基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的SCN1A-K0模型的RNA-seq分析

论文摘要

目的本次研究主要利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在体外建立SCN1A基因稳定敲除的细胞系并采用RNA-seq分析细胞的基因表达谱的变化。通过检测mRNA水平的变化分析SCN1A与DS发病之间的关联,并希望为Dravet综合症的治疗提供一些线索。方法①根据SCN1A启动子区序列设计sgRNA,并构建CRISPR/Cas9敲除质粒（pX459-SCN1A）。②将pX459-SCN1A质粒转染到N2a细胞系中,采用T7核酸内切酶I（T7E1）验证质粒活性。③将pX459-SCN1A质粒转染至HT22细胞系内,并构建单克隆细胞系。采用Western-Blot、QPCR检测SCN1A敲除效果。④选取SCN1A敲除效率最高的一组细胞系作为SCN1A-KO组,以HT22细胞系作为WT组。分别提取两组细胞系总RNA进行转录组测序分析。⑤对转录组测序原始数据进行质控、对比参考基因组并计算差异基因。将差异基因进行KEGG、GO富集以及蛋白质相互作用网络分析。选取部分差异基因进行QPCR验证。结果①对构建质粒进行测序分析显示,设计的三段sgRNA成功插入目的位点,表明质粒构建成功。②T7E1酶切验证显示,pX459-SCNlA-2转染后目的片段出现突变,表明pX459-SCN1A-2具有较强的诱导突变的活性。③采用Western-Blot、QPCR对SCN1A敲除效果进行检测,结果显示pX459-SCN1A-2/1敲除效果最高,敲除效率95%以上。④以pX459-SCN1A-2/1细胞系作为SCN1A-KO组,以WT组为对照进行转录组测序分析。结果显示,共有1861个差异基因,包括573个基因上调,1288个基因下调。⑤差异基因KEGG富集分析前5个通路包括肿瘤通路、PI3-AKT信号通路、MAPK信号通路、HTLV-1病毒、人乳头瘤病毒。差异基因GO富集分析结果显示,差异基因富集在来自RNA聚合酶II启动子的正调节转录、血管重塑、细胞质的核周区域、核质、转录调节、DNA模板化等生物过程。蛋白质相互作用网络分析结果显示,EHMT1、ACTA2、MYC在蛋白质网络中处于核心位置。另外还通过计算发现蛋白质相互作用网络中一个核心的蛋白互作集团,相关基因涉及到RNA的结合、剪接、加工等过程以及剪接复合体。⑥其它一些基因同样发生明显变化:糖酵解相关蛋白PGM2、HK2、PFKL、PFKM、PGK1、EN02等基因出现下调;钙信号通路相关基因表达量出现改变,相关基因涉及细胞钙离子稳态、钙离子转运、鸟苷酸环化酶、第二信使介导的信号传导等多个生物学过程。结论敲除SCN1A能够引起神经元的肿瘤途径、PI3K-AKT信号传导通路、MAPK信号传导通路等多种信号通路发生变化,这些基因涉及DNA的转录、翻译等多个生物过程发生改变。敲除SCN1A能够下调神经元糖酵解相关基因的表达。敲除SCN1A能够引起神经元钙离子通道相关基因表达紊乱。MYC、EHMT1、ACTA2的改变可能在DS的发病过程中发挥重要作用。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 石晓光

导师: 崔建奇

关键词: 综合征,转录组测序分析

来源: 宁夏医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 宁夏医科大学

分类号: Q78

总页数: 65

文件大小: 3409K

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