1287bp）启动子序列分析
  •     2.3.6 WRKY54（819bp）启动子序列分析
  •   2.4 讨论
  •     2.4.1 根特异性启动子的选择
  •     2.4.2 根特异性启动子的克隆
  • 第三章 GUS基因表达体系的构建及鉴定
  •   3.1 材料与试剂
  •     3.1.1 试验材料
  •     3.1.2 工具酶及试验试剂
  •     3.1.3 引物设计与合成
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 GUS基因表达载体的构建
  •     3.2.2 冻融法转化农杆菌
  •     3.2.3 农杆菌重组子的筛选
  •     3.2.4 拟南芥的种植
  •     3.2.5 浸花法转化拟南芥
  •     3.2.6 GUS转基因植株的筛选
  •     3.2.7 GUS转基因植株的组织化学染色
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 GUS基因表达载体的获得
  • 1代转基因拟南芥的分子鉴定'>    3.3.2 T1代转基因拟南芥的分子鉴定
  •     3.3.3 GUS转基因植株的组织化学染色观察
  •   3.4 讨论
  •     3.4.1 表达载体的构建方法
  •     3.4.2 根特异性启动子的验证
  • 第四章 BTD-S抗菌肽基因表达体系的构建及鉴定
  •   4.1 材料与试剂
  •     4.1.1 试验材料
  •     4.1.2 工具酶和试验试剂
  •     4.1.3 引物设计与基因序列合成
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 BTD-S抗菌肽基因表达载体的构建
  •     4.2.2 冻融法转化农杆菌
  •     4.2.3 农杆菌重组子的筛选
  •     4.2.4 拟南芥的种植
  •     4.2.5 浸花法转化拟南芥
  •     4.2.6 BTD-S转基因植株的筛选
  •     4.2.7 BTD-S抗菌肽基因的RT-PCR鉴定
  •       4.2.7.1 转基因植株RNA的提取
  •       4.2.7.2 cDNA的合成
  •       4.2.7.3 RT-PCR
  •     4.2.8 转基因植株根系蛋白均浆液的提取
  •     4.2.9 BTD-S转基因植株抑菌效果鉴定
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 BTD-S抗菌肽基因表达载体的获得
  • 1代转基因拟南芥的分子鉴定'>    4.3.2 T1代转基因拟南芥的分子鉴定
  •     4.3.3 BTD-S抗菌肽基因的组织表达活性
  •     4.3.4 BTD-S转基因植株的离体抑菌效果
  •   4.4 讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 研究结论
  •   5.2 研究展望
  • 参考文献

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈亚东

    导师: 王学德

    关键词: 棉花,黄萎病,根特异性启动子,人工合成抗菌肽基因

    来源: 浙江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,植物保护

    单位: 浙江大学

    分类号: S435.62;Q943.2

    总页数: 71

    文件大小: 6203K

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