DNAJA3和RNF5抑制口蹄疫病毒复制的机制

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的主要感染牛、羊和猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,严重危害世界畜牧业、社会政治和经济逾百年的动物传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为法定必报疫病,被我国列为一类动物疫病。FMDV结构蛋白VP1最易暴露在病毒衣壳表面,含有主要抗原决定簇和受体结合位点RGD,在病毒诱导抗体应答、吸附和侵入过程中发挥重要作用,然而,关于VP1与宿主蛋白相互作用及其调控FMDV复制的机制仍不清楚。因此,本课题筛选出与FMDV VP1互作的宿主蛋白DNAJA3和E3泛素连接酶RNF5,并阐明了抑制FMDV复制的背后机制,内容如下:（1）DNAJA3抑制FMDV复制的机制研究通过酵母双杂交技术鉴定出了与VP1结合的宿主蛋白DNAJA3,免疫共沉淀（CO-IP）和共聚焦试验证实了DNAJA3与VP1的内源性相互作用。质粒截短试验和丙氨酸扫描试验结果表明DNAJA3的J结构域[氨基酸（aa）1–168]和VP1的赖氨酸208（K208）位点对DNAJA3与VP1相互作用至关重要。过表达DNAJA3显著抑制FMDV的复制,而沉默DNAJA3对FMDV的复制产生相反的作用。构建出K208A突变重组病毒,在病毒水平上进一步证实了VP1的K208位点对DNAJA3引起的病毒滴度降低是至关重要的。进一步机制研究揭示,DNAJA3通过与LC3相互作用促进溶酶体途径的激活,诱导VP1发生溶酶体降解。同时,VP1通过抑制IRF3的磷酸化、二聚化和核转移抑制IFN-β信号通路。DNAJA3的过表达显著减弱VP1介导的对IFN-β信号通路的抑制作用,而这种抑制作用在DNAJA3基因敲除细胞中显著增强。与DNAJA3正常细胞相比,Poly（I:C）诱导的IRF3磷酸化在DNAJA3敲除细胞中也较低。（2）E3泛素连接酶RNF5抑制FMDV复制的机制研究本研究发现FMDV感染在体内外均可上调E3泛素连接酶RNF5,过表达试验和SiRNA干扰试验结果表明RNF5抑制FMDV的复制,并且RNF5抑制FMDV复制依赖其具有E3泛素连接酶活性的第42位半胱氨酸。进一步机制研究表明,RNF5通过蛋白酶体途径特异性的降解VP1。免疫共沉淀试验结果表明RNF5通过直接与FMDV VP1相互作用,介导其多聚泛素化降解,此外,RNF5不仅能降解FMDV VP1,对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）、塞内卡病毒（Seneca Valley Virus,SVA）和肠道病毒71（Enterovirus 71,EV71）的VP1也同样具有降解作用,而且该降解过程依赖于RNF5的E3连接酶活性。总之,本研究揭示了宿主蛋白DNAJA3在宿主抗病毒反应中的新功能,通过诱导溶酶体途径降解VP1,并削弱VP1对IFN-β信号通路的抑制作用;并揭示了E3泛素连接酶RNF5通过泛素化降解VP1,从而抑制FMDV复制的分子机制,同时,RNF5对一些微RNA病毒科病毒具有广谱抗病毒作用,为设计高效疫苗候选株（或抗原）提供了理论依据。

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摘要

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英文缩略表

第一章绪论

1.1 口蹄疫病毒

1.1.1 口蹄疫病毒的结构和功能

1.1.2 FMDV抑制天然免疫的研究进展

1.1.3 FMDV与宿主互作及其调控机制的研究进展

1.2 热休克蛋白

1.2.1 主要热休克蛋白家族及其在免疫调节中的作用

1.2.2 热休克蛋白在病毒方面的相关研究

1.3 E3泛素连接酶

1.3.1 E3泛素连接酶在RIG-I信号通路中的研究进展

1.3.2 E3泛素连接酶在抗病毒中的研究进展

1.3.3 E3泛素连接酶RNF5的研究进展

1.4 本研究的目的和意义

第二章 DNAJA3与VP1 互作抑制FMDV复制的机制研究

2.1 材料和方法

2.1.1 细胞与病毒

2.1.2 试剂和抗体

2.1.3 质粒构建

2.1.4 溶液的配制

2.1.5 主要仪器设备

2.1.6 细胞转染

2.1.7 酵母双杂交技术

2.1.8 免疫共沉淀试验（Co-IP）

2.1.9 共聚焦试验

2.1.10 用CRISPR/Cas9 系统构建DNAJA3 基因敲除的PK-15 细胞系

2.1.11 Western blotting分析

2.1.12 RNA的提取和反转录

2.1.13 蛋白酶体、溶酶体和凋亡通路抑制剂试验

2.1.14 RNA干扰试验

2.1.15 双荧光报告试验

2.1.16 病毒滴度测定

2.1.17 细胞活力测定

2.1.18 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.1.19 统计学分析

2.2 试验结果

2.2.1 酵母双杂交筛选与VP1相互作用的宿主蛋白

2.2.2 酵母共转化验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用

2.2.3 免疫共沉淀试验验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用

2.2.4 激光共聚焦试验验证DNAJA3与FMDV VP1 的相互作用

2.2.5 DNAJA3与FMDV VP1 相互作用的区段筛选

2.2.6 VP1与DNAJA3 互作位点的筛选

2.2.7 VP1与DNAJA3 的内源性互作

2.2.8 VP1与DNAJA3 互作的关键位点

2.2.9 过表达DNAJA3对FMDV复制的影响

2.2.10 筛选沉默DNAJA3 效率最好的干扰RNA

2.2.11 下调DNAJA3对FMDV复制的影响

2.2.12 DNAJA3在BHK-21和PK-15 细胞上对FMDV复制的影响

2.2.13 构建DNAJA3敲除细胞系

2.2.14 DNAJA3-KO细胞对FMDV复制的影响

2.2.15 DNAJA3对VP1 蛋白的影响

2.2.16 DNAJA3对FMDV其他蛋白的降解情况

2.2.17 DNAJA3对VP1 半衰期的影响

2.2.18 DNAJA3 降解VP1 的通路

2.2.19 细胞活力的检测

2.2.20 DNAJA3 降解VP1 的关键区域

2.2.21 DNAJA3对细胞自噬的影响

2.2.22 DNAJA3影响溶酶体通路的机制

2.2.23 DNAJA3与LC3 互作区段

2.2.24 DNAJA3诱导自噬溶酶体通路的关键区域

2.2.25 VP1对IFN-β信号通路的影响

2.2.26 VP1对IFN-β信号通路影响的机制

2.2.27 VP1对IRF3磷酸化的影响

2.2.28 VP1对IRF3二聚体的影响

2.2.29 VP1对IRF3核转移的影响

2.2.30 过表达DNAJA3在VP1对IFN-β信号通路中的作用

2.2.31 敲除DNAJA3在VP1对IFN-β信号通路中的作用

2.2.32 DNAJA3和VP1对IFN-β及其下游ISGs基因表达的影响

2.2.33 内源性DNAJA3对VP1 抑制IRF3 磷酸化的影响

2.3 讨论

第三章 RNF5 抑制FMDV复制的机制研究

3.1 材料和方法

3.1.1 细胞与病毒

3.1.2 试剂和抗体

3.1.3 质粒构建

3.1.4 溶液的配制

3.1.5 主要仪器设备

3.1.6 细胞转染

3.1.7 免疫共沉淀试验（Co-IP）

3.1.8 共聚焦试验

3.1.9 Western blotting分析

3.1.10 RNA的提取和反转录

3.1.11 RNA干扰试验

3.1.12 病毒滴度测定

3.1.13 细胞活力测定

3.1.14 统计学分析

3.2 试验结果

3.2.1 FMDV感染对RNF5 的影响

3.2.2 过表达RNF5对FMDV复制的影响

3.2.3 检测SiRNF5的干扰效果

3.2.4 下调RNF5对FMDV复制的影响

3.2.5 RNF5 E3 连接酶活性对FMDV复制的影响

3.2.6 RNF5对FMDV蛋白的影响

3.2.7 RNF5对VP1的影响

3.2.8 RNF5对VP1半衰期的影响

3.2.9 FMDV感染细胞中RNF5对VP1 病毒蛋白的影响

3.2.10 RNF5降解VP1的通路研究

3.2.11 RNF5降解VP1的机制研究

3.2.12 VP1与RNF5互作区段研究

3.2.13 VP1与RNF5的亚细胞定位

3.2.14 RNF5与FMDV VP1 内源性共定位情况

3.2.15 RNF5对VP1蛋白泛素化影响

3.2.16 RNF5 对微RNA病毒科其他病毒VP1 蛋白的影响

3.3 讨论

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张伟

导师: 马军武

关键词: 口蹄疫病毒

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家重点研发计划项目(2017YFD0501103),国家自然科学基金(31602090和31672585),甘肃省青年学者科学基金(1606RJYA280),中央公益科研院所基础研究基金(1610312017003和1610312016013)

分类号: S852.65

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000060

总页数: 90

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