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CRISPR-Cas9系统对亚麻FAD2基因定点编辑及功能分析

2020-12-08阅读(816)

CRISPR-Cas9系统对亚麻FAD2基因定点编辑及功能分析

论文摘要

油用亚麻（Linseed）作为世界十大油料作物之一,其籽粒当中的脂肪酸含量丰富,种类较多,用途广泛,商业价值较高,其栽培历史悠久,目前我国亚麻产量居于世界第二位。亚麻油脂中的不饱和脂肪酸含有一个或多个多不饱和双键,含不饱和双键越多,其稳定性就越差,油脂越容易被氧化,不利于储存、运输以及实际应用,因此,提高油脂的稳定性至关重要。脂肪酸代谢中控制油酸脱氢生成多不饱和亚油酸的△12-脂肪酸去饱和酶（FAD2）则是控制代谢途径的关键酶,本实验运用CRISPR技术编辑油用亚麻“陇亚10号”的FAD2基因,利用组织培养法和花粉管通道法分别进行遗传转化。通过控制FAD2酶的合成,进而控制脂肪酸代谢途径,改良脂肪酸组分。此外,本文还分别测试了200份来自43个国家的优质亚麻种子中脂肪酸的组成与含量,进行统计分析;并结合这200份材料通过全基因组测序获得的多个SNP位点进行全基因组关联分析,利用分子标记进行亚麻遗传多样性研究,发掘与亚麻脂肪酸去饱和相关的候选基因。主要研究结果如下:1.采用Golden Gate cloning法构建针对“陇亚10号”FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为pYLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌GV3101中。2.通过组织培养法获得了潮霉素抗性愈伤材料122份,其中83份为可PCR分别扩增出潮霉素抗性基因以及两个目标片段的阳性愈伤组织。根据测序结果可知:编号为FAD2B-A5的植株,靶位点处发生1bp的删除;编号为FAD2B-5的植株的靶位点处发生1碱基插入;编号为FAD2B-B4和FAD2B-14的植株在靶位点前发生1碱基的替换;成功的编辑了“陇亚10号”的FAD2基因,FAD2B-A5突变材料的蛋白质序列及空间结构均发生明显改变。3.通过花粉管通道法共计转化15000朵花,收获70000余粒种子,筛选出25株具有潮霉素抗性的植株。4.通过气相质谱法测定了200份亚麻种质中总脂肪酸含量以及五种不同脂肪酸组分的含量;用spss 2.0软件分析各脂肪酸组分的含量,其中TFA、PA、SA、OA、LA、ALA的含量依次为:8.25-21.25mg/g、1.03-2.03mg/g、0.7-1.3mg/g、3.03-4.78mg/g、1.67-3.57mg/g、5.23-8.75mg/g之间,呈现正态分布。结合GWAS研究一共发掘到了8个与OA代谢明显相关的候选基因以及2个与LA代谢相关的候选基因。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第一部分 文献综述
  •   引言
  •   1 植物脂肪酸代谢的研究
  •     1.1 种子中的脂肪酸
  •     1.2 植物中脂肪酸生物合成途径
  •     1.3 不饱和脂肪酸合成酶的研究
  •     1.4 FAD2基因的研究
  •   2 基因编辑技术研究进展
  •     2.1 锌指核酸酶技术（ZFNs）
  •     2.2 TALENs技术
  •     2.3 病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术
  •     2.4 CRISPR/Cas9技术
  •   3 全基因组关联分析（GWAS）
  •   4 研究目的与意义
  • 第二部分 实验部分
  •   第一章 CRISPR/Cas9-FAD2基因敲除载体构建
  •     1 材料
  •       1.1 植物材料
  •       1.2 质粒与菌株
  •       1.3 实验试剂
  •       1.4 培养基及抗生素配制
  •       1.5 主要仪器设备
  •     2 实验方法
  •       2.1 靶位点选择及接头引物设计
  •       2.2 sgRNA表达盒构建
  •       2.3 重组载体的构建
  •       2.4 阳性克隆筛选和测序
  •       2.5 农杆菌的转化和稳定性检测
  •     3 结果与分析
  •       3.1 sgRNA靶位点选择及引物设计
  •       3.2 sgRNA表达盒的获取
  •       3.3 重组载体的构建
  •       3.4 阳性菌落PCR检测
  •       3.5 阳性菌落测序鉴定
  •       3.6 农杆菌稳定性检测
  •     4 讨论
  •   第二章 亚麻的遗传转化
  •     一、组织培养法遗传转化
  •       1 材料
  •     1.1 植物材料
  •     1.2 质粒与菌株
  •     1.3 实验试剂
  •     1.4 培养基制备
  •     1.5 仪器与设备
  •       2 方法
  •     2.1 “陇亚10号”再生体系的优化
  •     2.2 “陇亚10号”的遗传转化--组织培养法
  •     2.3 检测载体pYLCRISPR/Cas9-FAD2转化成功的阳性植株
  •       2.3.1 抗性植株总DNA的提取
  •       2.3.2 潮霉素抗性基因PCR检测
  •       2.3.3 基因编辑靶位点PCR检测
  •       2.3.4 测序验证
  •       3 结果与分析
  •     3.1 抗生素及抑菌剂对亚麻转化的影响
  •       3.1.1 Hyg筛选浓度对亚麻转化的影响
  •       3.1.2 抑菌剂浓度对亚麻转化的影响
  •     3.2 “陇亚10号”的遗传转化
  •     3.3 转基因植株的检测
  •       3.3.1 阳性愈伤组织Hyg抗性基因的PCR检测
  •       3.3.2 靶位点基因片段扩增
  •       3.3.3 测序结果
  •       4 讨论
  •     二、花粉管通道法遗传转化
  •       1 材料
  •     1.1 植物材料
  •     1.2 质粒菌株
  •     1.3 其他材料
  •       2 方法
  •     2.1 亚麻种植
  •     2.2 农杆菌培养
  •     2.3 柱头滴加法遗传转化
  •       2.3.1 当日转化
  •       2.3.2 次日转化
  •     2.4 收种
  •     2.5 筛选
  •     2.6 PCR检测
  •       3 结果与分析
  •     3.1 遗传转化
  •       4 讨论
  •   第三章 亚麻种质资源脂肪酸组分关联分析
  •     1.材料与方法
  •       1.1 材料
  •       1.2 仪器与试剂
  •     2.实验方法
  •       2.1 GC/MS条件设定
  •       2.2 脂肪酸含量测定
  •       2.3 亚麻全基因组关联分析
  •     3.结果与分析
  •       3.1 脂肪酸数据初步分析
  •       3.2 全基因组关联分析
  •       3.3 OA和LA候选基因的挖掘
  •     4.讨论
  •       4.1 脂肪酸的含量及组分分析
  •       4.2 候选基因的发掘
  • 第三部分 结论与展望
  •   1 结论
  •   2 展望
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ 引物序列信息
  • 附录Ⅱ 亚麻种质脂肪酸含量
  • 在读期间发表论文
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张喻

    导师: 谢丽琼

    关键词: 亚麻,脂肪酸,全基因组关联分析

    来源: 新疆大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 新疆大学

    分类号: Q943.2;S563.2

    总页数: 81

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