林周[1]2004年在《人TNF-α嵌合抗体体外亲和力成熟作用研究》文中研究说明本论文的创新点：通过不同试验方法体外获得亲和力提高的新型抗人TNF-α嵌合抗体，并保持抗体的中和功能不变；建立基于抗原抗体相互识别的立体结构信息预测判断抗体亲和力及抗原识别位点的新方法；尝试在计算机模建基础上，通过定点突变进一步提高抗体亲和力。人肿瘤坏死因子α(hTNFα)是一种由单核、巨噬、T淋巴、中性粒、肥大或内皮细胞分泌产生的细胞因子，可介导多种生物学活性。当hTNF-α在体内的大量产生和释放可引起机体免疫平衡失调，并可与其它炎症因子一起产生多种病理损伤，例如恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、关节强直性脊柱炎(AS)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合症(MDS)等多种疾病。因此，通过应用中和hTNF-α活性的抗体，可阻断因hTNF-α水平异常增高导致的机体病理性损伤，最终达到对疾病的有效治疗目的。美国Centocor公司研制生产的抗hTNF-α嵌合抗体(商品名Remicade(？))，美国FDA、欧盟和日本相继已批准用于RA、结肠Crohn病和AS的临床治疗。本研究组于上世纪八十年代已经制备得到抗hTNFα鼠源单克隆抗体(McAb)Zd12，具有中和hTNFα细胞毒性功能，其亲和力在Ka=8×107L／mol。在其人源化过程中，抗体的亲和力有显着地降低。本课题借助链替换(Chain Shuffling)方法，以鼠源抗体Z12为母本，通过噬菌体抗体库技术亲和筛选，借助计算机合理设计获得高亲和力嵌合抗体CH22，以期达到在保持抗体中和活性的同时显着提高抗体亲和力的目的。同时借助计算机模建得到的抗原(hTNF-α)与抗体(CH22) 相互作中文摘要用的立体结构信息，通过点突变得到新的人源化抗体，进一步提高抗体亲和力和抗体中和活性。通过以上研究，获得抗hTNF一a高亲和力嵌合抗体，与212比较亲和力最高提高750倍，比Remicad姻亲和力提高6倍:其识别hTN下一a功能表位不同于Remicad礴，但中和hTNF一a活性能力与Renticad洲匆相同。嵌合抗体CH22与已公开发表的抗体均有所不同，具有独立知识产权，此方面研究申请一项发明专利。
刘运超[2]2012年在《人源化单链抗体噬菌体库的构建及抗TNF-α抗体的筛选》文中认为抗体是体液免疫系统的重要组成部分，也在生命科学研究、疫病检测和医药领域发挥着重要作用。噬菌体展示技术是人源治疗性抗体的重要技术来源之一。TNF-α是一种前炎症因子，与风湿性关节炎等多种疾病的发生密切相关。本研究采用噬菌体抗体展示技术构建一个人源噬菌体抗体库，并从中筛选出具有TNF-α细胞毒活性抑制作用的人源单链抗体。依据文献报道的人抗体恒定区序列及人源抗体各胚系基因序列，本研究设计42条引物，以200份人外周血中分离的总RNA为模板，利用这些引物扩增出了抗体的重链（VH）和轻链（VL）可变区基因。抗体重链可变区的扩增和组装采用叁轮OE-PCR反应完成：首先分别扩增VH的CDR1、CDR2、CDR3和FR3，然后采用OE-PCR拼接重链的CDR1和CDR2、CDR3和FR3的基因片段，再将两者拼接成完整的人抗体VH基因。VL基因的扩增采用PCR方法从总RNA中经多次反应获得，再将其与VH基因连接形成完整的scFv基因。噬菌体库的构建采用载体pCANTAB5E、E.coli TG1和辅助性噬菌体M13KO7。将scFv基因插入pCANTAB5E载体酶切位点Sfi I和Not I之间，并将新载体转化E.coli TG1。辅助噬菌体M13KO7侵染转化后的TG1，构建scFv噬菌体库。梯度稀释法测得噬菌体库库容为2.5×10~7，噬菌体滴度为10~(12)pfu。基因测序显示E.coli TG1中转化DNA与预期相符，抗体重链各区域组合正确，VH和VL之间有柔性多肽编码基因相连。采用微孔板筛选法以人TNF-α、禽流感NS1蛋白、人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白OVA和PRRSV病毒GP5蛋白对文库进行淘选，结果显示五种蛋白在淘选过程中均能有效富集。为获得高亲和力的抗TNF-α抗体，依据phage ELISA实验结果从随机挑选的87株重组噬菌体中筛选出4株阳性克隆进行重组蛋白表达和抗TNF-α活性测试。重组蛋白的表达采用pET-28a载体和大肠杆菌BL21（DE3）菌株。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示scFv重组蛋白在大肠杆菌中大量表达，重组蛋白的表达量占菌体量的40%左右，经镍柱纯化的蛋白纯度在90%以上。MTT法检测TNF-α杀伤L292细胞的活性，显示在放线菌素为10μg/mL时，TNF-α的ED50为0.01ng/mL。重组蛋白B11和A24对TNF-α的IC_(50)分别为70μg/mL和100μg/mL。本研究构建、鉴定了人源scFv噬菌体抗体库，并从中筛选了2株具有抗TNF-α活性的人源scFv，为抗TNF-α抗体药物的研发奠定了基础。
杨芳[3]2009年在《抗肿瘤坏死因子-α人源性抗体的制备及功能研究》文中研究表明肿瘤坏死因子-α是一种具有多种生物学活性的多效性细胞因子,来源极广泛,主要包括脂肪细胞、激活的小胶质细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞。有活性的TNF-α分子量为17KD,以叁聚体形式与细胞表面的TNF受体(TNFR)结合,介导多种生物学活性。已知TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子,但TNF-α在体内的大量产生和释放则会破坏机体的免疫平衡,与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。在许多疾病,如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、炎症性肠病(IBD)、移植物抗宿主病(GVHD)和骨髓造血紊乱综合征(MDS)等的病理生理过程中TNF-α起着重要的介质作用。临床上,抗TNF-α的治疗性抗体被成功用于治疗RA、Crohn’s病,同时研究表明其对牛皮癣和强直性脊髓炎也具有肯定的疗效。目前已有2种抗TNF-α的抗体被FDA批准用于治疗RA——Infliximab(Remicade)和Adalimumab(Humira)。另外,目前临床在研的多株抗TNF-α的中和抗体也取得良好的效果。人源性抗体在治疗中独具优势,被认为是治疗性抗体发展的最终方向。Humira作为第一个上市的全人源抗体,2008年年销售额就超过30亿美元。我国类风湿性患者众多,在我国研制具有自主知识产权的TNF-α人源性中和抗体具有重要的应用价值。本研究以原核表达的hTNF-α为抗原,利用本室构建的大容量全合成人源性抗体库进行筛选,获得两株特异性较好并且有一定细胞学活性的hTNF-α人源性中和抗体,为相关疾病的治疗研究奠定良好的基础。首先,原核系统表达纯化hTNF-α。表达质粒pBVTNF在大肠杆菌DH5α中经过42℃热诱导6小时后获得了hTNF-α可溶性表达,接着根据其理化性质即等电点PI5.6、分子量大小17KD、以及疏水性质采用离子交换、疏水层析、凝胶过滤叁种方案对其进行了纯化并获得纯品。以获得的表达纯化的TNF-α作为抗原,对库容量为1.35×1010的大容量人源噬菌体单链抗体库进行了特异性抗体的筛选。叁轮筛选后采用ELISA方法进行特异性抗体的鉴定,得到3株具有不同序列的单链抗体W18、G3-4、T12,并利用pel-SN表达载体实现了3株单链抗体在大肠杆菌中的分泌表达。pel-SN表达载体是本室在大肠杆菌可溶性表达载体PTIG-Trx的基础上进行改造后所得到的大肠杆菌分泌型表达载体,在原载体的基础上引入了pelB信号肽序列,并且引入了SfiI和NotI酶切位点,以方便从含单链抗体基因的噬菌体质粒直接克隆到分泌型表达载体中。对叁株抗体分泌表达产物进行特异性鉴定,W18保持了与噬菌体抗体相同的结合特异性,但T12丧失了与抗原结合的活性,G3-4改造为单链抗体后的结合特异性降低。蛋白质通过特定的叁维空间结构发挥其特殊生物活性。蛋白质的叁维结构信息对于了解蛋白质的折迭机理、酶催化活性、分子稳定性、蛋白质结构域之间的相互作用以及蛋白质分子与配基的相互作用等方面都是至关重要的。另外蛋白质的叁维结构信息也是分子设计研究、生命进化规律研究以及药物设计的基础,因此蛋白质叁维结构的研究非常重要。同源模建方法是蛋白质结构预测方法中应用得最多也是最成熟的方法,在蛋白质工程研究中已有广泛应用。同源模建方法的理论基础就是一级序列决定叁维结构,序列同源性高的蛋白质其叁维结构也应该相似。T11是本室从大容量抗体库中筛选出来的一株抗TNF-α突变体的特异性噬菌体抗体,该株抗体也能与野生型的TNF-α特异性结合,但转换为IgG型后其特异性下降。本实验中将抗天然TNF-α特异性抗体W18与T11抗体分别进行计算机同源模建,分析TNF-α参与与之相互作用的氨基酸位点以及抗体参与与抗原相互作用的氨基酸。结果显示,TNF-α参与与W18相互作用的关键氨基酸残基为65位、140-157位氨基酸段;而TNF-α参与与T11相互作用时关键氨基酸残基29-33位氨基酸残基、65位氨基酸、140-157位氨基酸位点。另外,分析抗体参与与TNF-α相互作用时,研究结果初步表明可能W18的轻链较T11的轻链在参与抗原抗体反应中作用的原子更多,而T11的重链较W18的重链在参与与抗原抗体反应中作用的原子更多。根据以上实验数据我们将W18的轻链与T11的重链进行了重新组合得到一株新的组合抗体即W1hT11,对其分别在单链和全抗水平进行了特异性分析,结果表明该株抗体的特异性较好。将得到的两株抗体W18、W1hT11改造为全抗体形式,在FreeStyleTM细胞中获得了瞬时表达。W18、W1hT11全抗体保持了与TNF-α特异性结合的活性。采用非竞争酶联吸附实验测定了W1hT11、W18全抗体与抗原的亲和常数KD分别为4.3×10-8M和7.5×10-8M。为了分析W18、W1hT11与抗原的结合表位,根据计算机同源模建的结果设计并构建了4个TNF-α突变体即65位突变为甘氨酸突变体、84-91位缺失突变体、140-157位缺失突变体以及84-91位与140-157位同时缺失突变体,实现了这4个突变体在大肠杆菌DH5α中的表达。利用western-blot检测了W18、W1hT11单克隆抗体与各突变体的结合情况。初步实验结果表明,W1hT11识别的抗原表位可能位于140-157位与84-91位,W18识别的抗原表位可能位于65位与84-91位。利用TNF-α杀伤L929细胞活性实验检测W18、W1hT11的体外中和活性,结果表明,W18、W1hT11均能一定程度上拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用。W1hT11这株抗体在浓度为80ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率达到90.85%,随着其浓度的下降中和率降低,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为43.94%;W18这株抗体的中和率相对低一些,在浓度为80ug/ml时中和率为79.58%,随着其浓度的降低对TNF-α细胞毒的中和率也呈相应的下降趋势,到50ug/ml时对TNF-α细胞毒的中和率为36.86%。本研究从大容量全合成人噬菌体抗体库中共获得了2株具有体外中和活性的抗肿瘤坏死因子-α的人源单克隆抗体W18、W1hT11,为下一步深入研究研制肿瘤坏死因子-α中和抗体药物奠定了良好的基础。
谭兵[4]2008年在《RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分化学合成的siRNA对活化的小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α表达的影响目的观察靶向小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的化学合成的小干扰RNA(siRNA)在体外对小鼠巨噬细胞系RAW264.7表达TNF-α的抑制作用。方法采用化学法合成针对TNF-αmRNA不同位点设计的3条siRNA序列(siRNA1-3)和1条带有荧光标记的BLOCK-ITTM Fluorescent荧光Oligo(修饰的荧光标记的dsRNA)通过脂质体包裹后将其分别转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7,同时设立一个无任何靶基因的siRNA做为阴性对照(siRNA4)。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)法分别检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果内毒素刺激后6 h ,巨噬细胞表达TNF-αmRNA和合成分泌的TNF-α量均增加,于9～12 h达高峰。利用荧光标记的Oligo观察到siRNA转染效率达72%～80%。siRNA1-4转染巨噬细胞后, siRNA2、3可见内毒素刺激的TNF-αmRNA(0.158±0.030、0.114±0.028)和TNF-α蛋白表达[(1355±348)pg/ml、(817±138)pg/ml]均明显少于未转染组[TNF-αmRNA 0.294±0.147,蛋白(2104±32)pg/ml,均P< 0.05],其中siRNA3的抑制率非常显着,达61.2%(P< 0.01)。siRNA1、阴性对照siRNA4对细胞基因及蛋白表达无影响。结论内毒素可刺激小鼠巨噬细胞TNF-α的合成。化学合成的siRNA转染小鼠巨噬细胞能有效抑制TNF-αmRNA及蛋白的表达。第二部分发夹样siRNA抑制小鼠巨噬细胞TNF-α表达目的:研究特异性载体介导的小干扰RNA(siRNA)对小鼠巨噬细胞株RAW264.7表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的抑制作用。方法:设计两段靶向TNF-α基因的特异性siRNA,合成相应寡核苷酸,插入载体H1启动子下游,构建表达干扰性发夹状RNA(Short hairpin RNA, shRNA)的载体pHS-A和pHS-B,转染小鼠巨噬细胞株,用实时荧光定量PCR和ELISA法检测siRNA对TNF-α的mRNA和蛋白表达的抑制作用。结果: pHS-A转染后,LPS刺激巨噬细胞的TNF-αmRNA为0.00356±0.00187, TNF-α蛋白表达为149.93±21.02 pg/ml,比未转染组(TNF-αmRNA 0.02134±0.00960,蛋白1922.30±149.05pg/ml)显着减少P< 0.01),抑制率达83.3%。pHS-B及阴性对照组对基因及蛋白表达均无影响。结论: pHS-A可成功地表达了发夹状,并且能抑制小鼠巨噬细胞TNF-α表达。第三部分应用载体构建shRNA对小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎的影响目的:探讨载体构建shRNA对小鼠葡聚糖硫酸钠( DSS)结肠炎的治疗作用,寻找治疗溃疡性结肠炎(UC)的新途径。方法: 30只BALB /C小鼠随机分为: (1)生理盐水对照组(2)4% DSS口服+生理盐水模型组(3)4% DSS口服+载体构建shRNA治疗组,每组10只。各组小鼠每天记录和计算其结肠炎活动指数(DAI)评分;取小鼠结肠粘膜组织进行大体及组织形态学观察、用酶联免疫吸附法( ELISA)测定肿瘤坏死因子–α(TNF–α)水平、荧光定量PCR检测TNF-αmRNA表达。结果:模型组和治疗组小鼠的DAI评分、组织学评分和肠粘膜组织内TNF-α基因和蛋白表达均明显高于正常对照组(均P< 0. O5);而治疗组的上述指标均又明显低于模型组,治疗组与对照组的结肠组织学评分和TNF-αTNF-α基因和蛋白的表达分别为5.30±0.48和8.50±0.53(P< 0.05),0.31±0.11和0.42±0.04(P< 0.05),(28.13±3.23)pg/g和(39.43±3.90)pg/g(P< 0.05)。结论:载体构建的shRNA对小鼠DSS结肠炎有保护作用。
谷岳[5]2009年在《抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定》文中研究指明肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)主要是由巨噬细胞分泌的一种多功能细胞因子,一方面它能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血性坏死;另一方面它又是一种较强的内源性炎症介质,过量的TNF-α表达可以引起组织损伤、重症感染性休克、自身免疫性疾病等,可以说TNF-α作为一个调节生理平衡的关键细胞因子,在人类对抗肿瘤及其他疾病中扮演了“双刃剑”的角色。依据TNF-α的双重作用,本实验课题主要分为两个部分,首先完成了一类TNF-α小分子抑制剂的设计、筛选及活性测定,其次对抗CD20Fab-TNFα融合蛋白在B系淋巴瘤中的功能作用进行了初步研究。在过去的30年中,随着对某些炎性疾病如风湿性关节炎、克罗恩氏病、银屑病及强直性脊柱炎在细胞和分子水平上病理机理的阐明,人们发现这些疾病之间有着共同的发生机制。而由TNF-α及其受体所构成的细胞因子信号通路网络在炎性疾病的发生发展过程中起着核心作用。阻断TNF-α活性已成为治疗上述免疫性疾病的主要手段。目前,国际上用于抗TNF-α治疗用药物主要有三种,皆为蛋白类药物,这些生物大分子一方面具有特异性好、结合能力强的特点,但另一方面也存在着稳定性较差,在患者体内易降解并极易产生免疫耐受的缺点。因此,探索新的免疫抑制剂研究策略来研制靶向抗TNF-α的小分子药物,已成为国内当前临床免疫治疗急需解决的难题之一。本文利用计算机辅助药物设计(computer-aided drug design,CADD),以靶蛋白及其受体的复合晶体结构为模板,从小分子化合物库中虚拟筛选出300-500个抗TNF-α的抑制剂,并购买其中的80个代表性化合物做进一步的生物活性测定。包括初步的抑制TNF-α对L929细胞毒性实验;流式细胞仪法测定筛选的小分子化合物阻断量子点标记的TNF-α结合受体的实验;MTT法进一步分析筛选出的小分子化合物在不同剂量时抑制TNF-α对L929细胞毒性的作用;采用AnnexinV-FITC检测上述小分子对TNF-α诱导的细胞凋亡的抑制作用。活性筛选结果显示有3个小分子化合物对TNF-α有显著抑制活性;对其中较好的一个进行了深入研究,实验结果表明,该化合物能特异性阻断量子点标记的TNF-α与受体的结合,并呈剂量依赖性;该化合物具有较强的抑制TNF-α(1ng/ml)对L929细胞毒性的作用,表现为剂量依赖性,半数抑制浓度(IC50)为10umol/L;该化合物能抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡,并呈剂量依赖性。实验证明,利用以上计算机虚拟筛选并结合人工筛选及生物学活性检测的方法能够发现针对特定靶点的小分子抑制剂。尽管TNF-α在自身免疫性疾病中起到核心作用,但人们最初认识它却是作为一个能够诱导肿瘤细胞发生坏死的细胞因子。体外实验表明,TNF-α具有很强的抗增殖功能和细胞毒性。因此,在上个世纪80年代就被应用于恶性肿瘤的临床治疗当中。但全身系统性使用TNF-α治疗会产生一些严重的不良反应,限制了其应用。到目前为止,直接利用TNF-α杀灭肿瘤的治疗方法进展缓慢,仅局限于在隔离肢体灌注疗法中治疗黑色素瘤、骨肉瘤等。利用抗体的靶向作用将药物运输到目标部位已成为当前靶向治疗的主要手段和方法。已有研究表明,用单克隆抗体将TNF-α运送到肿瘤组织血管部位,使其在该部位浓集,可以达到破坏肿瘤新生血管从而杀灭肿瘤的目的。CD20是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质分子,主要参与调节B淋巴细胞的增殖与分化,在免疫系统中起重要作用。其在B细胞中特有的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶点。研究表明,抗CD20的抗体可直接抑制B淋巴瘤细胞生长并诱导其凋亡的发生,该凋亡的发生与钙离子相关,并且CD20分子的二聚化和多聚化能够有效增强其诱导凋亡的能力。本实验在我室原有抗CD20Fab表达载体的基础上,成功构建了抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体并表达出可溶性蛋白,之后又对其活性进行了初步的研究探讨。证明了CD20Fab部分具有与Raji细胞表面CD20分子的结合能力,并验证了融合蛋白TNF-α部分的细胞毒活性。本实验的创新性在于期望利用CD20抗体的靶向作用将TNF-α用送到肿瘤部位以增强其诱导凋亡的作用,并且利用TNF-α在可溶状态下的自身三聚化可以使与之偶联的抗CD20Fab叁聚化,从而达到B淋巴细胞表面CD20分子叁聚化的目的。
奚清[6]2008年在《金银花提取物活性成分对甲型流感病毒肺炎小鼠免疫细胞因子表达影响的实验研究》文中研究指明目的:通过金银花提取物对甲型流感病毒肺炎小鼠的治疗作用和对免疫细胞因子TNF-α、IL-1β表达影响的实验研究,探讨中药金银花在免疫调节过程中对细胞因子的影响机制。方法:1.鼻腔接种甲型流感病毒鼠肺适应株(FM1),诱导小鼠形成肺炎模型。用聚合酶链反应技术(RT-PCR)复制肺组织中流感病毒(IV)RNA并检测其表达,结合组织形态学、肺指数等指标,鉴定小鼠肺炎模型。2.金银花提取物灌胃给药以治疗小鼠流感病毒性肺炎。观察各组小鼠一般状态、肺指数、肺组织形态学和IV RNA的表达情况,阐明金银花对流感病毒性肺炎的治疗作用。3.采用双抗体夹心ABC显色-ELISA法检测各组小鼠血清中免疫细胞因子TNF-α、IL-1β的表达情况,初步探讨金银花提取物活性成分对免疫调节过程中细胞因子的调控作用。结果:1.模型复制:感染5天后,模型组的肺组织中检测到IV RNA大量表达,肺指数增高,病理改变呈间质性肺炎病变。2.金银花提取物对肺炎小鼠的治疗作用:(1)肺炎小鼠的一般状态改善,治疗作用明显。(2)在保护肺组织病理性改变方面:金银花组和病毒唑组肺指数均低于模型组,有显着性差异(P<0.01);金银花组与病毒唑组比较无显着性差异(P>0.05)。光镜下观察肺组织形态表明,金银花组和病毒唑组肺组织病变较模型组均明显减轻。(3)在抑制病毒复制方面:正常组肺组织中未检测到IV病毒核酸;模型组在感染后第5天检测到大量IV RNA表达;金银花组和病毒唑组均低于模型组,且差异具有显着性(P<0.01);金银花组较病毒唑组略高,存在差异(P<0.05)。3.金银花提取物对肺炎小鼠血清中免疫细胞因子的调控:正常组可检测到少量TNF-α、IL-1β表达;模型组较正常组TNF-α、IL-1β表达明显增强,有显着性差异(P<0.01);金银花组和病毒唑组均低于模型组,且差异有显着性(P<0.01);金银花组较病毒唑组略高,存在差异(P<0.05)。结论:1.幼龄昆明种小鼠鼻腔接种甲型流感病毒FM1株,可形成流感病毒性肺炎模型。用组织形态学观察,计算肺指数和RT-PCR复制病毒核酸并检测其表达可鉴定流感病毒性肺炎模型。2.金银花提取物有一定程度的抗流感病毒性肺炎作用。3.流感病毒性肺炎小鼠血清中免疫细胞因子TNF-α、IL-1β表达明显上调;金银花提取物对流感病毒性肺炎小鼠血清中免疫细胞因子TNF-α、IL-1β表达有调控作用。
参考文献：
[1]. 人TNF-α嵌合抗体体外亲和力成熟作用研究[D]. 林周. 中国人民解放军军事医学科学院. 2004
[2]. 人源化单链抗体噬菌体库的构建及抗TNF-α抗体的筛选[D]. 刘运超. 天津大学. 2012
[3]. 抗肿瘤坏死因子-α人源性抗体的制备及功能研究[D]. 杨芳. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009
[4]. RNA干扰在体外、体内抑制TNF-α表达的实验研究[D]. 谭兵. 广州医学院. 2008
[5]. 抗TNF-α小分子抑制剂的研究及抗CD20Fab-TNFα融合蛋白表达载体的构建、表达和活性的初步测定[D]. 谷岳. 中国协和医科大学. 2009
[6]. 金银花提取物活性成分对甲型流感病毒肺炎小鼠免疫细胞因子表达影响的实验研究[D]. 奚清. 辽宁中医药大学. 2008
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