导读:本文包含了人源抗体片段论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:Siglec-9,Fab片段,抗Siglec-9抗体,THP-1细胞
人源抗体片段论文文献综述
褚萨萨,尤娜,张馨,杨志国,朱进[1]（2018）在《人源化抗Siglec-9抗体Fab片段的制备及鉴定》一文中研究指出目的:构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达质粒,表达、纯化此抗体以及特性分析,并初步探讨此抗体的生物学功能。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)分别获得抗体轻链和重链的可变区及恒定区,经重迭延伸PCR连接,酶切后与原核表达载体p ETDUET-1重组,转入表达感受态Escherichia coli BL21中,通过蛋白纯化系统AKTA和His-trap Lambda Fab纯化。使用SDS-PAGE、ELISA以及Western blot鉴定和分析。采用实时荧光定量PCR初步检测抗Siglec-9抗体Fab段对炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量的影响。结果:成功获得抗体轻链和重链,构建人源化抗Siglec-9抗体Fab段原核表达系统,经SDS-PAGE、Western blot、ELISA检测证实抗Siglec-9抗体Fab段与Siglec-9抗原特异性结合。抗Siglec-9抗体Fab段可抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8的mRNA表达量。结论:人源化抗Siglec-9抗体Fab段进行了原核系统表达、纯化和鉴定,并初步验证可抑制炎性细胞因子的mRNA表达量,为进一步研究该抗体的生物学特性及应用奠定基础。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2018年06期）
蔡炳冈[2]（2016）在《人源抗TLR4抗体Fab片段抑制内毒素（LPS）引起的炎症反应的体内及体外研究》一文中研究指出Toll样受体4(TLR4)是Toll受体家族中发现最早并研究最深的模式识别受体,在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要识别内毒素(LPS),激活其信号通路,引起急性炎症、败血症、慢性感染性疾病等。TLR4是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤,是整个内毒素信号转导通路的枢纽,阻断TLR4对内毒素信号的传导,是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。因此,研究与开发治疗性抗TLR4基因工程抗体,应用于G-细菌感染性疾病和感染性休克的治疗,有望能够迅速阻断病情发展、挽救患者的生命。在我们前期研究中,利用嵌合抗体技术,针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段,利用重迭延伸法扩增Fab片段基因,成功的构建了质粒,表达出抗TLR4抗体Fab片段,并命名为h TLR4-Fab04。在本研究中,我们主要通过建立细不同种系细胞及动物炎症模型,在体内外验证抗TLR4抗体Fab片段对LPS引起的炎症反应的抑制情况。研究方法1.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。2.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。3.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。4.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。5.利用小鼠内毒素休克模型观察h TLR4-Fab04在体内炎症反应的抑制情况。将h TLR4-Fab04和对照抗体腹腔注射C57BL/6J小鼠,观察h TLR4-Fab04对内毒素休克小鼠血清细胞因子的变化情况。研究结果1.h TLR4-Fab04与人外周血来源的巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率高达90%,与鼠源巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率达到60%左右。2.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04均可从m RNA水平和蛋白水平抑制炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)的表达。抑制效率都可以达到50%左右。3.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04对TLR4信号通路下游的MAPKs(JNK、ERK、p38)、NF-κB(IKK、IκB、p65)和IRF-3磷酸化水平均有不同程度的抑制。4.在动物细胞模型中,不同浓度的hTLR4-Fab04均显示出对小鼠血清中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)有一定的抑制效果,当h TLR4-Fab04浓度为2mg/kg时,对四种炎症因子抑制效率最佳,抑制率均可达50%左右。结论本研究验证了h TLR4-Fab04可以与不同来源的细胞表面TLR4分子结合。在体外和体内实验中,h TLR4-Fab04均显示出对内毒素(LPS)引起的炎症反应有抑制效果。本研究为h TLR4-FTLR4在临床实验中提供了实验基础。同时,也为治疗SIRS等内毒素感染引起的疾病提供了一种新的方法。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2016-03-01）
郑文凯[3]（2015）在《人源抗hTLR4基因工程抗体Fab片段的制备及生物特性鉴定》一文中研究指出TLR4受体是一种模式识别受体,在对TLR4的研究中发现,TLR4在LPS介导的严重反应中起着关键的调节作用。TLR4通过依赖MyD88途径或不依赖MyD88途径调节LPS在细胞内的信号传导,从而控制内毒素发挥生物学效应。阻断TLR4介导的内毒素信号向细胞内的传导,是减轻内毒素生物学效应的有效的方法。本课题在上一阶段的研究中成功制备出了鼠抗人TLR4单克隆抗体,体外活性检测显示其能显着抑制经LPS刺激TNF‐α的产生。但鼠源单克隆抗体在人体治疗中易出现人抗鼠抗体(HAMA)反应。嵌合抗体技术是将人源抗体恒定区替代鼠抗体的恒定区,构建人鼠嵌合抗体,不仅可以保留亲本抗体的高亲和力,而且大大降低鼠单克隆抗体在人体应用中的免疫原性。本研究在嵌合抗体技术的基础上,针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段基因,利用重迭延伸法扩增Fab片段基因,构建表达质粒并转化大肠杆菌,探索其原核表达,以期获得有效的抗TLR4抗体Fab片段。研究方法:1.制备人源抗TLR4抗体Fab片段利用PCR技术从本课题上一阶段筛选的阳性噬菌体中扩增抗体重链可变区VH和轻链可变区VL基因,采用重迭扩展延伸法成功将人源抗体恒定区重链与轻链分别与噬菌体扩增的可变区重链和轻链拼接,获得重组重链Fd和轻链;进一步构建重组质粒pETDuetTM‐1‐Fab;转化大肠杆菌BL21诱导表达,获得高纯度的人源抗TLR4抗体Fab片段。2.鉴定Fab抗体与抗原的相互作用及测定抗体亲和常数采用流式细胞仪及BiacoreX100仪分别检测抗TLR4抗体Fab片段特异性识别TLR4抗原的能力及抗体的亲和力。3.抗体体外中和试验体外中和实验检测抗TLR4抗体Fab片段对炎症因子TNF‐α的中和作用。研究结果：1.成功扩增获得重组重链Fd和轻链DNA片段;构建重组原核表达质粒pETDuetT‐1‐Fab;转入大肠杆菌诱导表达后,亲和纯化获得高纯度的抗TLR4抗体Fab片段。2.ELISA及流式细胞仪检测结果显示,本研究中所制备的抗体能够与hTLR4特异性结合。3.本研究中所制备的抗TLR4抗体Fab片段亲和常数为1.619*10‐7。4.人源抗TLR4抗体Fab片段在体外可有效的保护细胞,中和肿瘤坏死因子TNF‐α。结论:本研究成功制备人源抗TLR4抗体Fab片段,该抗体可与hTLR4特异性结合,亲和力较高,在体外可有效中和肿瘤坏死因子TNF‐α,保护细胞。表明通过基因工程获得了人源单克隆抗体,为抗TLR4抗体的进一步研究和应用打下了坚实的基础,可能为炎症相关性疾病的治疗提供了一种新的预防和治疗生物制剂。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2015-03-01）
冉苇[4]（2014）在《人源抗人IgE工程抗体Fab片段的功能研究》一文中研究指出目的：哮喘是一种由IgE介导的I型变态反应,主要特征是变应原初次进入机体诱导特异性B淋巴细胞产生IgE抗体,其Fc段与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体FcεRI结合,使机体处于对该变应原的致敏状态；当相同的变应原再次进入体内,与细胞表面受体结合型IgE结合引起表面交联,使细胞活化,释放大量生物活性介质,从而引起平滑肌收缩、腺体分泌增强等一系列过敏症状。基于IgE在哮喘疾病中的重要作用,人们一直试图通过阻断IgE与FcεRI的结合从而阻断哮喘的发生和发展。其原理是通过抗IgE抗体高度特异性地结合游离的IgE,阻断IgE与效应细胞膜表面受体作用,阻止效应细胞脱颗粒,从而达到治疗哮喘患者的目的。因此,阻止IgE分子与效应细胞表面的高亲和力受体FcεRI结合的相关药物的研究成为哮喘和过敏性疾病药物研究的热点。鉴于IgE与FcεRI的相互作用等同于IgE Fc片段(Cε3-Cε4)与FcεRI的相互作用,本实验室前期尝试采用重组人IgE C3-C4替代完整的IgE分子对抗体库进行筛选。使用300位健康志愿者的外周血淋巴细胞,建立了9×107库容的人免疫球蛋白G基因文库,同时合成了重组人IgE C3-C4蛋白,用其代替完整的IgE分子对抗体库进行筛选,成功筛选到可与IgE C3-C4特异性反应的抗IgE特异性人源抗体Fab片段,命名为lib-8。本研究旨在建立产生高水平IgE哮喘小鼠动物模型,为后期体内试验探索哮喘抗IgE抗体治疗的研究奠定基础；体、内外试验研究验证lib-8的功能和生物学活性,为后期的临床前和临床实验奠定基础；通过对lib-8叁维结构的预测,探索并验证lib-8与IgE抗体的具体结合位点。方法：1.以最常见的致敏原——粉尘螨提取液致敏和激发6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,模拟尘螨诱发产生高水平IgE的哮喘发病模型,为探索抗IgE抗体在哮喘治疗中的机理研究奠定基础。2.采用RosettaAntibody同源建模的方法构建了lib-8可变区的分子模型,对其结构进行预测。并利用分子对接的方法,将IgEC3-C4抗原与lib-8抗体进行了抗原-抗体RosettaDock分子对接,预测该抗体与IgE C3-C4抗原可能的相互作用的表位。用PCR的方法从实验室前期制备的IgEC3-C4-pET-19b表达质粒中分别获得人IgEC3, IgEC4, IgEC4-link基因,与原核表达载体pET-19b连接得到表达质粒并在大肠杆菌BL21 (DE3)star pLysS中大量表达并纯化,这些蛋白均以包涵体形式收获,参照Novagen公司的Protein RefoldingKit处理、以谷胱甘肽氧化还原系统进行复性重构,获得纯化的IgEC3, IgEC4, IgEC4-link蛋白。然后使用ELISA、免疫印迹试验(Western blotting)验证lib-8与IgE抗体的具体结合部位。3.体内试验——哮喘动物模型,以粉尘螨提取液为过敏原致敏和激发6-8周龄C57BL/6雌性小鼠,lib-8100μg/次连续腹腔注射治疗5天,第6天腹腔注射300μg治疗,验证lib-8对哮喘模型小鼠中的血清游离IgE的抑制作用。4.体外试验——P815小鼠肥大细胞脱颗粒模型,分别以小鼠anti-DNP-IgE致敏和DNP-BSA激发P815 细胞, 以4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide为底物进行荧光检测β-hexosaminidase释放率,验证lib-8抑制肥大细胞脱颗粒情况。结果：1.成功制备了高水平IgE哮喘小鼠动物模型,具有较高滴度的血清总IgE和重组二类粉尘螨变应原特异性IgE(rDer f2-sIgE)水平,为哮喘抗IgE抗体治疗的研究提供了良好的基础。具体表现为小鼠的BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞均显着增多(P<0.01)；细支气管以及伴行血管周围有明显的炎症细胞浸润；血清总IgE(P<0.001)和rDer f2-sIgE(P<0.01)水平显着升高；BALF中IL-4的水平显着增高(P<0.05),而IFN-γ的水平显著降低(P<0.01)。2.成功获得提纯的人IgE C3,IgE C4,IgE C4-link蛋白,ELISA、Western blotting验证了lib-8的结合部位是人IgECe3区域。3.体内试验验证了lib,8对哮喘具有明显的治疗作用。具体表现为与模型组相比治疗组小鼠的BALF中的细胞总数和嗜酸性粒细胞均显着减少(P<0.01)；细支气管以及伴行血管周围炎症细胞浸润减少：血清总IgE(P<0.01)和rDer f2-sIgE(P<0.05)水平显着降低；BALF中IL-4的水平显着降低(0<0.05),而IFN-γ的水平无显著差异。4.体外试验验证了lib-8可明显抑制肥大细胞P815脱颗粒,较模型组相比治疗组P815细胞释放P-Hexosaminidase明显减少(P<0.05)；光学显微镜400倍下观察治疗组P815细胞脱颗粒明显少于模型组。小结：成功建立了产生高水平IgE的小鼠哮喘动物模型；本实验室前期筛选得到的人抗人IgE工程抗体Fab片段,即lib-8,具有良好的反应性,它与IgE抗体的具体结合部位是Cε3区域。(本文来源于《复旦大学》期刊2014-04-01）
刘明华,曹宇亮,张雷,陈翔宇,向强[5]（2014）在《人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建》一文中研究指出目的构建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体文库。方法采用Trizol试剂提取尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞的总RNA,用Oligotex悖mRNA Mini Kits纯化获得总mRNA,逆转录合成总cDNA,针对人抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物,以合成的总cDNA为模板,扩增得到抗体轻链和重链可变区基因库,再通过重迭延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)将轻链和重链拼接得到scFv文库;将scFv基因双酶切后,插入T7噬菌体骨架进行包装,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原进行4轮淘选,建立蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,采用噬斑法检测scFv噬菌体文库滴度并进行PCR及测序鉴定。结果成功地将轻链和重链可变区基因库混合拼接得到scFv文库;经4轮淘选,蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库滴度为6.0×1014PFU/ml,抗体基因在噬菌体中表达的阳性率达50%以上,表达的scFv片段均为轻链和重链的杂合体,可较好的重现可变区的多样性。结论已成功构建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,为下一步噬菌体文库的克隆构建和筛选奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2014年01期）
王小英[6]（2012）在《人源抗Trop-2抗体Fab片段在胰腺癌靶向治疗中的应用》一文中研究指出胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤,病死率逾90%,肿瘤无法切除患者的中位生存期仅6个月。全世界每年约有20万人死于此病,且发病率有逐年增高的趋势。外科手术是目前能够根治胰腺癌的唯一手段,但因早期症状不明显,多数患者在确诊时已至中晚期,可获根治性切除者仅10%～15%,术后5年生存率仅1%～3%,复发率近80%,肿瘤的局部复发是胰腺癌术后治疗失败的主要原因。因此,需要采取综合治疗手段包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、支持治疗等延长患者的生存时间,减轻临床症状,提高生活质量。尽管传统的化疗药物,提高了患者的生存时间,但是肿瘤细胞的耐药和各种急慢性毒副作用严重限制了其临床应用。分子靶向治疗是通过靶向肿瘤细胞表面特异性分子的配体与药物、放射性核素或生物毒素等偶联,靶向性杀伤肿瘤细胞。由于作用靶位明确,药物通常具有很高的选择性,可以有效的杀伤或抑制靶细胞,而对正常组织细胞不产生或仅产生较小的毒副作用。因此,分子靶向药物的研制已成为肿瘤临床研究的热点。人滋养层细胞表面抗原2(]human trophoblast cell surface antigen2, Trop-2)是一种细胞表面糖蛋白,属于TACSTD基因家族,它在正常组织低表达或不表达,而在多种上皮癌过表达,如乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等。临床资料表明,Trop-2的表达水平和肿瘤的侵袭性和转移性呈正相关,而与病人的预后呈负相关。Trop-2不仅与细胞内钙离子浓度和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)以及磷酸激酶C的(PKC)调控有关,同时还可能激活ERK途径,从而调节肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。最新研究表明,Trop-2还具有肿瘤干细胞特性。因此,Trop-2可作为许多恶性肿瘤早期诊断及靶向治疗的候选分子。全分子抗体因分子量较大,其组织穿透能力较差,在血液和非瘤组织的清除速度较慢,从而导致相对较低的T/NT比值,而Fab由于没有Fc段,分子量为50Kd,是完整IgG的1/3,具有较好的穿透性和药代动力学特征,且能较好地保持结合抗原的活性,因此成为应用较多的一种基因工程抗体类型。Fab不能与细胞的Fc受体结合,从而减少了非特异性结合；由于没有Fc调节IgG的分解代谢,在体内半衰期短、周转快,有利于放射免疫成像检查肿瘤。和完整抗体相比,Fab没有抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC),可以作为载体分子用于疾病的影像诊断和靶向治疗。本研究利用课题组前期研究结果,将噬菌体抗体库中筛选出的抗Trop-2Fab基因的载体转化大肠杆菌,逐步优化表达和纯化条件,制备纯度较高的特异性的抗Trop-2抗体Fab片段；在分析抗Trop-2Fab抗体免疫学特性的基础上,在细胞水平评价其对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；将抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素(DOX)偶联,评价其偶联前后对胰腺癌细胞的抑制作用。研究目的：1.建立人源抗Trop-2抗体Fab片段在大肠杆菌中表达的方法,优化蛋白表达及纯化的条件；2.抗Trop-2抗体Fab片段的免疫学特性的分析；3.在细胞水平上观察人源抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞增殖、侵袭与迁移的影响及相关的分子机制探讨；4.抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素的偶联,药物偶联后抗体的特性分析；5.比较抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联前后对胰腺癌细胞生物学特性的影响。研究方法：1.将抗Trop-2Fab抗体的表达载体转化宿主菌E.coli. TOP10F',比较诱导前培养液更换对抗Trop-2Fab片段表达量的影响；比较不同诱导温度、诱导时间及诱导前加入葡萄糖对蛋白表达的影响；大量表达的抗Trop-2Fab经亲和层析纯化后,分别用免疫荧光和流式细胞术检测其免疫学特性。2.用MTT法检测抗Trop-2抗体Fab片段对两株胰腺癌细胞增殖的影响,根据实验结果,选择一种细胞系作为后续实验研究对象。利用伤口愈合实验,测定抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞迁移能力的影响；用Transewell法检测抗Trop-2抗体Fab片段对胰腺癌细胞侵袭能力的影响；3.通过化学合成法将抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联,用ELISA和直接免疫荧光分析偶联物(DOX-anti-Trop-2Fab)中抗体的特异性；用直接免疫荧光法观察DOX-anti-Trop-2Fab在胰腺癌细胞内的转运过程；4.用MTT法检测抗Trop-2抗体Fab片段及药物偶联抗体对胰腺癌细胞增殖的影响。研究结果：1.在培养液中加入5g/L的葡萄糖,人源抗Trop-2抗体Fab片段的表达量明显增加；16℃的诱导温度比其它温度能表达更多的Fab分子；加诱导剂诱导12小时,目的蛋白的表达量至峰值。FACS检测结果显示,抗Trop-2抗体Fab片段与表达Trop-2的胰腺癌细胞BxPc3的结合信号较强,而与不表达Trop-2的NIH-3T3细胞的结合信号较弱；细胞免疫荧光检测结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段能够与BxPc3细胞结合,阳性信号主要显示在细胞膜上,而阴性对照细胞NIH3T3基本没有信号。以上结果表明抗Trop-2Fab抗体片段能够特异性结合于胰腺癌细胞BxPc3的细胞膜上的天然构象Trop-2蛋白。2.MTT检测结果表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制人胰腺癌细胞的生长；伤口愈合实验表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制胰腺癌细胞的迁移；Transewell实验结果表明,人源抗Trop-2抗体Fab片段能够抑制胰腺癌细胞的侵袭。但是抗Trop-2抗体Fab片段只有在200ug/ml-400ug/ml的高浓度下,才能明显抑制胰腺癌细胞的增殖。3. ELISA结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段药物偶联后的抗原结合能力无明显改变；细胞免疫荧光和FACS检测结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab能够与胰腺癌细胞结合,阳性信号主要存在于细胞膜上,而阴性对照细胞NIH3T3基本没有信号。结果表明,抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后,能够特异性结合于胰腺癌细胞膜上的天然构象Trop-2蛋白。免疫荧光观察胰腺癌细胞内的转运过程表明,DOX-anti-Trop-2Fab与阿霉素相比,DOX-anti-Trop-2Fab在细胞内的转运虽有一定的滞后性,但4小时后,细胞内的阳性信号无明显区别。4.体外实验结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab对胰腺癌有明显的抑制作用且优于游离抗体和阿霉素。MTT结果表明,DOX-anti-Trop-2Fab对细胞增殖的抑制在药物作用后72小时,抑制率已近90%,而相同浓度的阿霉素在相同的实验条件下对胰腺癌细胞的抑制率仅75%,游离的抗Trop-2抗体Fab为55%,这说明抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后能够有效提高抗Trop-2抗体Fab片段和阿霉素对胰腺癌细胞的抑制作用。研究结论：1.优化表达和纯化条件后抗Trop-2抗体Fab片段的纯度和产量都明显提高,且保持其免疫学特性；2.高浓度抗Trop-2Fab可抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移；3.抗Trop-2抗体Fab片段与阿霉素偶联后其结合能力和特异性无明显改变；4. DOX-anti-Trop-2Fab可明显抑制胰腺癌细胞的增殖,且疗效优于游离阿霉素。用药后72小时,DOX-anti-Trop-2Fab对胰腺癌细胞的抑制率已近90%,而相同浓度的阿霉素对胰腺癌细胞的抑制率仅75%,游离的抗Trop-2抗体Fab的抑制率为55%。(本文来源于《南京医科大学》期刊2012-04-01）
杜晓明,方佩华,李宁[7]（2011）在《人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定》一文中研究指出目的通过对人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定,得到TRAb单克隆抗体,为进一步建立TRAb的定量分析方法及探索免疫干预治疗奠定基础。方法(1)从血清TRAb浓度大于40 U/L的自身免疫性甲状腺疾(本文来源于《中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编》期刊2011-08-24）
杜晓明,方佩华,李宁[8]（2011）在《人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定》一文中研究指出目的:Graves病患者血清中的促甲状腺素受体抗体(TRAb)分为:(1)TSH受体刺激性抗体(TSAb);(2)TSH受体刺激阻断性抗体(TSBAb);(3)中性TSH受体抗体。通过对人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定,得到TRAb单克隆抗体,为进一步建立TRAb的定量分析方法及探索免疫干预治疗奠定基础。(本文来源于《中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编》期刊2011-08-17）
郭阳[9]（2009）在《TCRγ9/δ2 CDR3δ结合肿瘤抗原的分子基础肿瘤反应性TCRγ9/δ2移植的人源化抗体/抗体片段的抗肿瘤作用研究》一文中研究指出尽管T细胞受体(TCR)Vδ2 T细胞仅占外周血T细胞的2～5%,然而其显着的抗肿瘤作用却一直备受关注。研究表明,Vδ2 T细胞在体内外对多种肿瘤细胞都具有显着的杀伤活性。近年来,我们实验室对TCRγ9/δ2识别的肿瘤抗原配体及其识别肿瘤抗原的分子机制开展了较系统深入的研究,并取得了一些学术成果。本实验室在前期工作中获得了一个卵巢癌反应性的TCR CDR38序列,命名为OT3。通过人工合成的OT3肽与靶细胞、靶组织的结合实验,我们证明了CDR3δ是TCRγ9/δ2与肿瘤抗原结合的关键部位。为了阐明CDR3δ与肿瘤抗原结合的分子基础,曾将OT3肽的V、D和J区随机突变,比较了其与突变体与肿瘤抗原结合的变化,结果发现CDR3δ的侧翼序列在TCRγ9/δ2与肿瘤抗原结合中起关键作用。本研究第一部分工作为了在叁维构象水平进一步验证这一结果,我们建立了体外真核表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台,并表达了TCRγ9/δ2(OT3)-Fc及其CDR3δOT3的V、D和J区随机突变的叁个突变体蛋白γ9/δ2(OT3)Vm-Fc、TCRγ9/δ2(OT3)Dm-Fc和TCRγ9/δ2(OT3)Jm-Fc,从而将CDR3δ放在一个完整的TCR结构中。在体外,通过流式细胞术、激光共聚焦扫描显微镜技术、免疫组化和ELISA的方法研究了TCRγ9/δ2(OT3)-Fc及其突变体与肿瘤细胞、组织和抗原的结合情况。结果显示当V区和J区突变(Vm和Jm)后,TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤细胞和组织的结合活性明显下降,而D区(Dm)突变下降的并不明显。这一结果与我们实验室前期结果一致。我们进一步证实了,CDR3δ的侧翼序列是TCRγ9/δ2与肿瘤抗原结合的关键区域这一推论。此外我们建立了利用昆虫杆状病毒表达系统表达TCRγ9/δ2-Fc融合蛋白技术平台,并表达纯化了TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和其点突变融合蛋白TCRγ9/δ2(OT3)CA-Fc和TCRγ9/δ2(OT3)LA-Fc。通过激光共聚焦扫描显微镜技术和ELISA的方法检测了各融合蛋白与肿瘤细胞和抗原的结合情况,结果显示,当V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)突变后,融合蛋白与靶细胞和靶抗原的结合活性明显下降,这一结果提示我们,V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)可能为TCRγ9/δ2(OT3)与肿瘤结合的关键点。根据TCRγ9/δ2可以识别多种肿瘤这一特点,结合目前抗体靶向治疗肿瘤所面临的靶向特异性有待进一步揭示的问题,我们提出了一个肿瘤靶向治疗的创新性策略:即将人类TCRγδ识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中。基于这一策略,在本研究工作的第二部分,我们根据不同需要设计并表达了叁种肿瘤反应性TCRγ9/δ2移植的人源化抗体/抗体片段,分别为TCRγ9/δ2(OT3)-Fc、TCRVδ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ。通过流式细胞术、confocal、免疫组化和ELISA等方法,比较了叁种抗体/抗体片段与肿瘤细胞、组织和蛋白的结合活性。结果显示,TCRγ9/δ2(OT3)-Fc与肿瘤抗原的结合活性最强,TCRVδ2(OT3)-Fc次之,TCRVδ2(OT3)H/Vγ9Lλ与肿瘤抗原的结合活性最弱。继而,通过放射性同位素标记技术,对TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和TCRVδ2(OT3)-Fc进行~(99m)Tc标记,并且观察了~(99m)Tc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc和~(99m)Tc-TCRVδ2(OT3)-Fc在荷SKOV3瘤裸鼠体内显像和分布情况。体内外的实验结果显示,在这叁种抗体/抗体片段中,TCRγ9/δ2(OT3)-Fc抗体片段比较适于肿瘤的靶向治疗。最后,我们进一步观察了这种新型移植性抗体片段TCRγ9/δ2(OT3)-Fc抗肿瘤效果。体外实验显示,TCRγ9/δ2(OT3)-Fc的加入可以增强中性粒细胞对SKOV3和Daudi的杀伤作用;SKOV3荷瘤裸鼠治疗实验显示,与PBS组相比,瘤周注射TCRγ9/δ2(OT3)-Fc组和TCRγ9/δ2(OT3)-Fc加中性粒细胞组,都明显抑制肿瘤的生长。综上,本研究初步论证了TCRγδ移植性抗体用于肿瘤靶向治疗的可行性,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的线索和基础。综合两部分的实验结果,可以得到以下结论:1.CDR3δ的侧翼序列是TCR与肿瘤抗原结合的关键区域。2.CDR3δ序列中V区的半胱氨酸(C)和J区的亮氨酸(L)可能为TCRγ9/δ2(OT3)结合肿瘤抗原的关键点。3.肿瘤反应性TCRγ9/δ2(OT3)移植的人源化抗体片段TCRγ9/δ2(OT3)-Fc在体内外具有较好的抗肿瘤作用。肿瘤反应性TCRγδ移植的人源化抗体/抗体片段可以成为肿瘤靶向治疗的新策略。(本文来源于《中国协和医科大学》期刊2009-06-01）
朱宏斌[10]（2009）在《HAb18G/CD147人源化抗体片段（HAb18-huScFv）_2-Fc的制备及其体外抗肿瘤效应的研究》一文中研究指出肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,居我国恶性肿瘤死亡率的第二位。迄今为止,外科手术治疗仍是目前肝癌治疗的首选方法,但手术切除存在的突出问题是切除率低,复发率高;据统计,肝癌根治性切除术后5年复发率高达80%,小肝癌术后复发率也达40%～60%。由于肝癌手术切除率低于15%,介入化疗也只有10%的有效率,因此,发展肝癌新的治疗手段和药物对于保障我国人民健康具有十分重要的意义。由我室自主研发的抗癌药物Licartin是全球首个用于治疗肝癌的单抗类药物,用放射性核素碘[~(131)I]标记美妥昔单抗(单抗HAb18的F(ab’)2段,靶点为肝癌相关膜分子HAb18G/CD147)而得,该药可显着抑制HCC临床进展、抑制晚期HCC患者肝移植术后的肿瘤复发转移率,并显着延长患者生存期,已被证明是治疗HCC的安全有效的药物。但是该药目前仍存在生产成本高,临床使用中少数病例出现了HAMA反应即潜在的免疫原性,同时由于缺少抗体的Fc,因此也没有天然抗体所能介导的生物学功能。因此,我们有必要在其基础上研发新一代的抗体类药物。本研究将以单抗HAb18为基础,首先对该单抗的可变区进行人源化改造,获得新的抗体片段HAb18-huScFv,之后与人IgG1 Fc融合表达得到双价的人源化抗体片段(HAb18-huScFv)_2-Fc,最后在体外验证该抗体片段的抗肿瘤活性,以期获得具有较好抗肿瘤活性的二代工程抗体分子。下面将从两部分分别进行阐述。第一部分: (HAb18-huScFv)_2-Fc的构建和表达目的:获得(HAb18-huScFv)_2-Fc蛋白方法:首先通过对鼠源性肝癌单抗HAb18的抗体可变区序列分析,并同Genbank的nr库做BlastP,其中抗体序列来源分别选择Homo sapiens和Mus musculus两类。对相似性得分最高的人源、鼠源抗体可变区序列各100条进行统计,获得单抗HAb18的差异残基和异常残基;之后通过模建抗体可变区的精确叁维模型,获得HAb18 VH、VL的分子内和分子间氢键相互作用,以及相对表面可及性,综合考虑残基的相对保守性,最终确定进行人源化改造的候选突变位点。以HAb18-ScFv基因为模板,用点突变PCR的方法获得其人源化形式HAb18-huScFv的序列,克隆至表达载体获得pCDNA5/FRT-(HAb18-huScFv)_2-Fc,将表达载体用脂质体转染到真核细胞Flp-in CHO中,加压、筛选以获得稳定表达株。进行常规细胞培养并收集上清,用HiTrap MabSelect SuRe和HiTrap chelating HP column对稳定表达株的培养上清进行连续纯化,采用间接ELISA, SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测。同步构建其鼠源形式(HAb18-ScFv)_2-Fc以作为平行对照,所有相关实验与(HAb18-huScFv)_2-Fc相同。结果:按照Kabat、Abm、Chothia和Contact的规则标出了肝癌单抗HAb18 CDR,FR;经过筛选的抗体序列经过分析,获得了已有抗体分子不同位点上氨基酸种类和百分比,将该结果和单抗HAb18的可变区氨基酸比对后,获得了该序列的差异残基和异常残基;结合叁维重建模型,获得了HAb18 VH、VL分子内和分子间氢键相互作用和氨基酸表面可及性,确定人源化方法为残基H19K, H90A和L10F分别突变为H19A, H90T, L10S。重迭PCR合成突变的基因后,测序验证基因序列正确,将突变后的基因克隆至表达载体,再次测序验证正确。转染真核细胞进行表达,加压筛选并克隆化,获得稳定表达的细胞株。色谱柱纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:在非还原状态下,目标蛋白的分子量约为110kDa;还原后为一条带,分子量约为55kDa。其鼠源形式片段的分子量与之一致。因此,以上数据表明已经成功表达并制备了(HAb18-huScFv)_2-Fc蛋白。第二部分:(HAb18-huScFv)_2-Fc的生物学特性鉴定目的:验证(HAb18-huScFv)_2-Fc的抗原结合活性,体外抗肿瘤活性和免疫原性。方法:间接竞争ELISA分析与HAb18G/CD147的结合活性,用不同浓度的(HAb18-huScFv)_2-Fc与亲本抗体HAb18竞争结合包被的HAb18G/CD147,分析结合的亲和力和特异性;用表面等离子共振技术分别检测(HAb18-huScFv)_2-Fc和(HAb18-ScFv)_2-Fc的结合常数(Kon)和解离常数Koff,并计算其亲和力常数(KD);用细胞免疫荧光及免疫组化法在不同水平上分析并比较(HAb18-huScFv)_2-Fc和(HAb18-ScFv)_2-Fc与肝癌细胞FHCC-98和HCC组织的结合特性。在明胶酶谱试验中,用两种抗体分别处理共培养的人肺成纤维细胞(HPF-1)和人肝癌细胞(FHCC-98),并与空白对照组进行比较。在侵袭试验中,将FHCC-98细胞与人肺成纤维细胞等比例混合加入小室,用两种抗体处理后观察其侵袭活性的变化。ADCC和CDC试验分别观察在(HAb18-huScFv)_2-Fc的介导下,PBMC和兔血清对肝癌细胞FHCC-98的细胞毒效应。检测抗体的免疫原性时,将抗HAb18抗体阳性病人的血清先经过与HAb18识别CD147不同表位的单抗5A5的预吸附(pre-absorption),以除去其中的游离CD147,抗同种型抗体和抗同种异性抗体,再将不同浓度的(HAb18-huScFv)_2-Fc和(HAb18-ScFv)_2-Fc分别与HAb18-F(ab’)2混合,去竞争结合处理后的血清中的抗独特型抗体,用间接竞争ELISA法测得两种抗体对每份血清的的50%抑制浓度(IC50),通过研究它们对HAb18-F(ab’)2与患者血清中抗独特型抗体的结合的抑制能力的差异,分析其免疫原性的差异。结果:(HAb18-huScFv)_2-Fc可以与HAb18竞争结合分子HAb18G/CD147的同一表位, (HAb18-huScFv)_2-Fc和(HAb18-ScFv)_2-Fc对肝癌细胞和肝癌组织的结合能力及特点相差不大(前者亲和力常数(KD)为1.5×10~(-9)M,后者为1.2×10~(-9)M)。与对照组相比,两种抗体片段均可以抑制肝癌细胞FHCC-98分泌基质金属蛋白酶并抑制肿瘤细胞的侵袭活性(p<0.05),且在两种抗体之间没有明显差异。(HAb18-huScFv)_2-Fc对靶细胞具有细胞毒效应(p<0.05),且呈剂量依赖关系。抗体片段的免疫原性有明显的降低,在四份试验血清中,两种抗体的IC50值差异均有显着性,其P值分别为p=0.0440,p<0.0001,p=0.0338,p<0.0001。结论:经过改造优化的人源化抗体片段(HAb18-huScFv)_2-Fc在降低了抗体免疫原性的同时,保留了抗原结合活性,并且具有细胞毒效应和肿瘤抑制活性,是一种很有应用前景的抗体形式。(本文来源于《第四军医大学》期刊2009-04-01）
人源抗体片段论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
Toll样受体4(TLR4)是Toll受体家族中发现最早并研究最深的模式识别受体,在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要识别内毒素(LPS),激活其信号通路,引起急性炎症、败血症、慢性感染性疾病等。TLR4是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤,是整个内毒素信号转导通路的枢纽,阻断TLR4对内毒素信号的传导,是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。因此,研究与开发治疗性抗TLR4基因工程抗体,应用于G-细菌感染性疾病和感染性休克的治疗,有望能够迅速阻断病情发展、挽救患者的生命。在我们前期研究中,利用嵌合抗体技术,针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段,利用重迭延伸法扩增Fab片段基因,成功的构建了质粒,表达出抗TLR4抗体Fab片段,并命名为h TLR4-Fab04。在本研究中,我们主要通过建立细不同种系细胞及动物炎症模型,在体内外验证抗TLR4抗体Fab片段对LPS引起的炎症反应的抑制情况。研究方法1.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。2.分析h TLR4-Fab04是否结合小鼠树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。3.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的巨噬细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。4.分析h TLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的树突状细胞表面TLR4分子,探讨h TLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后,Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在m RNA和蛋白水平的表达改变情况,观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。5.利用小鼠内毒素休克模型观察h TLR4-Fab04在体内炎症反应的抑制情况。将h TLR4-Fab04和对照抗体腹腔注射C57BL/6J小鼠,观察h TLR4-Fab04对内毒素休克小鼠血清细胞因子的变化情况。研究结果1.h TLR4-Fab04与人外周血来源的巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率高达90%,与鼠源巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率达到60%左右。2.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04均可从m RNA水平和蛋白水平抑制炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)的表达。抑制效率都可以达到50%左右。3.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中,h TLR4-Fab04对TLR4信号通路下游的MAPKs(JNK、ERK、p38)、NF-κB(IKK、IκB、p65)和IRF-3磷酸化水平均有不同程度的抑制。4.在动物细胞模型中,不同浓度的hTLR4-Fab04均显示出对小鼠血清中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β)有一定的抑制效果,当h TLR4-Fab04浓度为2mg/kg时,对四种炎症因子抑制效率最佳,抑制率均可达50%左右。结论本研究验证了h TLR4-Fab04可以与不同来源的细胞表面TLR4分子结合。在体外和体内实验中,h TLR4-Fab04均显示出对内毒素(LPS)引起的炎症反应有抑制效果。本研究为h TLR4-FTLR4在临床实验中提供了实验基础。同时,也为治疗SIRS等内毒素感染引起的疾病提供了一种新的方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
人源抗体片段论文参考文献
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[10].朱宏斌.HAb18G/CD147人源化抗体片段（HAb18-huScFv）_2-Fc的制备及其体外抗肿瘤效应的研究[D].第四军医大学.2009
标签：Siglec-9; Fab片段; 抗Siglec-9抗体; THP-1细胞;