黄岂平[1]2002年在《不同基底拉伸过程对细胞生长、取向的影响及其骨架重排机制探讨》文中研究指明本文在总结以往研究者工作的基础上，使用生物力学，细胞生物学、免疫组织化学、计算机图象处理等多种研究方法，对培养的原代血管平滑肌细胞、EC’V-304细胞株施以不同大小、方向和频率的周期性基底拉伸(10％，0．67Hz；0．15％，0．4Hz)，同时结合使用静态基底拉伸和静态基底松弛的不同组合，研究在不同的力学过程中细胞生长和取向的调整；微丝、微管骨架的重排；生长和生理行为的变化等。通过总结实验结果对细胞取向和细胞骨架重排的力信号机制进行了探讨，强调指出了力学信号引起细胞响应并不完全依赖于化学信号机制，而可通过对细胞骨架张力的调整直接引起细胞在形态、取向方面的主动响应。主要工作和得出的相应结论如下： 1．对应用于本文研究的弹性膜圆管膨胀加载装置、四点弯曲梁单向交变等应变加载装置进行了力学分析，并对其中可能产生不利于实验研究影响的地方作了校正和处理。针对对各装置加载特点改进对照组设置，对照消除基底拉伸以外力学因素的影响。 2．用组织培养法原代培养兔血管平滑肌细胞，并利用免疫组织化学方法对其进行了鉴定。 3．对血管平滑肌细胞施以不同应变率的周期拉伸(最大应变分别为lO％、0．1 5％)，利用放射免疫法分析血管平滑肌细胞血管紧张素II的分泌：微管吸吮系统分析细胞与基底粘附力；免疫组织化学方法分析应力纤维的排布；流式细胞仪分析细胞分裂指数；利用计算机图象分析系统分析细胞形态和取向结果表明： (1) 周期拉伸使平滑肌细胞取向垂直于主应变方向，周期拉伸引起细胞取向调整存在应变阈值。 (2)周期拉伸对血管平滑肌细胞增殖、表型分化、分泌行为、基底粘附等生理行为均产生影响。 (3)周期拉伸下细胞取向的发生，与周期拉伸的其他一些生理效应有不同的机制 4．改变周期拉伸的加载方向，研究血管平滑肌细胞取向的再调整过程，结果表明：细胞对周期拉伸所引起的取向调整有一定的“记忆”现象。 5．对不同接种形态(圆斑、半平面)的ECV-304细胞施以最大应变10％，0．67HZ的周期拉伸，用FITC．鬼笔环肽标记微丝、FITC-微管仅亚基抗体标记微管，并利<WP=5>用计算机图象处理系统分析细胞取向、长短径的变化趋势和不同方向上的增殖和迁移情况。结果表明：1) 周期拉伸条件下，细胞群体形态的重建表现出与细胞个体取向相似的变化形式，垂直于主应变方向上细胞增殖速度快于应变方向；垂直于主应变方向上的迁移速度快于主应变方向。 2) 周期拉伸条件下细胞取向的调整与细胞长短径比的变化表现出明确的相关性；周期拉伸使细胞在应变方向上的截距缩短，在应变垂直向上截距增长；应力纤维的重排与细胞取向的调整直接相关。 6．基于上述结果本文提出了周期拉伸下细胞取向重排的机制可能是周期拉伸中的松弛过程使应力纤维在应变方向上解聚，而相对加强了应力纤维在垂直于应变方向上聚合的假想。 7．为验证上述假想，并分别研究不同力学状态下细胞的取向和骨架重排，将周期拉伸分解成不同的拉伸和放松过程，设计了一系列对细胞进行拉伸和松弛的实验，结合参考文献和这些实验的结果可以得出： 1)细胞应力纤维装配在没有其他因素干扰时倾向于沿细胞长轴进行的。周期拉伸作为刺激因素能激发应力纤维、粘着斑的装配(可能通过力敏感离子通道和整合素信号系统等化学信号机制)。 2)周期拉伸可看作拉伸过程和放松过程的组合，当细胞受到拉伸时，骨架(应力纤维)做出相应的调整，应力纤维的原始长度被延长。被延长后的应力纤维，在周期拉伸的放松过程中会处于松弛状态。 3)当应力纤维受到松弛作用时，会发生解聚和破坏。 4)在周期拉伸过程中，倾向于与拉伸方向平行的应力纤维，松弛的程度明显高于那些倾向于与拉伸方向垂直的应力纤维，于是它们因松弛而破坏的概率也相应的高。 5)在松弛破坏应力纤维的同时，周期拉伸促进它们的再装配(这两个效应是并存的)，这样反复的装配一选择性破坏．再装配的结果，最终使垂直于拉伸方向的应力纤维占优势，并使得细胞发生取向的调整。8．提出应力纤维松弛过程的理想模型，并通过分析指出放松后的应力纤维的张力状态与应力纤维的原始应变率、应力纤维弹性模量、应力纤维与主应变方向的夹角、应变率有关。
邢娟[2]2016年在《聚氨酯形状记忆过程中相分离微纳结构与回复应变对细胞形态的调控研究》文中进行了进一步梳理形状记忆聚氨酯(SMPU)具有良好的生物相容性、力学性能和形状记忆性能,在生物医学领域备受关注。SMPU软段与硬段因热力学不相容而形成的相分离微纳结构是其具有形状记忆效应(SME)的结构基础,而赋形、固定和形状回复则是其体现SME的必需过程。赋形和回复这两个动态过程可改变相分离微纳结构;回复过程还可产生回复应变。为了更深入地理解SME对SMPU生物相容性的影响机制,指导SMPU的结构设计和加工,需深入认识SMPU形状记忆过程中相分离微纳结构的变化及其与回复应变对细胞行为的调控。但迄今为止,尚缺乏相关研究。本文采用广角X射线衍射(WAXD)、小角X射线散射(SAXS)、傅里叶全反射红外光谱(ATR-FTIR)、差示扫描量热(DSC)、原子力显微镜(AFM)、扫描电镜(SEM)等技术考察了拉伸赋形与形状回复过程对SMPU薄膜相分离微纳结构的影响及影响机制,并以成骨细胞为模型细胞考察了微纳结构与回复应变对细胞形态的调控作用。主要研究内容和结论如下:(1)拉伸赋形对SMPU薄膜微纳结构的影响本文采用软段为聚乳酸-聚乙二醇叁嵌段共聚物(PDLLA-PEG-PDLLA),硬段为六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和哌嗪(PPZ)的嵌段SMPU作为模型材料,以聚(DL-乳酸)(PDLLA)为对照材料,采用溶液浇注法制备SMPU和PDLLA薄膜,考察拉伸赋形(拉伸率为0%,50%,100%,200%)对SMPU相分离微纳结构的影响,为深入理解赋形对细胞形态的调控及调控机理奠定基础。(1)未赋形SMPU薄膜具有明显的相分离结构,硬段逐级聚集形成硬段微区、独立“岛”结构和纳米纤维,在软段相中形成无序的硬段相化学“图案”;而对照材料PDLLA薄膜表面均一、平滑,仅出现因微弱结晶而导致的相分离现象。(2)拉伸赋形使光滑的PDLLA表面出现了垂直于拉伸方向排列的纳米突起。而在SMPU表面,拉伸赋形导致硬段微区与“岛”结构的长轴垂直于拉伸方向并且沿拉伸方向聚集,最终导致纳米纤维平行于拉伸方向,表明拉伸赋形可以改变SMPU的表面微纳结构并提高纳米纤维的有序性,提示对SMPU拉伸赋形可望成为一种制备有序化学“图案”的新方法。(2)拉伸赋形所致相分离微纳结构对细胞粘附与蛋白吸附的影响分别以成骨细胞和纤连蛋白(Fn)为模型细胞和模型蛋白,采用免疫荧光染色技术考察拉伸诱导的微纳结构对细胞形态与蛋白吸附的影响。结果显示:细胞长轴与Fn组装的蛋白纤维在SMPU薄膜表面均平行于拉伸方向,而在PDLLA薄膜表面则均垂直于拉伸方向,表明拉伸诱导的表面微纳结构可以调控细胞取向与蛋白组装,提示赋形处理可影响SMPU材料-细胞相互作用。同时,该结果进一步证实,拉伸赋形可成为一种制备有序化学“图案”以调控细胞行为的新方法。(3)回复介质对薄膜形状回复与微纳结构的调控回复过程是SMPU体现形状变化的过程,在医学应用中通常是在体液环境中发生。考察体液回复环境对SMPU相分离微纳结构和形状回复的影响及其机制,可为全面、深入地理解SMPU生物相容性提供理论基础,也可指导SMPU医学应用方案的制定。因此,本研究将拉伸赋形SMPU薄膜两端固定以保持应变恒定,将其置于32°C空气或细胞培养液DMEM中静置24h;随后,去除薄膜两端固定装置并分别升高空气或DMEM的温度使薄膜自由回复。通过考察介质环境对薄膜形状回复和表面微纳结构的影响,探讨体液环境影响SMPU形状记忆过程的相关机理。“受限”处理旨在使薄膜经历薄膜-细胞复合物在形状回复之前的处理过程(详见(4)),以便更准确地理解材料回复对细胞行为的调控机制。(1)定量检测了回复力和回复率的动态变化,发现薄膜在前20 min回复较快,在2 h内方可完成回复。“受限”处理对拉伸赋形薄膜的表面微纳结构无显着影响,但会因为应力松弛而降低薄膜形状回复力和回复率。薄膜在DMEM中的形状回复力和回复率明显低于空气中,DSC分析表明其机制与水分子增塑SMPU链段而导致应力松弛增强有关。上述结果表明,介质环境对形状回复性能有明显影响。(2)在空气中回复时,薄膜表面的硬段组装未完全回复到无序状态,多数纳米纤维与拉伸方向呈>40°夹角排列,这与应力松弛导致的薄膜形状未完全回复有关;而在DMEM中回复时,薄膜表面硬段聚集增强,出现明显的纤维状和点状硬段微区,且纳米纤维与拉伸方向间的夹角也多高于40°,这可能与水分子增塑引起的不完全回复以及水分子与软段形成的氢键作用有关。上述结果表明,回复介质明显影响SMPU薄膜的表面微纳结构,这为后续深入理解回复过程对细胞行为的影响奠定了基础。(4)薄膜形状回复应变与微纳结构对细胞形态的调控回复应变可能对细胞施加持续力学刺激。因此,考察回复应变对细胞行为的调控作用,可为SMPU生物相容性的评价提供一条基于生物力学的新思路。为考察回复应变和微纳结构对细胞形态的调控作用,本研究将成骨细胞接种于拉伸赋形SMPU薄膜表面,于32°C下培养24h后去除薄膜两端固定装置,并将薄膜-细胞复合物转入37°C细胞培养箱中让薄膜自由回复。利用活细胞工作站追踪细胞对薄膜形状回复的响应,并用免疫荧光染色技术观察薄膜回复后成骨细胞形态随培养时间的变化,利用CCK-8技术初步考察薄膜形状回复对成骨细胞后期(1-7d)增殖行为的影响。(1)SMPU薄膜回复的总应变随拉伸率增加而增大,拉伸率为50%、100%和200%时其回复总应变(%)分别为17.55±3.34、27.87±2.93和34.80±2.60。(2)活细胞工作站和免疫荧光染色结果显示:在薄膜回复初期(≤4h),SMPU回复应变使成骨细胞趋于垂直于拉伸方向排列,且细胞取向变化与拉伸率有关,表明SMPU回复应变作为一种力刺激可以调控成骨细胞形态。(3)SMPU薄膜形状回复24h后,细胞取向与薄膜表面纳米纤维取向一致,表明随着细胞培养时间的延长,回复应变对细胞取向的调控作用会逐渐被基底微纳结构所取代。(4)CCK-8检测结果显示,薄膜形状回复后1-7天内,回复薄膜表面的细胞数明显高于未回复薄膜表面。该结果表明,回复应变可以作为一种力学刺激调控细胞形态并促进细胞增殖,SMPU可望用作一种新型的动态细胞培养基底。综上所述,本论文在系统考察赋形、回复和回复介质对SMPU相分离微纳结构调控的基础上,揭示了SMPU形状记忆过程中其微纳结构与回复应变对细胞形态的调控及相关机理,为深入理解SMPU生物相容性提供了理论基础,相关研究结果对SMPU材料的设计与加工具有明显的指导意义。同时,本论文也初步验证了SMPU在有序图案化加工技术和动态细胞培养系统中的潜在应用价值。
徐东[3]2008年在《不同基底松弛对内皮细胞形态、骨架及细胞内Rho蛋白分布的影响》文中指出细胞在体内所处的环境是极其复杂的,较为突出的是表现在血流动力学因素对哺乳动物心血管系统中的内皮细胞的生理学影响。机械拉伸与剪切力、正压力等构成了体内细胞复杂力学关系的重要因素,由于机械拉伸与细胞附着、铺展、迁移、增殖等行为的关系,及其存在的普遍性,使得细胞对其的响应成为一个非常值得探讨的问题。实验从细胞形态变化、骨架重排以及对Rho蛋白影响方面分析了细胞在不同的机械外力作用下产生的不同效应。①体外细胞基底拉伸加载装置的研制鉴于细胞在体内的受力方式,体外研究所使用的机械拉伸方式大多为周期性的拉伸和松弛,而随着对机械拉伸的细胞信号转导问题研究的深入,需要对大量细胞进行加载。为了满足实验需求,在借鉴国内外已有装置的基础上,研制了一种适于大面积细胞培养、拉伸,并可以控制时间、应变大小、方向、频率等的单轴双向细胞基底拉伸装置,装置整个结构由数据采集系统、函数发生器、步进电机驱动器、压力传感器、位移传感器、细胞加载主要元件五个部分组成。该装置为研究细胞对机械拉伸的响应提供了多种检测手段。②不同基底状态的松弛对细胞形态骨架的影响利用以上装置,对细胞基底膜施以静态松弛不同时间、加载松弛后不同时间以及完全静态对照处理,使用计算机图像处理软件分别对不同试验方式的细胞的变化进行了分析,结果表明:静态松弛后细胞面积明显缩小;加载松弛后细胞形态发生了较大变化,细胞长短径比值随松弛时间的增加而变小,细胞也逐渐铺展开来,细胞骨架(应力纤维)倾向垂直于主应变方向,细胞长轴与加载方向夹角(取小于900角)均在700-900,与对照组相比变化显着。③不同基底状态的松弛对Rho蛋白分布的影响利用以上装置,对细胞基底膜施以静态松弛不同时间与完全静态对照处理,试验首先考虑将EYFP-RBD质粒转入细胞,通过质粒荧光和二抗荧光双荧光标记观察Rho的分布,但实验后发现此种方法不完善,改用免疫荧光方法观察,结果显示:经过静态拉伸的细胞,在松弛10min时Rho蛋白的分布与完全静息状态的基本上没变化,主要在细胞质与膜上呈弥散分布,细胞核内仅有少量分布;而在松弛40min时Rho蛋白分布表现为在整个细胞内呈弥散分布,并且在核内有较强的集中分布;经过周期加载处理的细胞在松弛10min时则在细胞膜上较明显的集中分布。
刘艳鸣[4]2008年在《肝癌细胞β_1整合素再分布变化对其迁移取向影响的实验研究》文中提出肝癌细胞在体外二维培养中的迁移粘附特性表现为粘附稳定性下降,细胞频发形变,迁移速率增快和迁移方向频繁改变。整合素是肿瘤细胞侵袭转移过程中调节细胞粘附和运动行为的重要分子,肿瘤细胞的这些运动粘附特性与其整合素分布变化及分布调节存在一定的相关性。本实验研究在诱发肝癌细胞Hep G2整合素再分布变化的基础上,总结整合素再分布变化趋势和特征,并结合肝癌细胞粘附运动变化规律,探索整合素再分布变化对肝癌细胞粘附运动行为的影响。本研究通过机械拉伸和胞外基质裱衬诱发整合素再分布变化,运用间接免疫荧光技术,激光共聚焦显微镜对肝癌细胞整合素表达水平和位置改变进行检测和定量分析,同时运用免疫组织化学实验技术对细胞骨架(F-actin)进行分析,运用细胞形态学观察和图像处理技术对细胞运动变形能力进行形态学检测和定量分析。实验结果如下:1)分析人肝癌Hep G2细胞整合素分布特征发现,从细胞锚着的基底层至下而上其整合素分布量逐渐减少。比较不同形状细胞整合素表达和分布趋势,发现群居细胞(群体中单个细胞)β1整合素表达最高,铺展细胞次之,圆细胞最弱,但圆细胞游离面整合素反较基底面多。不同形态细胞β1整合素分布峰值比较:圆形细胞为距基底6μm平面,铺展细胞为基底至4μm平面,群居细胞为基底面;在机械拉伸(10%拉伸, 30r/min)5h后,不同形态细胞β1整合素表达均升高,分布发生变化即峰值均下移至基底面,β1整合素向基底层转移有利于形成局部粘附连接。在去除机械拉伸刺激即卸载1h后,β1整合素分布倾向发生弥散分布变化,游离面整合素普遍增多,与静态对照和加载组相比,β1整合素基底面与游离面分布量落差减小,且圆形细胞整合素分布峰值出现上移至距基底6μm平面,并明显高于基底面。2)裱衬纤连蛋白(FN)后检测人肝癌Hep G2细胞表面β1整合素表达发现,β1整合素表达显着增加,不同形态细胞整合素分布呈现相同特征和趋势,即基底面明显多于游离面分布量,在基底面可见散在分布的点状强荧光区。预示β1整合素与特异性配体的结合使其表达分布发生重组,形成粘着斑。不同状态(静态对照与机械刺激、FN裱衬)融合区群体细胞总是保持基底面整合素分布大于游离面的倾向。FN裱衬后圆细胞基底面整合素分布量明显大于静态对照与机械刺激两组,且分布带缩窄,故FN裱衬对圆细胞整合素分布改变影响最大。3)对人肝癌Hep G2细胞拉伸(10%拉伸, 30r/min)刺激5h后,发现加载组细胞面积、长短轴比值都呈增加趋势,形变因子呈下降趋势,细胞角度有垂直于应力方向排列的趋势。当力学刺激存在时,细胞形态发生适应性变化,而在去除力学刺激后,即卸载1h后发现,细胞长短径比值,细胞形变因子和细胞垂直取向均有回复趋势。4)对人肝癌Hep G2细胞拉伸(10%拉伸, 30r/min)刺激5h后,发现细胞骨架取向垂直于拉伸方向。在去除周期机械应力后,细胞骨架调整出现明显解聚变化。结果表明,周期拉伸可看作拉伸过程和放松过程的组合,当细胞受到拉伸时,细胞骨架(应力纤维)做出相应的调整,最终使垂直于拉伸方向的应力纤维占优势,并使得细胞发生取向的调整。主要结论:1)整合素再分布调整是细胞适应环境变化的响应方式,肝癌细胞整合素向基底转移与应力纤维装配存在正相关。2)细胞间连接对整合素倾向基底分布有一定促进作用。3)单个圆形细胞的整合素分布特征(弥散、游离面较多)支持其转移浸润能力较强的特性。
李昱辉[5]2016年在《基于水凝胶的细胞力学微环境构建及在肌肉组织工程中的应用》文中进行了进一步梳理在体细胞处于复杂的微环境中,微环境的动态平衡是维系细胞正常行为功能的重要条件。越来越多研究表明力学刺激信号广泛存在于细胞微环境中,对细胞行为起重要调控作用。深入开展细胞生物力学微环境的多学科交叉研究,对阐明力学刺激信号与机体发育、生长、疾病的发生发展等生命活动间的相互作用具有重要意义,目前已成为国内外力学、材料学、化学、生物医学等领域所研究的热点。水凝胶因其具有高保水性、物化性能可控、与细胞外基质结构相似、生物相容性好等特点,可作为模拟细胞微环境的基质材料。本文结合实验和有限元分析,系统开展了基于水凝胶的细胞力学微环境构建、表征及应用研究。本文以水凝胶为研究对象,从建立表征水凝胶力学特性的实验系统为出发点。提出了基于磁力的,非接触式力学测试(加载)系统的实验模型。通过给水凝胶样品添加包含有磁性微珠的“磁性端”,结合有限元分析,设计优化外加磁场强度及梯度,实现对凝胶样品力学性能的测试。磁力测试系统克服了传统力学测试方法对水凝胶加载难、加载过程易造成样品破坏等技术瓶颈。采用该系统对力学性能较好的聚丙烯酰胺水凝胶和离体组织等生物材料进行刚度特性测试,并与Bose力学测试机的测试结果作对比,验证平台准确性。随后对难于加载的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝胶和明胶甲基丙烯酸酯水凝胶进行力学性能测试,并采用该系统初步研究了细胞重塑对明胶甲基丙烯酸酯水凝胶力学特性的影响,结果显示培养两周后,包裹有细胞的水凝胶刚度特性相比于对照组显着增强,与细胞大量分泌细胞外基质并重塑其微环境相关。该力学测试(加载)系统的建立为后续细胞力学微环境的构建及表征提供了理论基础和实验手段。*针对细胞力学微环境的体外构建研究,本文主要采用聚丙烯酰胺和明胶甲基丙烯酸酯两种水凝胶作为基质材料,分别构建细胞刚度微环境和应力/应变微环境。结合实验和有限元分析,表征了凝胶在外载荷作用下的变形行为。系统研究了在不同维度下,基质刚度和应力/应变刺激对细胞行为的调控规律。结果表明在二维微环境中,随着基质刚度的增加(2 k Pa、10 k Pa、30 kpa和60 kpa),细胞活性、增殖及粘附铺展能力显着增强;而在叁维微环境中(2 k Pa、6 k Pa、10 kpa和20 kpa),基质刚度与细胞活性功能呈反相关,而拉伸应变刺激(10%~100%)会显着促进细胞铺展、增殖、排列行为。当应变增加至一定范围时(>120%),细胞出现早期凋亡甚至坏死。通过设计水凝胶的形状实现了梯度应力/应变微环境的体外构建,对凝胶表面应力/应变梯度分布进行实验表征,研究了梯度应力/应变刺激对细胞排列的影响,结果表明当凝胶表面应变在17.0±0.5%~19.7±1.0%范围时,细胞排列基本垂直于最大主应变方向;随着应变的降低(15.4±0.4%~13.5±0.7%),细胞排列逐渐平行于拉伸方向。为进一步验证细胞力学微环境对细胞行为的作用机制,本文通过体外构建刚度微环境,初步研究了基质刚度对心肌纤维化过程的影响。通过调控基质刚度成功制备心肌纤维化疾病模型,初步揭示了基质刚度对心肌成纤维细胞向心肌肌成纤维细胞表型转化的调控机制。结果表明基质刚度的增大会通过上调细胞膜受体AT1R进而增加对促纤维化分子TGF-β1的表达,进一步磷酸化Smad2,上调肌成纤维细胞标志物α-SMA,促进肌成纤维细胞表型转化过程,同时发现人脂肪干细胞可以通过旁分泌因子HGF抑制AT1R和上调Smad7,阻止α-SMA的过表达,达到抑制心肌肌成纤维细胞表型转化的目的,为揭示心肌纤维化的病理机理提供了一定的思路。另一方面,通过构建叁维应力/应变微环境,研究了拉伸应变与成肌细胞定向排列及分化行为间的关系。通过调控拉伸应变,促进成肌细胞在凝胶内产生定向排列,并分化为具有多核结构的肌管,进一步从分子水平验证,为功能性肌肉微组织模型的体外制备提供了实验依据。
参考文献：
[1]. 不同基底拉伸过程对细胞生长、取向的影响及其骨架重排机制探讨[D]. 黄岂平. 重庆大学. 2002
[2]. 聚氨酯形状记忆过程中相分离微纳结构与回复应变对细胞形态的调控研究[D]. 邢娟. 重庆大学. 2016
[3]. 不同基底松弛对内皮细胞形态、骨架及细胞内Rho蛋白分布的影响[D]. 徐东. 重庆大学. 2008
[4]. 肝癌细胞β_1整合素再分布变化对其迁移取向影响的实验研究[D]. 刘艳鸣. 重庆大学. 2008
[5]. 基于水凝胶的细胞力学微环境构建及在肌肉组织工程中的应用[D]. 李昱辉. 西安交通大学. 2016
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