登革病毒诱导血管渗漏相关分子机制研究

论文摘要

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属的一个血清型亚群,根据其抗原性的不同可以分为5个不同的血清型。同一血清型中又可因为抗原性的差异分为不同的基因型。登革病毒是一种虫媒病毒,其主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊进行传播。登革病毒主要流行于热带和亚热带地区,在亚洲,太平洋群岛及中、南美洲等许多国家均已造成严重的威胁。登革病毒感染人体后主要引起登革热以及发病率和死亡率都很高的登革出血热和登革休克综合征。其中登革热的症状主要是发热,头痛,皮疹以及肌肉和关节疼痛,人体在感染同一血清型之后会获得终生免疫。但是不同血清型所造成的二次感染却会造成严重危及生命的登革出血热和登革休克综合征,这种现象被称作“抗体依赖性增强作用”。其主要的临床症状是低血压,血容量减少及血管通透性的改变。其中血管通透性的改变是其主要的研究热点,但是具体的机制还不是太清楚。临床研究发现登革病毒感染会诱导产生的大量的炎症因子,并且和登革疾病的严重程度呈正相关。在登革病毒感染的过程中,炎症因子参与调节宿主的体内稳态平衡以及参与疾病的发生。IL-1β,是宿主体内产生的一类非常重要的炎症因子,其主要由炎性小体激活产生。NLRP3炎性小体在宿主天然免疫系统识别病原体入侵,特别是RNA病毒感染的过程中发挥着重要的作用。在本研究中,我们发现了NLRP3蛋白识别登革病毒感染从而促进炎性小体组装的一个新机制,并且还创新性的将NLRP3炎性小体和登革病毒感染引起的血管渗漏症状直接的联系在了一起。首先,我们证明了登革病毒感染可以产生大量的IL-1β,接着我们证明了登革病毒的复制和蛋白合成在这个过程中发挥着重要作用。接着我们通过蛋白筛选发现了登革病毒M蛋白可以直接和NLRP3相互作用并促进了炎症小体的组装。接下来我们通过AAV-9载体系统使M蛋白在小鼠体内大量表达,发现其通过上调器官中的IL-1β水平导致器官的血管通透性发生了显著性的改变。但是当我们使用AAV9-M感染NLRP3-/-小鼠时,相比于AAV9-M感染正常小鼠,器官中的IL-1β水平显著降低,器官的血管通透性得到明显回复。最后我们使用重组IL-1β活性蛋白直接刺激正常小鼠,发现小鼠器官血管通透性发生了显著性的改变。以上实验说明了登革病毒M蛋白激活NLRP3炎性小体产生的IL-1β在诱导血管渗漏过程中发挥了直接的作用。登革病毒的NS1蛋白可以直接诱导血管内皮细胞通透性的改变从而导致血管渗漏,之前的研究发现NS1蛋白一方面可以作为PAMP通过TLR4导致炎症因子的释放从而来破坏内皮细胞的完整性从而导致血管渗漏,另一方面NS1蛋白可以通过破坏细胞表面的多糖蛋白复合物来导致血管通透性的改变。因为NS1蛋白本身不具备这种破坏作用,所以其中具体的分子机制还不是很清楚。在接下来的研究中,我们首先发现了登革病毒感染免疫细胞促进了MMP-9的产生,接着我们发现登革病毒的NS1蛋白可以通过激活NF-κB信号通路促进MMP-9的分泌,进一步研究发现NS1蛋白可以通过和MMP-9的相互作用,从而把免疫细胞中的MMP-9招募到内皮细胞中,从而破坏内皮细胞间的交联分子来导致内皮细胞通透性的改变。最后通过MMP9-/-小鼠实验,我们进一步证明了MMP9在NS1诱导血管通透性方面的重要作用。综上所述,我们揭示了NS1通过招募MMP-9来破坏内皮细胞间的交联从而诱导血管渗漏的一个新机制。综上所述,我们的研究通过不同的方向阐明了登革病毒感染诱导血管渗漏的具体分子机制,从而为治疗登革病毒感染引起的DHF/DHS症状提供了新的治疗策略和研究靶点。

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中文摘要

Abstract

第一章研究背景

1.1 登革病毒概述

1.1.1 登革病毒的流行病毒学

1.1.2 登革病毒的分子病毒学

1.1.3 登革病毒的临床症状和致病机制

1.1.4 登革的早期诊断和治疗

1.1.5 登革疫苗的研发和展望

1.2 炎性小体概述

1.2.1 NLRP1 炎性小体

1.2.2 NLRC4 炎性小体

1.2.3 AIM2 炎性小体

1.2.4 NLRP3 炎性小体

1.2.5 非经典的炎性小体

第二章实验材料和实验方法

2.1 实验材料

2.1.1 病毒

2.1.2 细胞系、细胞培养和细胞因子

2.1.3 抗体

2.1.4 表达载体

2.1.5 生化试剂

2.1.6 核酸操作及检测试剂盒

2.1.7 实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 登革病毒的扩增和检测

2.2.2 细胞系培养和转染实验

2.2.3 THP-1 细胞刺激分化为巨噬细胞

2.2.4 克隆构建

2.2.5 RNA提取和qRT-PCR实验

2.2.6 Western-blot

2.2.7 免疫共沉淀实验（CO-IP）

2.2.8 GST pull-down实验

2.2.9 免疫荧光实验

2.2.10 ASC多聚化检测

2.2.11 HEK293T体外构建NLRP3 炎性小体体系

2.2.12 MMP-9 明胶酶活检测

2.2.13 跨内皮细胞电阻检测（TEER）

2.2.14 小鼠器官血管渗漏检测

2.2.15 酶联免疫吸附实验（ELISA）

第三章登革病毒M蛋白通过激活NLRP3 炎性小体诱导血管渗漏机制的研究

3.1 研究背景与立项依据概述

3.2 实验结果

3.2.1 登革病毒通过激活NLRP3 炎性小体来诱导IL-1β的分泌

3.2.2 登革病毒M蛋白通过和NLRP3 相互作用促进NLRP3 炎性小体的组装

3.2.3 登革病毒通过上调器官中的IL-1β水平来诱导小鼠器官中的血管渗漏

3.2.4 登革病毒M蛋白通过激活NLRP3 炎性小体诱导小鼠器官中的血管渗漏

3.2.5 IL-1β可以直接诱导小鼠器官中的血管渗漏的发生

3.3 本章小结和讨论

第四章登革病毒NS1 蛋白通过招募MMP-9 蛋白诱导血管渗漏机制的研究

4.1 研究背景与立项依据概述

4.2 实验结果

4.2.1 登革病毒感染诱导MMP-9 的产生和分泌

4.2.2 登革病毒NS1 蛋白可以和MMP-9 相互作用

4.2.3 登革病毒NS1 蛋白通过激活NF-κB信号通路来促进MMP-9 的分泌

4.2.4 登革病毒NS1 蛋白通过招募MMP-9 蛋白来诱导内皮细胞通透性改变

4.2.5 登革病毒NS1 蛋白通过招募MMP-9 蛋白来破坏内皮细胞间的交联

4.2.6 登革病毒NS1 蛋白促进MMP-9 和交联分子的相互作用

4.2.7 MMP-9 蛋白在NS1 诱导小鼠血管渗漏过程中发挥重要作用

4.3 本章小结和讨论

参考文献

博士期间发表和待发表的论文

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 潘攀

导师: 吴建国

关键词: 登革病毒,蛋白,炎性小体,血管渗漏,细胞交联分子

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 武汉大学

分类号: R373.33

DOI: 10.27379/d.cnki.gwhdu.2019.000077

总页数: 131

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