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胡卢巴植物薯蓣皂素合成的前体路径鉴定研究

2020-12-08阅读(314)

胡卢巴植物薯蓣皂素合成的前体路径鉴定研究

论文摘要

薯蓣皂素（Diosgenin）作为一种药用价值极高的三萜类次生代谢物,需求量极大,但传统的提取方法不仅繁琐复杂,且污染严重,合成生物学的发展,为薯蓣皂素的合成提供了新思路。目前薯蓣皂素在植物体内的合成通路尚未完全解析,其生源途径是以胆固醇（cholesterol）还是谷甾醇（sitosterol）为前体仍存在争议。药用植物胡卢巴（Trigonella foenum-graecum L.）为薯蓣皂素合成植物,本研究以来源于中国山西省的胡卢巴植物为研究材料,旨在解析薯蓣皂素的生源途径。为实现此研究目标,本论文分别从植物生理和分子生物学两个层次开展了下述实验:1、在生理方面,利用两种酶抑制剂（lovastatin和fosmidomycin）处理胡卢巴小苗,抑制其体内薯蓣皂素合成的上游通路,然后人为添加胆固醇或谷甾醇,分析它们对薯蓣皂素生物合成的影响;2、在分子层面,本研究从胡卢巴植物中分离了特异存在于谷甾醇合成途径的亚甲基转移酶（Sterol 24-C-methyltransferase1,SMT1）基因,利用基因编辑技术将其失活,从而达到谷甾醇合成阻断效果,并进一步研究此基因编辑事件对薯蓣皂素生物合成的影响。上述实验的开展取得的结果如下:1.本论文分析了胡卢巴小苗中薯蓣皂素合成的空间分布特征,发现了该成分主要积累于该植物叶器官;进一步基因表达分析显示其合成途径上下游基因呈现复杂而明显不同的组织表达特征,说明胡卢巴植物中薯蓣皂素整条链的生物合成,可能由不同植物组织共同参与协作完成。2.经磷铵霉素处理的胡卢巴幼苗,MEP（Methylerythritol pathway）途径受到抑制,薯蓣皂素含量有所提高;经洛伐他汀处理的胡卢巴幼苗,MVA（Mevalonic pathway）途径受到抑制,薯蓣皂素含量受到抑制,且抑制效果显著。因此推测:薯蓣皂素主要经由MVA途径合成。3.在洛伐他汀处理胡卢巴幼苗的第72 h时,添加胆固醇或谷甾醇,发现胆固醇可使合成受到抑制的薯蓣皂素含量有所恢复,而谷甾醇对其恢复的效果更明显;在抑制剂处理胡卢巴幼苗的同时添加胆固醇或者谷甾醇,分析薯蓣皂素的变化情况,得到了与上述一致的实验结果。所以推测:胆固醇和谷甾醇可能均为薯蓣皂素的生源物质,而谷甾醇更有可能为薯蓣皂素的主要合成前体。4.利用高通量第二代测序技术,对洛伐他汀处理胡卢巴幼苗第72 h的样品进行转录组测序,获得了 43.29 G数据,组装得到47953 Unigenes,其中37749 Unigenes得到了功能注释。根据FPKM值分析差异基因的表达,发现虽然该时间点薯蓣皂素含量受到明显抑制,但薯蓣皂素合成通路上主要基因的表达量并无显著差异,说明抑制剂是通过抑制酶活性而并非通过影响基因表达水平下调了薯蓣皂素的生物合成。5.克隆了胡卢巴中的SMT1基因,利用大肠杆菌E.coli原核表达系统,进行体外酶促反应,遗憾未能确认该SMT1的生化功能;利用CRISPRCas9基因编辑技术以及胡卢巴的发根系统,通过植物转基因,进行SMT1在薯蓣皂素合成中的功能探究,但目前阶段因尚未获取阳性发根材料,后续实验有待进行。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 引言
  •   1.1 三萜类化合物
  •     1.1.1 萜类化合物的生物合成途径
  •   1.2 抑制剂在萜类化合物生物合成研究中的应用
  •   1.3 合成生物学在植物次生代谢物研究中的应用
  •   1.4 薯蓣皂素
  •     1.4.1 薯蓣皂素的药理作用
  •     1.4.2 薯蓣皂素的工业提取方法
  •     1.4.3 薯蓣皂素的生物合成路径
  •   1.5 药用植物胡卢巴Trigonella foenum-graecum Linn
  •     1.5.1 胡卢巴的药用价值
  •     1.5.2 胡卢巴在薯蓣皂素生物合成研究中的应用
  •   1.6 本课题研究意义及内容
  •     1.6.1 研究意义
  •     1.6.2 研究内容
  •     1.6.3 技术路线
  • 第2章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 实验试剂
  •     2.1.3 主要菌株及载体
  •     2.1.4 主要仪器
  •     2.1.5 主要培养基
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 洛伐他汀和磷铵霉素溶液的配置
  •     2.2.2 抑制剂处理胡卢巴幼苗
  •     2.2.3 薯蓣皂素的提取以及检测
  •     2.2.4 胡卢巴的体外“饲喂”实验
  •     2.2.5 胡卢巴总RNA的提取以及cDNA链的合成
  •     2.2.6 实时荧光定量PCR （RT-qPCR）
  •     2.2.7 转录组测序文库构建及分析
  •     2.2.8 质粒提取
  •     2.2.9 琼脂糖凝胶回收
  •     2.2.10 大肠杆菌感受态制备及转化
  •     2.2.11 发根农杆菌感受态制备及转化
  •     2.2.12 阳性菌落PCR鉴定
  •     2.2.13 原核表达载体构建
  •     2.2.14 大肠杆菌的诱导表达
  •     2.2.15 蛋白提取及其纯化
  •     2.2.16 体外酶促反应及产物检测
  •     2.2.17 CRISPR Cas9基因敲除载体构建
  •     2.2.18 发根农杆菌介导法转化胡卢巴
  •     2.2.19 阳性发根鉴定
  • 第3章 结果与分析
  •   3.1 胡卢巴中薯蓣皂素合成部位的研究
  •     3.1.1 根、茎、叶中薯蓣皂素含量的分析
  •     3.1.2 根、茎、叶中基因表达情况分析
  •   3.2 抑制剂对薯蓣皂素合成影响的研究
  •     3.2.1 磷铵霉素处理胡卢巴幼苗
  •     3.2.2 洛伐他汀处理胡卢巴幼苗
  •   3.3 胡卢巴转录组测序质量及结果分析
  •     3.3.1 总RNA质量评估
  •     3.3.2 测序数据质量评估
  •     3.3.3 测序组装结果统计
  •     3.3.4 Unigenes功能注释
  •     3.3.5 GO和KOG功能分类
  •     3.3.6 KEGG功能分析
  •     3.3.7 Unigene差异表达分析
  •     3.3.8 薯蓣皂素代谢通路基因表达分析
  •     3.3.9 荧光定量PCR结果
  •   3.4 “饲喂”胆固醇和谷甾醇对薯蓣皂素合成影响的研究
  •     3.4.1 洛伐他汀处理胡卢巴72 h之后添加胆固醇和谷甾醇
  •     3.4.2 洛伐他汀处理胡卢巴的同时“饲喂”胆固醇和谷甾醇
  •   3.5 胡卢巴亚甲基转移酶SMT1的功能验证
  •     3.5.1 SMT1原核表达载体构建
  •     3.5.2 SMT1蛋白诱导表达
  •     3.5.3 SMT1体外功能验证
  •     3.5.4 植物体内SMT1功能验证
  • 第4章 讨论与展望
  •   4.1 结果讨论
  •     4.1.1 胡卢巴中薯蓣皂素合成部位的研究
  •     4.1.2 抑制剂对胡卢巴中薯蓣皂素合成影响的研究
  •     4.1.3 通过转录组数据库挖掘薯蓣皂素合成相关基因
  •     4.1.4 “饲喂”胆固醇和谷甾醇对薯蓣皂素合成影响的研究
  •     4.1.5 胡卢巴亚甲基转移酶SMT1的功能验证
  •   4.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 周子琳

    导师: 章焰生

    关键词: 薯蓣皂素,合成前体,胆固醇,谷甾醇,胡卢巴

    来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,生物学,环境科学与资源利用

    单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)

    分类号: Q943.2;X503.23

    DOI: 10.27603/d.cnki.gkhzs.2019.000040

    总页数: 94

    文件大小: 5805K

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