陈寒春[1]2003年在《胶质瘤组织中DNA修复相关基因表达研究》文中认为[目的] 分析人脑胶质瘤恶性进展基因表达谱中DNA修复相关基因的表达差异，选择有进一步研究价值的基因，以临床标本进行检测论证，为研究细胞DNA修复相关基因在胶质瘤恶性进展中的作用提供依据。 [方法] 1．根据GENEBANK和GENECARD的生物信息学资料，由人脑胶质瘤恶性进展基因表达谱中筛选参与肿瘤恶性进展过程的DNA修复相关基因；2．应用半定量RT-PCR和反向多点杂交技术(ReverseDot-BlOt)检测、验证所筛选的人脑胶质瘤DNA修复相关基因在正常脑组织和各级胶质瘤临床标本中的表达情况。 [结果] 1．筛选出与胶质瘤相关的DNA修复基因17条，其中基因Rad17、Rad18、XPA等均表现为表达上调；2．临床标本的半定量RT-PCR检测验证基因Rad17、Rad18在胶质瘤中表达水平存在上调，Dot-blot检测证实基因Rad17表达水平高度上调；与芯片结果相符。 [结论] 1．临床标本的RT-PCR检测验证了人脑胶质瘤恶性进展基因谱的结果是可靠的；基因Rad17、Rad18在胶质瘤中的表达水平与胶质瘤组织中DNA修复相关基因表达研究中文摘要胶质瘤恶性程度相关;2.Dot一blot检测发现基因Rad17在胶质瘤标本中呈现与RT一PCR检测一致的高水平表达，进一步研究有望使其成为针对胶质瘤治疗的靶点。
王海龙[2]2014年在《不同胶质瘤细胞辐射后基因组学分析及自噬与凋亡相互作用分子机制研究》文中研究指明神经胶质瘤具有抗辐射的性质，放疗后的患者易发生肿瘤复发与侵润，致使胶质瘤治疗成为一直研究但迫切需要解决的难题。辐射抗性与神经胶质瘤源于脑内胶质细胞，与血脑屏障的存在直接相关。首先，神经胶质瘤源于胶质细胞的突变，具有神经胶质细胞的特性，所以与其它组织内的肿瘤明显不同；其次，血脑屏障的存在阻断了免疫细胞的侵入及化疗小分子的进入，使放疗成为胶质瘤患者最直接的治疗方式。这种特性使治疗方案选择不同于其它类肿瘤的治疗。所以针对胶质瘤的辐射治疗现状，通常选择合理的治疗方式增加胶质瘤细胞的死亡的同时，更要考虑降低对正常组织的损伤，延长胶质瘤患者的存活率及存活时间。本文选择不同辐射耐受性的人胶质瘤细胞，进行辐射抗性机制的研究，并针对不同辐射耐受性的胶质瘤细胞进行了比较。首先，不同胶质瘤细胞辐射后全基因组比较发现，辐射敏感性是DNA修复，细胞周期及DNA复制相关蛋白的相互作用的结果，并且细胞数目决定因素为细胞死亡方式——凋亡及坏死。在辐射抗性细胞U87中，DNA修复的存在及完整的细胞周期调控机制引起了细胞的辐射耐受性；SF767细胞辐射后DNA复制的缺失及细胞周期调控方式的改变引起细胞的辐射后大量细胞凋亡；而U251辐射后，DNA修复机制降低的趋势引起细胞辐射耐受性降低，但细胞周期调控机制的完善阻止了细胞的凋亡，因此辐射后细胞出现增殖减缓，长时间维持细胞数目恒定。其次，通过与细胞数目维持相关的凋亡基因的分析发现促凋亡基因的活化在U251细胞发生时间早于U87及SF767胶质瘤细胞，而抑制凋亡基因却发生在辐射后晚期。相反，U87及SF767胶质瘤细胞的促凋亡基因与抑制凋亡基因同时发生，都发生于晚期。对促凋亡基因的转录调控进一步分析发现，U251及U87胶质瘤细胞基因的转录与P53转录因子蛋白调控直接相关。这促使我们对叁种胶质瘤细胞辐射后P53作为转录因子的基因调控机制进行深入的研究。结果表明P53蛋白作为转录因子在3种胶质瘤细胞辐射后调控受启动子区域碱基序列及与P53转录复合体相关蛋白的表达水平两种因素的调控，并且推测正因为P53作为转录因子在3种胶质瘤细胞中的差异决定了3种胶质瘤细胞辐射敏感性的差异。具体表现为：（1）U87胶质瘤细胞辐射后P53作为转录因子调控细胞的凋亡，同时调控细胞周期阻滞，为DNA修复提供了时间。但同时P53转录因子MDM2等起到了P53水平的反调控，引起了阻滞时间的控制，抑制了长时间的阻滞导致细胞进入死亡及衰老；（2）U251细胞因为P53基因突变，辐射后P53水平的上调及降解机制的缺失引起P53蛋白表达水平大量提高，进而引起促凋亡基因的高表达及表达时间的提前。同时，P53作为转录因子对细胞周期相关基因的转录调控促使细胞长时间的周期阻滞，进而细胞进入衰老；（3）辐射敏感细胞SF767在辐射后P53的表达水平并未发生明显的变化，使P53作为转录因子的调控基因水平并未发生明显的变化，而导致细胞发生凋亡现象。此外， U251细胞辐射后组成蛋白表达水平并未发生明显变化使其转录数目明显低于发生明显变化的U87胶质瘤细胞，原因可能归结于辐射后两种细胞存在P53转录复合体组成蛋白的表达水平的区别，进而引起P53转录的基因数存在显着差异。最后，为了增加胶质瘤细胞辐射敏感性，我们研究了与错误折迭蛋白聚集及DNA损伤相关的自噬与凋亡在辐射后的联系。不同的胶质瘤细胞辐射后同时存在死亡受体DR5调控途径基因的富集，同时不同的胶质瘤细胞自噬发生的强度存在明显的区别，通过对自噬相关蛋白的研究发现P62蛋白在不同胶质瘤细胞的自噬程度的强弱方面发挥了重要作用，并且自噬发生的调控蛋白mTOR对自噬具有抑制功能，这除与ATG13-ATG1-ULK1复合体的抑制作用相关联，还与P62蛋白降解途径的抑制有关。此外，研究结果表明自噬在胶质瘤细胞辐射后通过LC3B对凋亡蛋白caspase8的活性具有促进作用，并且是通过对DR5的影响促进凋亡的发生，二者相互作用的调控网络在原代细胞也得到验证，对胶质瘤的肿瘤联合治疗策略提供了作用靶点。综上，本论文通过对不同胶质瘤细胞辐射敏感性机制及自噬促凋亡机制进行了深入研究。发现不同的胶质瘤细胞辐射抗性的调控存在重大差别，P53调控的转录途径及自噬对凋亡的影响都可以作为临床治疗深入探讨的方向。
高薇[3]2005年在《DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化与脑胶质瘤》文中研究表明目的:目前的研究已经证实DNA修复酶—O~6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O~6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)在脑胶质瘤组织中表达与肿瘤细胞对BCNU等亚硝脲类药物的耐药密切相关,并影响肿瘤的化疗效果和病人的预后。在许多肿瘤中发现启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活,但是启动予区过甲基化与MGMT蛋白的表达、化疗耐药及患者预后之间的关系尚未完全阐明。本文拟从叁个方面对MGMT基因启动子甲基化进行研究:1)人脑胶质瘤细胞株MGMT基因启动子过甲基化同细胞株对BCNU耐药的关系;2)胶质瘤患者肿瘤组织MGMT基因启动子过甲基化和肿瘤组织中MGMT蛋白表达的关系;3)胶质瘤患者肿瘤组织和其对应血清中MGMT基因启动子过甲基化是否有一致性。 材料与方法:研究对象为9株人脑胶质瘤细胞株、27例临床胶质瘤患者的肿瘤组织和其对应的血清。采用美国Gentra公司的试剂盒以盐析法提取基因组DNA,并采用美国Chemicon公司CpGenome~(TM) DNA修饰试剂盒对组织DNA进行亚硫酸氢盐修饰,采用甲基化特异性PCR法(Methylation-specific PCR,MSP)进行MGMT基因启动子区甲基化水平的检测;采用sulforhodamine B(SRB)Colorimetric抗癌药筛选法测定人脑胶质瘤细胞株对BCNU的敏感性;采用免疫组化的方法来检测胶质瘤患者肿瘤组织标本中MGMT蛋白表达程度。实验结果采用SPSS 12.0统计软件处
陈寒春, 兰青, 王爱东, 董军, 黄强[4]2004年在《人脑胶质细胞瘤恶性进展相关基因表达谱中DNA修复基因分析》文中研究表明目的 探讨DNA修复基因的变化及其在人脑胶质瘤恶性进展过程中的作用。方法 采用cDNA芯片检测同一患者初发和两次复发的胶质瘤组织与正常脑组织中基因表达的差异 ,建立胶质瘤恶性进展相关基因表达谱。根据GeneBank、GeneCards上检索的资料分析其中DNA修复基因的变化。结果 确立与DNA修复相关的基因 17条 ,分别在肿瘤恶性进展的不同阶段上调或下调。结论 一些DNA修复基因可能参与了人脑胶质瘤的放疗、化疗耐受及恶性进展过程
张文斐[5]2016年在《MORC2在人脑胶质瘤中表达及作用研究》文中研究说明第一部分生物信息学分析MORC2在胶质瘤中的作用目的：探讨胶质瘤中MORC2的生物学作用方法：运用t检验对胶质瘤样本集GSE4290的数据进行MORC2差异表达分析,比较胶质瘤组织和正常脑组织中的MORC2表达差异。运用GSEA分析方法分析胶质瘤样本集GSE4290中MORC2表达水平对于各种生物学功能的基因集富集情况。结果：在GSE4290样本数据中,对比于正常脑组织(23例),胶质瘤(157例)中MORC2表达显着升高,P<0.05,差异具有统计学意义。MORC2高表达富集了细胞周期基因集、有丝分裂基因集、DNA修复基因集、DNA损伤应答基因集,富集分数分别为0.660、0.739、0.565、0.546,P<0.01,差异具有统计学意义。结论：胶质瘤中MORC2表达增加,MORC2高表达参与了细胞周期调控、促分裂、增强DNA损伤应答及修复等相关生物学过程。第二部分MORC2在胶质瘤中的表达研究目的：探讨人脑胶质瘤中MORC2的表达及意义。方法：收集脑胶质瘤和正常脑组织标本,应用免疫组织化学技术检测MORC2在各级别胶质瘤及正常人脑组织中的表达水平。将胶质瘤患者分为MORC2低表达组与MORC2高表达组,生存分析比较两者预后的差异。结果：10例正常脑组织中未见MORC2高表达,WHOⅠ、Ⅱ级别组中24例有7例显示MORC2高表达,WHOⅢ级组中24例有15例显示MORC2高表达,WHOIV级组中22例中有20例显示MORC2高表达。阳性表达率分别为：0%、29.2%、62.5%、90.9%。生存分析中,MORC2低表达组患者的无进展生存期及总生存期显着高于MORC2高表达组。结论：胶质瘤中MORC2表达显着升高,且随着恶性程度增加,MORC2的表达升高。MORC2低表达患者预后好于MORC2高表达者。第叁部分MORC2对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响目的：研究下调人脑胶质瘤细胞系U251中MORC2的表达对于细胞增殖凋亡的影响。方法：设计两种MORC2-shRNA分别转染U251细胞,以转染空载体shRNA作为空白对照组。应用RT-PCR及Western blot技术验证干扰效率,应用CCK-8试剂盒检测细胞生长情况,流式细胞仪分析细胞周期,Annexin PE双染法检测细胞凋亡。结果：RT-PCI及Wsestern blot结果显示shRNA1组及shRNA2组MORC2表达明显下降；CCK-8法显示, shRNA1组及shRNA2组的细胞增殖明显低于空白对照组；流式细胞仪分析细胞周期显示,shRNA1组及shRNA2组的G2/M期细胞比例较空白对照组明显下降；Annexin PE双染法结果显示,shRNA1组及shRNA2组的早期凋亡率较空白对照组明显增加。结论：成功运用shRNA沉默技术抑制MORC2的表达,下调MORC2的表达能抑制胶质瘤细胞的增殖,促进胶质瘤细胞的早期凋亡,使G2/M期细胞比例下降。第四部分MORC2对U251细胞侵袭迁移的影响目的：研究下调MORC2表达对于U251细胞侵袭迁移的影响。方法：设计两种MORC2-shRNA分别转染U251细胞,以转染空载体shRNA作为空白对照组。应用软琼脂克隆形成实验检测单细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果：软琼脂克隆形成实验显示,shRNA1组及shRNA2组的克隆形成数明显低于空白对照组。Transwell实验显示,与空白对照组相比,shRNA1和shRNA2组穿过膜细胞数明显减少。结论：下调MORC2表达抑制U251细胞的单细胞增殖能力及抑制U251细胞的侵袭迁移能力。
高翔[6]2016年在《ERCC2 rs13181基因多态性与胶质瘤易感性关系及相关机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分：ERCC2 rs13181基因多态性在胶质瘤易感性关系的研究研究与目的胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,约占400%～50%,占颅内恶性肿瘤的81%,青壮年多发,死亡率高,对社会、家庭都是很大的打击。目前对于胶质瘤的治疗取得了很大的进步,当前治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、免疫治疗等,多种治疗方案相结合的综合方案已被广泛认同,使得低级别胶质瘤患者中位生存期在8-10年之间；间变胶质瘤患者中位生存期在3-4年之间。对于胶质母细胞瘤中位生存期在14.6—17个月之间,近年来随着放疗与替莫唑胺化疗方案结合,使得将近10%胶质母细胞瘤患者存活至5年以上。基因靶向治疗目前仍处于实验室研究阶段。脑胶质瘤的发生原因目前仍不清楚,在本质上是多种环境因素与遗传的致癌因素的共同作用,导致引起DNA损害,从而激活原癌基因,灭活抑癌基因,此外,凋亡调节基因及DNA修复基因的突变,使靶细胞发生浸润、变化与转移形成。目前发现电离辐射是胶质瘤发生的比较确切的病因,另外脑肿瘤家族史、一些单基因遗传病、神经纤维瘤病1型和2型、视网膜母细胞瘤和结节性硬化症等都与神经胶质瘤的风险相关。胶质瘤发生发展也是在内部遗传易感因素与外部环境致病因素相互作用下,在细胞DNA及表观遗传物质水平发生了足以致癌的突变,研究发现DNA修复基因多态性与胶质瘤有明显相关,相关基因主要有：ERCC1、ERCC2、 RTEL、TERT、EGFR、MGMT和VEGF基因。核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair, NER)是一种重要的DNA修复机制,对抵抗紫外线有重要作用。参与NER的基因主要包括：ERCC1、XPA、 XPB/ERCC3、XPC、XPD/ERCC2、XPE/DDB1/2、XPF/ERCC4、XPG/ERCC5。它们共同构成NER核心蛋白。其中ERCC2是NER机制中最重要的酶之一。目前发现ERCC2 (Excision repair cross complementation group 2,ERCC2)基因位于人类染色体19q13.3,是一种进化保守的ATP依赖性DNA解旋酶,在NER途径中起着重要作用。其包含23个外显子,大小约54kb,转录产物大小为2283bp,由760个核苷酸组成,ERCC2的晶体结构由四部分构成：ERCC2的晶体结构由四部分构成：第一解旋酶模块(HD1)、第二解旋酶模块(HD2)、4FeS、Arch。HD1包括四个保守的基因序列：Ⅰ、Ⅰ a、Ⅱ、Ⅲ。其中,4FeS位于Ⅰ与Ⅰ a之间,Arch位于Ⅱ与Ⅲ之间。HD2则包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ叁个基因序列。4FeS区域在ERCC2中为打开DNA双螺旋结构的初始部位,把DNA双链变为单链,让5’端单链通过HD1区域和Arch区域,而3’端单链则移动至HD区域外围。Arch区域包括两个拓扑结构(α和β),a为螺旋结构,β链为四股反向平行排列结构,具有可延伸的特性。通过α和β拓扑结构与4FeS区域相互作用,ERCC2通过Arch与CAK(cdk.activating kinase)相结合,促进转录因子IIH (TFIIH)复合物的形成。ERCC2在NER中的作用重要是通过转录因子IIH (TFIIH)来完成的。TFIIH是一个形态类似环形的叁维结构。由两个基团构成：8个亚基构成的核心区,包括：ERCC5, ERCC2, ERCC3,p62,p52,p44,p34,TTDA(特殊的修复亚体)；3个亚基构成的CAK(cdk-activating kinase)区,包括：cyclinH,MAT1,cdk7。ERCC2起着支架作用,在MAT1和P44协助下与CAK区紧密结合,作为桥梁将两个亚基连接。NER过程中,ERCC3是ATP依赖的3’一5’端解旋酶、ERCC2是ATP依赖的5’3’端解旋酶,将DNA双链解开。TFⅡH在主要是在损伤部位解开DNA双链,促使特异性的核酸酶对受损伤的DNA片段进行切除。有研究表明即使TFⅡH里的ERCC2被敲除了,其转录功能也不会被影响,但是对受损DNA的修复功能却要受到很大影响,说明了ERCC2在TFⅡH的受损DNA修复功能中处于非常重要的地位。基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。ERCC2 rs13181多态性可导致在核苷酸切除修复的缺陷,和在癌变的过程中DNA修复不足。ERCC2的多态性会降低酶活性,导致NER途径修复能力下降,癌症风险增高。ERCC2 rs13181位于该基因751位点,可能会改变所编码的蛋白质的酶活性,以前研究表明ERCC2 rs13181与各种癌症相关联,如胃癌,食道癌,非小细胞肺癌,肝癌,前列腺癌,皮肤癌和膀胱癌。ERCC2 rs13181多态性与脑胶质瘤的发展之间的关联是不确定的。本研究是通过研究ERCC2 rs13181多态性与脑胶质瘤易感性的关系,进一步说明ERCC2 rs13181与胶质瘤发生发展的关系。方法研究对象胶质瘤患者组：实验收集经组织病理确诊为胶质瘤患者资料,本研究中共有165例脑胶质瘤患者,根据世界卫生组织(WHO)的分类分级。对照组：随机选择330例同期我院门诊患者和体检健康者无脑胶质瘤患者,并排除与癌症或中枢神经系统相关的疾病和先前接收放疗和化疗其他疾病患者。对研究对象,设定调查相关内容,包括以下几方面：研究对象的一般情况,如性别、年龄、婚姻、爱好、健康情况、家庭经济状况等；1.外界环境与胶质瘤相关的重要危险因素；2.主要危险因素,包括家族肿瘤史,颅脑损伤,颅内感染等与胶质瘤发生密切相关的疾病史等。收集两组的外周血标本,提取DNA后用PCR反应扩增ERCC2 rs13181基因序列,再采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism PCR-RFLP)的方法对PCR反应产物进行基因型分析。统计学处理1. Hardy-Weinberg平衡检验：在进行关联分析之前,要先进行Hardy-Weinberg平衡检验,等位基因A1、A2的频率分别为p和q,(p+q)2=p2+2pq+q2=1,p2为野生型基因型频率,2pq为杂合型基因型频率,q2为突变纯合型基因型频率,假设前提为为以群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,采用χ2检验进行检验,确认研究样本的群体代表性。2.危险因素分析：采用SPSS 18.0对数据进行分析,实验结果以均数±s表示,两组间比较均数差异的显着性检验用t检验,p<0.05被认为有统计学差异。采用χ2检验及t检验进行分析。3.等位基因频率、基因型频率分析：采用Logistic回归分析。4.分层分析ERCC2 rs13181与环境因素的交互作用。结果胶质瘤组与对照组相比,性别、吸烟、饮酒、肿瘤家族史无明显差异；在共显性模型和隐性模型中,ERCC2 rs13181GG型增加胶质瘤的风险；环境因素(包括年龄,性别,吸烟和饮酒等因素)对ERCC2 rs13181多态性与胶质瘤的风险没有影响。结论在共显性模型和隐性模型中,ERCC2 rs13181GG型增加了脑胶质瘤的风险,这表明该基因多态性可能影响脑胶质瘤的病因相关。然而,需要具有更大的样本量的研究来证实这些发现。第二部分：基于过表达胶质瘤细胞模型研究ERCC2对胶质瘤细胞生物学功能的初步研究研究与目的胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤,约占40%～50%,占颅内恶性肿瘤的81%。胶质瘤的病因仍不清楚,在本质上是多种环境因素与遗传的致癌因素的共同作用,导致引起DNA损害,从而激活原癌基因,灭活抑癌基因,此外,凋亡调节基因及DNA修复基因的突变,使靶细胞发生浸润、变化与转移形成。P53是一个重要的抗癌基因,使癌细胞凋亡,从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。TFIIH解旋酶做为p53依赖的凋亡途径的成员之一,有助于DNA修复的功能,是p53依赖途径机制所需要的。此外,ERCC2具有促进p53负调控多种缺乏p53的结合位点基因的作用。野生型p53基因在非转录修复和积极转录修复过程中都需要的基因,参与调解细胞周期阻滞及凋亡的过程。据研究发现ERCC2解旋酶与p53C-末端结构域结合,有助于其促进凋亡活性。从有癌症倾向患者中的成纤维细胞的研究中发现,ERCC2缺陷引起p53依赖的凋亡能力不足。ERCC2的高表达具有诱导肿瘤细胞凋亡的功能。然而,ERCC2解旋酶如何上调p53蛋白表达,目前尚不明确,可能与癌症转化过程中的DNA修复功能缺陷有关。研究表明c-myc在胶质瘤细胞中表达增加,c-myc能诱导的DNA氧化损伤,下调DNA修复功能,促进癌症的发生发展,还有实验结果表明,在ERCC2缺陷或突变的细胞中,c-myc基因表达量增加。在TFIIH参与的转录过程,可以被FBP干扰抑制子(FIR)阻断,c-myc的表达被抑制是通过FBP结合c-myc基因的单链上游活化元件(FUSE)来实现的[17]。当ERCC2发生突变时,FBP的活化被突变型ERCC2阻断,而FBP的活化可以导致c-myc出现表达下降。ERCC2缺陷的细胞在被转入FBP或ERCC2后,c-myc表达可被抑制。ERCC2负性调节cdK7和CAK活性,发挥调节细胞周期进程的功能。作为TFIIH的一部分,CDK7可磷酸化其他激酶,是cdk2激活过程中必不可少的一步]。多余的ERCC2调节CAK活性,导致在cdK磷酸化,减少细胞分裂,和增强细胞的杀伤力。因此ERCC2的减少,导致CAK活性增强,促进细胞增殖。下调XPD这样似乎有助于有丝分裂CAK活性升高和正向调节有丝分裂。此外,ERCC2还通过抑制c-myc抑制CDC25A的表达,进而抑制了cdK2的活性,从而抑制了DNA复制的发动。CDK2是细胞周期的关键性激酶,在细胞周期进入S期和DNA复制过程中发挥其重要作用。有研究证实cdK2可以被CDC25A去除抑制性的磷酸根,从而受到抑制,从而被活化。研究表明多种肿瘤细胞中,CDC25A 的表达都会受到ERCC2的抑制。ERCC2能编码一个高度保守的DNA解旋酶,是DNA修复,复制,重组和转录过程中所必需。特别是作为NER途径的重要成员,ERCC2在基因组的完整性起着举足轻重的作用。如果ERCC2编码的解旋酶有缺陷,将导致具有癌症的倾向人类综合征,和基因组不稳定性。在肝癌的研究中,因为ERCC2基因表达水平往往是下调,并且该基因功能受阻,据文献报道ERCC2导致细胞活力下降,促进肝癌细胞周期阻滞和凋亡,逆转肝癌的恶性表型。在本研究中,我们通过研究ERCC2基因对胶质瘤细胞体外生物学效应,及p53、c-myc和cdK2表达的影响,初步分析ERCC2基因与胶质瘤发生发展的机制。方法研究对象将第一部分实验所获得的野生型ERCC2(ERCC2 rsl3181TT)的DNA扩增产物与pcDNA3.1质粒(美国Invitrogen公司)混合在一起,然后用限制性内切酶进行双酶切。酶切产物切胶回收后用高效DNA连接酶：16℃连接16h；将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细菌。使用G418平板筛选,挑取阳性克隆,摇菌过夜,最后提取质粒。将构建的重组质粒命分别命名为pcDNA3.1/ERCC2。将pcDNA3.1/ERCC2转染入人胶质瘤U251细胞,同时将空质粒pcDNA3.1转染的人胶质瘤U251细胞和未转染的人胶质瘤U251细胞作为对照组。统计学处理SPSS18.0统计软件行组间方差分析,以P<0.05为差异有显着性,结果以Mean±SD表示。结果1.体外转染细胞模型构建成功2.各组中ERCC2 mRNA和蛋白的表达情况,RT-PCR检测结果发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2表达量明显增加。经过Western Blot检测发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2蛋白翻译明显增加。3.转染48 h后的各组细胞,分别采用Annexin V-PI双染法,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用WinMDI 2.9软件对各组的凋亡率进行分析各组的凋亡率,统计学分析P<0.01,有显着的意义。4. Cell Counting Kit-8(CCK8)方法检测各组细胞增殖水平的变化。分别在细胞转染的第24小时,第48小时和第72小时收集细胞培养悬液,用分光光度计测定450nm吸光度(A450),测得各个时间点的吸光度值。我们发现pcDNA3.1-ERCC2组细胞细胞增殖受到抑制,48小时(p<0.05)；72小时(p<0.001)5.各组中p53、c-myc和cdk2等相关分子的表达情况。经过研究发现,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53表达量明显增加,C-myc、cdk2表达量明显下降。经过Western Blot检测结果,与对照组相比,pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53蛋白表达量明显增加,C-myc、cdk2蛋白表达量明显下降。结论ERCC2可以主要阻滞细胞周期进程,诱导胶质瘤细胞凋亡,抑制细胞活性,上调p53的表达,抑制c-myc和cdK2的表达。我们进一步推测,ERCC2基因可能为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。
路华[7]2004年在《胶质瘤相关基因甲基化与突变的实验研究》文中研究指明目的：胶质瘤仍是目前全身各系统肿瘤中治疗效果较差的一种，和全身其他恶性肿瘤一样胶质瘤的发生和发展是一个多因素多步骤的过程，在其不同发展阶段过程中与癌基因、肿瘤抑制基因和DNA蛋白酶修复基因密切相关，涉及许多相关基因结构和表达调控的改变。本课题探讨胶质瘤中DNA修复基因MGMT启动子区甲基化的模式，以及MGMT甲基化与胶质瘤临床病理特征的相关性。研究了细胞周期抑制因子p57KIP2在胶质瘤中的突变情况。 方法：选择经影像学和病理证实的胶质瘤67例和2株胶质瘤细胞株(U251和SK-N-SH)，对照组23例脑膜瘤和12例正常脑组织。用MSP法分析实验组和对照组的MGMY启动子的甲基化情况，分析甲基化与肿瘤分级、年龄、性别、肿瘤大小以及肿瘤部位之间的关系。设计覆盖p57KIP2外显子的6对引物，采用PCR-SSCP法研究实验组和对照组p57KIP2外显子突变情况。 结果：在检测的67例胶质瘤中，27例(40.3％)存在MGMT启动子区甲基化，挫裂伤脑组织(12例)和脑膜瘤(23例)中未检测出MGMT启动子区甲基化。进一步分析MGMT基因启动子区甲基化与患者性别、年龄、肿瘤大小和部位的相关性，发现MGMT基因启动子区甲基化与患者性别、年龄和部位无明显相关性，而和肿瘤大小呈正相关。髓母细胞瘤较其它胶质瘤的甲基化率明显增高。在所有实验样本中未发现p57KIP2基因纯合性缺失。在23例脑膜瘤和12例正常脑组织中均未发现p57KIP2基因外显子突变。胶质瘤中扩增的p57KIP2外显子1出现3例异常泳动条带，占4.48％。p57KIP2外显子2后半段出现1例异常泳动条带，占1.49％。其它引物扩增未发现异常泳动条带。胶质瘤p57KIP2基因突变率与脑膜瘤、正常脑组织相比，无统计学差距(P＞0.05)。 结论：胶质瘤的发生与MGMT基因甲基化有关，可能在胶质瘤的发生发展过程中起重要作用。p57KIP2可能不是主要通过基因突变在胶质瘤的发生发展中起作用，而可能是对其它细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的补充。
王参智[8]2013年在《MGMT、XRCC1基因在脑胶质瘤中的表达及相关性研究》文中研究表明[研究目的]通过免疫组织化学(immunohistochemistry technique IHC)的方法,检测不同级别脑胶质瘤及正常脑组织中MGMT、XRCC1基因的表达情况,分析基因MGMT与XRCC1在不同级别脑胶质瘤及正常脑组织中的表达及其相关性,为脑胶质瘤临床个体化治疗方案的制定提供理论依据。[研究方法]本研究采用免疫组织化学技术,分别检测47例不同级别脑胶质瘤和10例正常脑组织中MGMT及XRCC1的表达情况,所有数据均采用统计学的方法进行比较这两个基因在脑胶质瘤、正常脑组织及其相互间以及在性别、年龄间的表达及其相关性分析。[研究结果]1.47例脑胶质瘤患者中MGMT阳性表达22例,其总体阳性表达率46.81%。其不同级别胶质瘤阳性表达如下：Ⅰ级胶质瘤中阳性率为55.56%(5/9)；Ⅱ级胶质瘤中阳性率为41.67%(5/12)；Ⅲ级胶质瘤中阳性率为42.86%(6/14)；Ⅳ级胶质瘤中阳性率为50.00%(6/12)。Ⅰ级、Ⅳ级胶质瘤中MGMT表达阳性率高于Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤,经统计学分析不同级别胶质瘤之间的MGMT表达差异无统计学意义(P>0.05)。2.47例脑胶质瘤患者中XRCC1日性表达18例,其总体阳性表达率38.30%。其不同级别胶质瘤阳性表达如下：Ⅰ级胶质瘤中阳性率为33.33%(3/9)；Ⅱ级胶质瘤中阳性率为25.00%(3/12)；Ⅲ级胶质瘤中阳性率为50.00%(7/14)；Ⅳ级胶质瘤中阳性率为41.67%(5/12)。Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤中XRCC1表达阳性率低于Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤,经统计学分析不同级别胶质瘤之间的XRCC1表达差异无统计学意义(P>0.05)。3.10例高血压脑出血行内减压手术中切除的正常脑组织标本中MGMT及XRCC1的表达呈阴性或弱阳性,与胶质瘤组织中MGMT及XRCC1表达有显着性差异(P<0.05)。4.47例患者脑胶质瘤组织中MGMT及XRCC1的表达无相关性,与患者性别、年龄间的差异没有统计学意义。[结论]1.不同级别脑胶质瘤MGMT表达率不同,Ⅰ级、Ⅳ级胶质瘤中MGMT表达率有高于Ⅱ级、Ⅲ级胶质瘤的趋势,但经统计学分析不同级别胶质瘤之间的MGMT表达率差异无统计学意义,说明MGMT的表达与胶质瘤恶性程度无相关性。2.不同级别脑胶质瘤XRCC1基因表达率不同,Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤中XRCC1基因的表达率有低于Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的趋势,但经统计学分析不同级别胶质瘤之间的XRCC1表达率差异无统计学意义,说明XRCC1的表达与胶质瘤恶性程度无相关性。3.脑胶质瘤中MGMT和XRCC1表达强度与年龄、性别无关,临床诊疗过程中为病人制定个体化治疗方案时年龄、性别不能作为参考因素。4.MGMT和XRCC1在胶质瘤细胞中的表达无相关性,提示两者在脑胶质瘤的发生、发展中可能没有相互调节的作用。但可以通过MGMT和XRCC1的检测来判断胶质瘤患者的预后及制定更加合理的个性化治疗方案。5.正常脑组织中MGMT和XRCC1的表达均呈阴性或者弱阳性,与不同级别脑胶质瘤中的表达有显着性差异。
姜政[9]2007年在《胶质瘤相关基因Taqman低密度表达谱芯片及DNA甲基化研究》文中研究说明研究背景：基因功能异常分为两大类机制：遗传学机制和表遗传学机制。在遗传学机制中，许多DNA损伤修复基因通过多种修复途径参与了损伤的修复并保持基因组的稳定性，这些基因的改变可能导致疾病或肿瘤的发生。许多研究局限于每次只能对一个RNA样本进行实时定量PCR检测。Taqman低密度表达谱芯片新技术可根据研究需要订制、高灵敏度、高通量同时分析多个样本多个基因的表达。继人类基因组计划圆满完成之后，“人类基因组外遗传计划”正式启动。大部分情况下，人类疾病有半数原因与基因遗传有关，另一半则取决于基因组外遗传变化。基因组外遗传变化被认为是控制基因活动的“开关”。甲基化作为基因组外遗传机制的重要组成部分，是联系基因遗传、环境因素和疾病发生的重要纽带。发现并分析人类基因的甲基化状态，将有助于癌症诊治、甚至在基因变异之前即可预测是否有癌症发生的危险。目前，肿瘤的甲基化研究是国内外研究的热点，但在胶质瘤中的研究相对较少。研究目的：研究基因功能异常的两大类机制：遗传学机制和表遗传学机制中代表性的研究领域：1．在遗传学机制中，通过Taqman低密度表达谱信息分析，从DNA损伤修复基因中选择5个主要DNA损伤修复通路的27个代表性基因，探讨胶质瘤的基因表达特征与临床资料之间的内在联系与规律，高通量、系统的研究可为胶质瘤临床诊断、判断预后等提供更多、更准确的理论依据，为进一步研究其功能奠定了基础。2．在表遗传学机制中，研究肿瘤抑制基因在胶质瘤中的启动子区DNA甲基化和mRNA表达情况，并进一步分析甲基化发生与mRNA表达变化的内在因果联系及其与临床情况之间的关系。初步探讨去甲基化药物对肿瘤抑制基因甲基化和mRNA表达的影响以及对肿瘤细胞凋亡的影响，为去甲基化药物临床用于胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。研究方法：1．临床收集88例原发胶质细胞瘤(WHO分级：Ⅱ级23例，Ⅲ级20例，Ⅳ级45例)和10例正常脑组织标本。所有病人术后均进行5年随访。2．网上在线设计内参基因GAPDH和27个DNA损伤修复基因：直接修复基因(MGMT)，碱基切除修复基因(MPG、MUTYH、NTHL1、OGG1、SMUG1、UNG、XRCC1)，核苷酸切除修复基因(ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、NUDT1)，错配修复基因(MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS2)和双链断裂修复(MRE11A、MUS81、RAD50、RAD51、RAD52、XRCC3、XRCC4、XRCC5)五个损伤修复通路的基因引物和探针，定制微流卡(Micro Fluidic Card，MFC)。3．使用Taqman低密度表达谱芯片技术，于7900HT荧光定量PCR仪上对其中40例不同病理级别原发胶质瘤组织(Ⅱ级10例、Ⅲ级10例、Ⅳ级20例)和10例正常脑组织实时、定量PCR检测27个选定的DNA损伤修复基因以及内参基因mRNA表达情况，并用SDS2.2图像分析软件进行处理，通过△Ct法和2~(-△△Ct)法两种分析方法对最后的结果进行统计学分析。4．结合临床资料分析27个相关DNA损伤修复基因在其中40例不同病理级别原发胶质瘤组织和10例正常脑组织中的mRNA表达情况及各基因在不同性别组和不同年龄组中的表达差异。5．结合病人的术后生存时间，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，log-rank检验比较分析不同基因的mRNA表达水平与患者预后的关系。6．甲基化特异性PCR(methylation specific PCR，MSP)方法，检测LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC等5个肿瘤抑制基因在88例胶质瘤组织、10例正常脑组织的DNA甲基化情况。7．传统的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和SYBGreen实时定量PCR(Real-time PCR)方法，检测5个基因在其中30例胶质瘤(Ⅱ级10例，Ⅲ10例，Ⅳ10例)和10例正常脑组织中的mRNA表达情况，分析5个基因DNA甲基化发生率与其mRNA表达水平之间及与临床资料之间的关系。8．甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC)处理两种胶质瘤细胞株U251和SHG-44 72h前后，RT-PCR和MSP检测5个基因的表达和甲基化状态的变化。通过PI染色，采用流式细胞技术(flow cytometry，FCM)检测5-Aza-dC作用U251和SHG-44细胞株不同时间后对细胞凋亡的影响。研究结果：1．2~(-△△Ct)分析方法结果表明，27个DNA损伤修复基因中与正常脑组织相比有13个DNA损伤修复基因在Ⅱ级，Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中均表达下调，包括ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLH1、MLH3、NTHL1、OGG1、RAD50、SMUG1、XRCC4、XRCC5(P＜0.01)。在13个DNA损伤修复基因中，MLH3基因在Ⅲ级胶质瘤中的表达低于Ⅱ级中的表达，并有显着差异(P＜0.01)；XRCC4基因在Ⅳ级胶质瘤中的表达低于Ⅱ级中的表达，并有显着差异(P＜0.01)。其余14个基因中，MSH2、MSH6、NUDT1和XRCC3基因只在Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤中下调(P＜0.01)；MRE11A和MUSS1基因只在Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中表达下调(P＜0.01)；PMS2、RAD52和XRCC1基因只在Ⅲ级胶质瘤中表达下调(P＜0.01)；UNG基因只在Ⅱ级中表达下调(P＜0.01)。MPG、MSH3、MUTHY和RAD51在正常脑组织、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤中的表达均无明显差异(P＞0.05)。2．27个DNA损伤修复基因在29例男性胶质瘤患者和11例女性胶质瘤患者中的表达无明显差异(P＞0.05)；其在＜40、40-60和＞60岁叁个年龄组中的表达也均无明显差异(P＞0.05)。3．在27个DNA损伤修复基因中，ERCC3、ERCC4、MLH3、MRE11A、NTHL1、RAD50、XRCC4和XRCC5基因表达下调与预后有关(P＜0.05)。4．在88例胶质瘤中，LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC等5个基因启动子区甲基化发生率分别为63.66％、71.50％、86.36％、70.45％和57.95％：而在10例正常脑组织中均未检测到LATS1、LATS2、SLC5A8和TMS1／ASC等4个基因的甲基化发生，PCDH-γ-A11基因甲基化率亦仅为20％。5个基因的甲基化率在Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤中与正常脑组织比较均有显着差异(P＜0.05)，在不同病理级别间部分存在统计学差异。其中SLC5A8基因在Ⅳ级和Ⅱ级胶质瘤中的DNA甲基化率比较有显着性差异(P＜0.05)。LATS1、LATS2和PCDH-γ-A11基因的甲基化率在两性别组间以及在不同年龄组间比较均无统计学差异(P＞0.05)；SLC5A8和TMS1／ASC基因在＜40与＞60岁、40-60岁与＞60岁年龄组间的甲基化率差异均有统计学意义(P＜0.05)。5．LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因在Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤中的mRNA表达与正常脑组织相比均明显下调(P＜0.05)，在不同病理级别间部分存在统计学差异。其中，SLC5A8的mRNA表达在Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤中、TMS1／ASC的mRNA表达在Ⅱ级和Ⅲ级及Ⅱ级和Ⅳ级胶质瘤中的表达均有显着差异(P＜0.05)。LATS1、LATS2和PCDH-γ-A11基因的mRNA表达在两性别组间以及在不同年龄组间比较均无统计学差异(P＞0.05)；SLC5A8的mRNA表达在不同年龄组之间差异均有统计学意义(P＜0.05)，但TMS1／ASC的mRNA表达只在年龄＜40岁和年龄＞60岁组及40岁＜年龄＜60岁和＞60岁组之间有统计学差异(P＜0.05)。6．LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因中各基因发生甲基化的胶质瘤样本中的mRNA的表达水平，明显低于该基因未发生甲基化的胶质瘤样本(P＜0.05)。7．U251和SHG-44细胞株中均检测到LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC基因的甲基化。5μM的5-Aza-dC处理72h可诱导5个基因部分去甲基化，重新激活并显着上调其mRNA的表达。5μM的5-Aza-dC作用于U251胶质瘤细胞株24h、48h和72h后的细胞凋亡率分别为8.99％、24.40％和46.75％，作用于SHG-44胶质瘤细胞株24h、48h和72h后的细胞凋亡率分别为13.85％、32.35％和62.50％，均大于同期DMSO对照组的细胞凋亡率。研究结论：1．ERCC1、ERCC2、ERCC3、ERCC4、MGMT、MLH1、MLH3、NTHL1、OGG1、RAD50、SMUG1、XRCC4、XRCC5等DNA损伤修复基因的表达下调，与胶质瘤的发生密切相关。Taqman低密度表达芯片为多个基因的同时定量表达提供了一种准确、快速、有效的多变量检测技术，可用于发现新的肿瘤相关基因。2．肿瘤抑制基因LATS1、LATS2、PCDH-γ-A11、SLC5A8和TMS1／ASC在胶质瘤中的启动子区高甲基化率，导致其mRNA表达下调。肿瘤抑制基因的甲基化在胶质瘤恶性增殖和抗细胞凋亡过程中发挥重要作用。去甲基化药物有望为胶质瘤的化学治疗提供新的手段。
杨付花[10]2016年在《慢性髓细胞白血病、星形细胞瘤的克隆演化研究》文中提出目前,随着研究的深入,我们对肿瘤的生物学和基因组学的认识也有了改变。要将肿瘤的基因组学研究转化到肿瘤的临床治疗,需要考虑到肿瘤细胞的复杂性以及其动态的演化特征。肿瘤演化过程中不同的肿瘤细胞克隆竞争空间和资源,最终具有生长优势的克隆形成新的肿瘤亚群。肿瘤以不同的时间和速度演化进展,在任何一个患者中其克隆结构、基因型和表型都随着时间改变。肿瘤克隆演化的研究除了使我们对肿瘤的发生发展有更全面的了解,同时也有着重要的应用价值,比如发现对治疗更有预测价值的标志以提高个体化治疗效果、以及阻止肿瘤对药物的治疗抵抗。而肿瘤克隆演化的特征,如克隆结构或驱动突变等,或可以用于肿瘤预后的判定。慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种骨髓细胞增殖异常的血液疾病。该疾病存在特征性的9号和22号染色体的易位t(9;22)(q34;q11),即费城染色体(Philadelphia chromosome,Ph),在分子水平上形成BCR/ABL1融合基因。该融合基因编码的蛋白具有酪氨酸激酶活性,在无生长因子的情况下能够促使细胞增殖。Ph染色体是造成CML肿瘤表型的主要染色体畸变,几乎所有的CML均存在BCR/ABL1融合基因。针对BCR/ABL1的靶向治疗能够使的CML患者缓解,但是Ph染色体的形成机制以及靶向治疗后Ph染色体克隆演化还不是很清楚。胶质瘤(glioma)是一类起源于胶质细胞的肿瘤,星形细胞瘤(astrocytoma)是最常见的神经上皮性肿瘤。低级别的星形细胞瘤一般生长缓慢,但是经过一段时间会进展为高级别的恶性肿瘤,引起肿瘤的复发从而降低整体生存率。星形细胞瘤手术切除后极易复发,且恶性程度增高,但复发和恶性程度增高的机制尚不明确。大多数星形细胞瘤患者死于肿瘤的复发和恶变,研究其细胞遗传水平的克隆演化对认识星形细胞瘤的生物学行为、进行针对性的治疗有重要意义。目的:肿瘤的克隆演化是肿瘤的一个重要特征。为了研究克隆演化对于疾病的进展以及治疗的影响,本研究选取了两个肿瘤类型:慢性髓细胞白血病和星形细胞瘤。前者存在特征性的染色体异常即费城染色体;后者的疾病特征为手术切除后的复发恶变。通过全基因组的测序,一是研究CML中BCR/ABL1融合基因的形成机制以及针对Ph靶向治疗后的克隆演化;二是通过研究星形细胞瘤的克隆演化,探寻影响该肿瘤复发恶变的分子遗传因素。方法:本研究选取了一例CML患者,该患者确诊CML后清除其自身骨髓行全相合异体造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)(供体为患者姐姐),疾病进入Ph(-)慢性期;后患者发生急淋变,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验显示BCR/ABL1(+);对患者进行针对Ph染色体的靶向治疗后疾病得以缓解,Ph染色体消失。本研究收集了该患者姊妹间全相合异体造血干细胞移植后慢性期(Ph-)、急变期(Ph+)以及针对Ph靶向治疗后再缓解期的骨髓组织活检样本,并获得患者的皮肤活检组织作为正常对照。本研究选取一例星形细胞瘤患者,该患者初诊时肿瘤组织病理检测显示右侧额叶星形细胞瘤(WHO II级),后患者肿瘤复发,组织病理检测显示右额叶胶质母细胞瘤合并局灶间变型星形细胞瘤(WHO IV级)。收集患者初诊肿瘤组织样本(星形细胞瘤WHO II级)以及复发后肿瘤组织样本(WHO IV级),并收集患者的外周血样品作为正常对照。对CML患者的骨髓组织皮肤组织的DNA和星形细胞瘤患者的肿瘤组织和外周血DNA进行全基因重测序(测序深度≥50×)。首先将测序数据利用BWA软件对比到参考基因组(UCSC hg19)上,应用samtools、control-FREEC、mu Tect、Strelka、crest软件分析样品存在的遗传学改变,包括点突变、拷贝数变异(copy number variation,CNV)、插入/缺失(insertion-deletion,INDEL)和染色体易位;并与对照比较,基于肿瘤样本的体细胞单位点突变和拷贝数的位点集合,应用Ex PANd S软件分析肿瘤样品存在的亚克隆结构,包括亚克隆的数目、亚克隆大小以及每个亚克隆中包含的突变。应用Sci Clone软件对成对样本进行亚克隆分析。结果:本研究选取的CML患者,在行姊妹间全相合异体骨髓移植后疾病进入慢性期(Ph-),后发生急变(Ph+),针对Ph靶向药物治疗后疾病再缓解。分析测序数据发现骨髓样品中存在一系列的SNPs、INDEL、CNVs和SVs,急变期(Ph+)比慢性期(Ph-)出现更多的遗传学异常,经分析,急变期费城染色体的出现来源于患者本身(骨髓受体)。在靶向治疗后一些急变期特有的遗传异常随着Ph染色体的消失而消失;患者Ph(+)的急变期和皮肤组织样本中独有DNA修复基因BRIP1框移缺失突变;供体骨髓和患者的骨髓样本共同存在BCR基因上的一些插入/缺失,仅患者Ph(+)的急变期存在BCR形成融合基因的断裂点。Ex PANd S软件在Ph(+)急变期和Ph(-)缓解期均有8个亚克隆结构,克隆进化的发生图均为“树状”结构。本研究中选取的星形细胞瘤患者,初诊时为星形细胞瘤WHO II级,复发时为胶质母细胞瘤合并局灶间变型星形细胞瘤WHO IV级。对其肿瘤组织DNA进行测序、数据分析,发现初诊和复发阶段肿瘤均存在基因NOTCH和ATRX的错义突变;初诊时存在基因TP53的杂合终止突变,复发时存在基因TP53的纯合终止突变以及基因IDH1的杂合错义突变;同时复发肿瘤中有较多的染色体易位。Ex PANd S软件分析显示,在初诊和复发阶段肿瘤分别有4和3个亚克隆结构,初诊阶段的克隆进化的发生图为“树状”结构,而复发阶段克隆进化的发生图为“并行”结构,提示该阶段肿瘤克隆存在较高的异质性。结论:在该CML患者复发、靶向治疗的疾病进展过程中,BCR/ABL1融合基因为特征性的克隆改变,随着其产生而出现一些列继发性的突变或者染色体畸变,针对其靶向治疗后以一些急变期特有的遗传学异常随着Ph染色体的消失而消失;基因BCR存在微缺失/突变的前提下,BRIP1等DNA修复基因的异常最终导致BCR/ABL1融合基因的形成。对于星形细胞瘤,特异性的突变可用于肿瘤分子分型的依据,但IDH1与星形细胞瘤预后的关系值得进一步探讨;肿瘤组织亚克隆结构的分析可以为肿瘤的临床预后判断和靶向治疗提供分子遗传学依据;放疗、化疗可能对肿瘤克隆演化产生选择压力,从而使TP53突变的克隆产生选择优势。星形细胞瘤复发阶段克隆的异质性增强,研究结果提示初次手术后的放疗要慎重。
参考文献：
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[2]. 不同胶质瘤细胞辐射后基因组学分析及自噬与凋亡相互作用分子机制研究[D]. 王海龙. 北京理工大学. 2014
[3]. DNA修复基因MGMT启动子区过甲基化与脑胶质瘤[D]. 高薇. 苏州大学. 2005
[4]. 人脑胶质细胞瘤恶性进展相关基因表达谱中DNA修复基因分析[J]. 陈寒春, 兰青, 王爱东, 董军, 黄强. 中华神经外科疾病研究杂志. 2004
[5]. MORC2在人脑胶质瘤中表达及作用研究[D]. 张文斐. 武汉大学. 2016
[6]. ERCC2 rs13181基因多态性与胶质瘤易感性关系及相关机制研究[D]. 高翔. 南方医科大学. 2016
[7]. 胶质瘤相关基因甲基化与突变的实验研究[D]. 路华. 昆明医学院. 2004
[8]. MGMT、XRCC1基因在脑胶质瘤中的表达及相关性研究[D]. 王参智. 昆明医科大学. 2013
[9]. 胶质瘤相关基因Taqman低密度表达谱芯片及DNA甲基化研究[D]. 姜政. 山东大学. 2007
[10]. 慢性髓细胞白血病、星形细胞瘤的克隆演化研究[D]. 杨付花. 天津医科大学. 2016
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