论文摘要
目的:本实验采用腺相关病毒（adeno-associated virus2/9-green fluorescence Protein,AAV2/9-GFP）通过自制微量注射系统注射到大鼠丘脑束旁核（Parafascicular nucleus,PF）或背外侧纹状体（dorsolateral striatum,DLS）经注射不同的剂量和不同的转染周数,观察病毒转染及在丘脑束旁核-纹状体通路投射情况,找出示踪试剂的最佳剂量及其转染时间。同时观察转染病毒对组织的影响。方法:wistar雄性大鼠77只,体重280-320g,实验前经行为学检测确认无异常行为。根据是否注射病毒将实验大鼠随机分为2组,分别为接种病毒的实验组（n=72只）和对照组（n=5只）。运用脑立体定位技术在DLS和PF注射不同剂量的示踪剂AAV2/9-GFP,经过不同转染时间后进行灌流取脑,将脑组织进行冰冻切片,最终得到尼氏染色的脑片标本。在激光共聚焦荧光显微镜下观察神经和脑组织,组织学位点鉴定。通过Image-Pro Plus6.0软件进行统计分析,优化参数:示踪剂平均光密度、细胞平均周长、细胞平均面积、示踪剂注射最佳作用时间、最适注射剂量、示踪剂的扩散面积。探讨注射病毒的大鼠DLS和PF细胞形态学变化。所测得数据进行统计分析,采用IBM SPSS Statistics 22.0软件,当P<0.05时考虑有统计学意义。结果:在激光共聚焦显微镜下观察经过注射AAV2/9-GFP的脑片,通过对照Paxions&Watson大鼠脑图谱对DLS和PF位点的准确位点的脑片进行分析。转染3周后在DLS和PF中均可清楚地观察到被示踪剂顺行标记的腺相关病毒,病毒注射至DLS部位时,可见投射至运动皮层、底丘脑核。病毒注射至PF时,可见投射至DLS、运动皮层、岛叶。进一步对DLS和PF核团注射病毒不同剂量以及不同时间的累计光密度值（integrated oPticdensity,IOD）变化进行了量效和时间变化统计分析,结果表明:病毒转染DLS核团的最佳作用时间和剂量为4周0.6μL。病毒转染PF核团的最佳作用时间和剂量为3周0.4μL,所有转染AAV2/9-GFP在胞体形态学上表现为由细胞膜、胞浆至胞核显影的染色特点。光镜下观察注射病毒位点发现,AAV2/9-GFP表现出对细胞有损伤的现象,表现为大鼠病毒注射的背外侧部DLS和PF的神经元形态不规则,胞体变大,有空泡出现,边界欠清晰,核仁及尼氏体模糊的特点。同时发现注射病毒位点的神经胶质细胞增多的现象。结果显示与正常大鼠相比,转染病毒大鼠的DLS和PF细胞的细胞数量减少,平均细胞面积增大,平均细胞周长增加。结论:将经过注射腺相关病毒的大鼠DLS和PF位点脑片置于激光共聚焦显微镜下可以准确定位,其荧光蛋白的显著优点标记生物分子后易于识别与检测。病毒转染DLS核团的最佳作用时间和剂量为4周0.6μL,病毒转染PF核团的最佳作用时间和剂量为3周0.4μL。在DLS和PF注射腺相关病毒对细胞具有一定程度的损伤。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 王亚楠
导师: 王敏
关键词: 腺相关病毒,示踪剂,丘脑束旁核,背外侧纹状体
来源: 山东师范大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东师范大学
分类号: Q42
总页数: 47
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