利用小分子抑制剂建立体内胚胎来源猪多能干细胞的研究

论文摘要

胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）是一种依赖于一定的体外条件,能够稳定的自我更新,并保持多能性的细胞类型,一般来源于植入前囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）。众所周知胚胎干细胞具有能够无限期增殖的能力,并且可以分化为成体所有类型的细胞,这使得它们对药物开发和再生医学的研究具有特别重要的价值。不同状态的胚胎干细胞具有不同的多能性特征:Na?ve多能性状态,具有全面的分化潜能和嵌合体贡献能力,以小鼠胚胎干细胞为代表;Primed多能性状态,具有受限的分化能力和嵌合体贡献能力,以人类或灵长类胚胎干细胞为代表。而在其他大动物例如猪等物种中,Na?ve多能性状态的胚胎干细胞仍然未能成功获得。第一株小鼠胚胎干细胞系在含有胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS）和饲养层细胞的条件下建立,还有一种方式是通过添加白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor,LIF）来促进小鼠胚胎干细胞系的建立。然而,在以上条件下,只有129/SV品系的小鼠胚胎能够有效的建立起胚胎干细胞系,而其他大多数品系的小鼠胚胎干细胞系的建立仍然存在困难。直到2008年,人们利用含有MEK和GSK3抑制剂的2i培养体系,从许多其他通常被认为无法成功获得干细胞系的小鼠品系中建立了胚胎干细胞系。同时,利用该体系也可成功从大鼠胚胎培养获得大鼠胚胎干细胞系。此外,通过筛选能够维持OCT4远端增强子活性的因子,建立了含LIF、Activin A和5种不同激酶抑制剂的5i/L/A培养体系,该体系可支持人Na?ve胚胎干细胞的自我更新,并能够将Primed状态的人胚胎干细胞转化为Na?ve多能性状态。然而,这些体系似乎对小鼠或人以外的其他物种的Na?ve多能性胚胎干细胞的建立没有效果。2017年,通过化学筛选,建立了一种添加了human LIF、CHR99021、（S）-（+）-dimethindene maleate（DiM）和minocycline hydrochloride（MiH）的培养基,称为LCDM,该条件下可同时从人和小鼠胚胎获得具有参与胚胎和胚外组织嵌合体发育能力的多能性干细胞系,这些细胞被称为扩展多能干（Extended Pluripotent Stem,EPS）细胞,此研究开辟了从不同哺乳动物建立具有嵌合体能力的多能干细胞的途径。猪不仅是主要的肉食来源动物,而且在代谢、免疫和生理上与人类非常相似,是生物医学研究理想的动物模型,此外由于其器官与人类器官大小相近,猪也是异种器官移植的潜在供体。因此,猪多能干细胞（porcine Pluripotent Stem Cells,pPSCs）的建立与培养已成为科学家们的研究热点。然而,目前已发表的猪多能干细胞系都被证明是类胚胎干细胞系,这些细胞系大多表现出有限的多能性特征,无法形成畸胎瘤或生殖系嵌合体。因此,真正的猪多能干细胞系的建立与获得是十分值得期待的。为了从猪胚胎中建立多能干细胞人们已经做了许多努力。虽然尚未获得真正的猪胚胎干细胞系,但已从各种不同来源的猪胚胎中建立获得了许多假定的猪多能性干细胞系。然而,与小鼠胚胎干细胞相比,这其中大多数细胞系的多能性都差强人意,具体表现为这些猪多能干细胞注入裸鼠皮下无法畸胎瘤或者嵌合后不能参与到生殖系的发育中。先前的研究表明,不同来源的猪胚胎干细胞系表现出克隆形态扁平的特征,并且其体外和体内的分化能力有限。它们在细胞多能性分类上属于Primed状态,而非Na?ve状态。据此,本研究采用猪体内6.5天囊胚,利用LCDM体系,尝试建立猪多能性干细胞,并通过小样本高通量测序分析LCDM体系获得的猪多能性细胞及小鼠、人EPS细胞中多能性基因表达模式和相关信号通路活性状态。我们获得的结果表明:（1）在不同体系下利用猪体内胚胎建立的多能性干细胞系均取得较好的效果。其中KOFL培养体系下,在接种2枚猪体内胚胎的情况下成功获得了1株猪多能干细胞系PeNK6,获得的细胞克隆形态与人胚胎干细胞相似,呈现出一种扁平的单层细胞的状态,碱性磷酸酶（AP）检测的结果表明该细胞系呈阳性的结果,即该细胞系具有多能性细胞的基本特征,免疫荧光检测表达核心转录因子OCT4,SOX2,NANOG,定量PCR检测核心转录因子的表达结果与免疫荧光结果相一致。（2）在LCDM培养体系下,采用MEF或STO作为饲养层,对猪多能性干细胞建系效率不存在明显的差别。获得猪多能干细胞系,克隆形态呈扁平状,但更加紧密,呈AP阳性,表达核心转录因子OCT4,SOX2,NANOG,同时细胞还表达SSEA3和SSEA4。具有体外分化的能力。（3）获得的细胞系进行了小样本高通量测序分析,对小鼠,人和猪三个物种获得的EPS/PSC中Na?ve和Primed相关基因的表达进行了比较分析,发现小鼠,人和猪中LCDM体系下建立的EPS细胞或PSCs并不同于ESCs细胞或ICM细胞的多能性特征,虽然都会有核心转录因子的表达,但部分Na?ve和Primed相关基因的表达还是会存在差异。此外,对多能性信号通路激活情况也进行了比较分析,结果显示在LCDM培养体系中猪多能性干细胞中TGFβ信号通路处于高活性状态,这可能是影响该体系下获得猪多能性干细胞系多能性的原因之一。据此,我们在LCDM培养基中添加TGFβ信号通路抑制剂SB431542。结果显示,与pPSC-LCDM细胞系相比优化体系培养的细胞不仅核心转录因子的表达有所提高,细胞的增殖能力也显著性增强。进一步,通过小样本高通量测序,我们建立了ICM向pPSC-LCDMs转变过程中的基因表达图谱。结果显示ICMs,BOs（blastocyst outgrowths）和PSCs的转录组具有较大差异,在胚胎接种后第1天,转录组即发生较大变化。结果显示ICMs,BOs和PSCs的转录组具有较大差异,且BO5是获得多能性干细胞过程中多能性变化的关键转折点。通过以上的结果,我们获得以下结论:（1）在LCDM体系下,利用猪体内胚胎建立猪多能性干细胞系的效率较高,建系效率可达50%左右,而且使用MEF或STO对建系效率没有显著影响。（2）LCDM培养体系可获得具有一定多能性的猪胚胎干细胞系。（3）在LCDM体系下抑制TGFβ信号通路可有效提高猪多能性细胞系核心转录因子的表达,并促进细胞增殖。（4）基因表达图谱分析表明,ICM向猪多能性细胞转变过程中的ICMs、BOs和PSCs转录组具有较大差异。并且在ICM到pPSCs过程中,涉及到的MAPK,JAK/STAT,TGFβ以及WNT等信号通路可能是影响猪胚胎干细胞系建立及多能性的关键信号通路。

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摘要

英文摘要

1 前言

1.1 干细胞的定义与特性

1.2 干细胞分类

1.2.1 干细胞的来源和发育阶段

1.2.2 干细胞的发育潜力

1.3 干细胞研究的进展

1.3.1 进展概述

1.3.2 猪胚胎干细胞的建立

1.3.3 影响干细胞建系及培养的因素

1.3.4 干细胞评估标准

1.4 干细胞状态分级与调控通路

1.4.1 干细胞多能性分级

1.4.2 多能性涉及的信号通路

1.4.3 干细胞培养中小分子抑制的应用

1.5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物和材料

2.1.2 主要仪器和设备

2.1.3 主要试剂和试剂盒

2.1.4 常用试剂及配制方法

2.1.5 主要分析软件及数据库

2.2 实验方法

2.2.1 猪体外受精胚胎获取

2.2.2 猪体内胚胎获取

2.2.3 细胞培养

2.2.4 测序样品收集及高通量数据分析

2.2.5 生物信息学分析

2.2.6 多能性鉴定

2.2.7 统计分析

3 结果与分析

3.1 从猪体内胚胎中分离培养获得猪多能性干细胞

3.1.1 利用KOFL体系建立猪体内胚胎来源的多能性干细胞

3.1.2 PeNK6 细胞的多能性鉴定

3.1.3 PeNK6 细胞在LCDM体系下的转变

3.1.4 PeNK6-LCDMs与 PeNK6 多能性比较分析

3.2 利用LCDM培养体系从体内胚胎建立PPSC-LCDMS

3.2.1 不同浓度CHIR99021 添加及不同饲养层培养对pPSC-LCDMs建系效率的影响..

3.2.2 pPSC-LCDMs多能性鉴定

3.2.3 pPSC-LCDMs分化能力的检测

3.3 多能性相关基因在PPSC-LCDMS及人和小鼠EPS中表达模式分析

3.4 PPSC-LCDMS与人和小鼠EPS信号通路活性状态分析

3.5 TGFΒ信号通路抑制对PPSC-LCDMS多能性及增殖能力的影响

3.5.1 SB431542 添加对TGFβ信号通路的抑制

3.5.2 SB431542 添加对细胞倍增时间的影响

3.6 PPSC-LCDMS建立过程中基因表达网络分析

3.6.1 ICM转变至pPSCs过程中的基因表达图谱

3.6.2 ICM到 pPSCs过程渐变的分子转变

3.6.3 ICM到 pPSCs过程中多能性相关信号通路的变化

4 讨论

4.1 体内胚胎建立猪多能性干细胞

4.2 猪多能性干细胞多能性状态分析

4.3 猪多能性干细胞信号通路分析

4.4 猪多能性干细胞培养体系的优化

4.5 猪多能性干细胞建立过程中的基因表达谱的变化

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张雪

导师: 刘忠华

关键词: 小样本高通量测序,多能性

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北农业大学

分类号: Q813

总页数: 71

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