拟南芥年龄依赖型表皮毛发生机制研究

论文摘要

植物种子萌发后,需要经历幼年期及成年期后再进入生殖生长期。其中,幼年期向成年期的转变称为营养生长阶段转变。植物幼年向成年阶段转变通常伴随着一系列生理、生化变化,如叶片长宽比、叶片大小、叶缘缺刻、细胞大小、表皮毛数目、细胞增殖能力、次生代谢物积累等。以拟南芥为例,其幼年期叶片圆,叶缘缺刻少,叶色浅,叶细胞大,叶片具上表皮毛;而成年期叶片较狭长,叶缘缺刻多,叶色深,叶细胞小,叶片具有上下表皮毛。拟南芥叶片下表皮毛发生是拟南芥幼年向成年阶段转变的关键形态学指标。基于此形态学指标,人们发现植物幼年向成年阶段转变这一过程受保守的miR156-SPL信号途径所调控。植物生长发育过程中miR156含量逐渐降低,而其靶基因SPLs表达逐渐升高,植物由此进入成年期。然而,拟南芥叶片下表皮毛发生如何受miR156-SPL这一年龄途径所调控还未知。我们通过EMS（Ethylmethylsulfone）诱变方法获得了一份幼年向成年阶段转变提前突变体,并对该突变体进行了研究,主要结果如下:1、遗传分析表明,该突变体为显性突变体,我们把该突变命名为pre1-D（precocious juvenile-to-adult phase transition mutant 1,dominant）。短日照下,与野生型相比,pre1-D突变体表现为下表皮毛发生叶位显著提前,而其它形态学指标（叶长宽比、叶缺刻）无显著变化,说明pre1-D只影响叶片表皮性状的发育;2、对miR156-SPL信号途径基因表达检测表明,pre1-D不影响相关基因的表达;3、图位克隆方法把pre1-D定位在拟南芥3号染色体10162 Kb-11051 Kb之间,物理距离为889 Kb。基因组重测序显示候选区间内存在6个突变位点,其中1个突变位点位于表皮毛发生关键调控基因GL1终止密码子下游非编码区867 nt处;4、为了证明pre1-D表型是由于GL1突变所致,我们克隆了WT、pre1-D中GL1基因片段,分别遗传转化WT获得了gGL1WT、gGL1pre1-D转基因植株。表型观察发现gGL1pre1-D转基因植物的下表皮毛发生显著早于gGL1WT。由此,我们认为pre1-D表型由GL1突变所致。基因表达检测显示pre1-D突变体中GL1表达显著高于WT。5、AthaMap分析显示GL1基因下游866-875 nt处为一个保守的AP2-like转录因子（TOE1、TOE2、TOE3、AP2、SMZ、SNZ）结合位点;pre1-D中GL1的G到A突变位点刚好位于该保守结合区域。6、已知AP2-like因子负调控拟南芥下表皮毛发育,因此我们检测了35S::TOE1、toe1 toe2中GL1的表达。结果表明,GL1在35S::TOE1表达下调,而在toe1 toe2中表达上调。ChIP（Chromatin immunoprecipitation）分析显示TOE1可直接结合到GL1下游非编码区AP2-like转录因子的结合基序区;而在pre1-D背景下,TOE1结合能力被解除。上述ChIP和基因表达结果提示TOE1通过直接结合到GL1基因下游非编码区AP2-like转录因子结合基序处来抑制GL1表达。7、遗传分析表明,pre1-D可显著回复35S::MIR156A、35S::TOE1下表皮毛延迟的表型,pre1-D上位于35S::MIR156A和35S::TOE1。我们基于对该年龄依赖型下表皮毛发生缺陷突变体pre1-D的研究,揭示位于miR156-SPL通路下游的TOE1可直接结合到表皮毛发生关键调控基因GL1下游非编码区域,通过抑制GL1表达来实现年龄依赖型下表皮毛调控模式。在pre1-D中,GL1下游区域TOE1结合基序发生单碱基突变,TOE1无法正常结合并抑制GL1表达,导致pre1-D突变体下表皮毛发生提前。基于以上结果,我们提出了拟南芥下表皮毛年龄依赖型发生的分子机制。即在营养生长过程中,miR156表达逐渐下调,SPL9等转录因子表达逐渐上升,激活miR172表达来抑制AP2-like转录因子,AP2-like转录因子的表达水平降低解除了对表皮毛发生关键调控基因GL1的抑制作用,导致GL1表达升高,促进下表皮毛发生。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 植物营养生长阶段转变研究进展

1.1.1 植物的阶段转变

1.1.2 植物营养生长阶段转变的形态学特征

1.1.3 调控植物营养生长阶段转变的分子机制

1.1.4 研究营养生长阶段转变的意义

1.2 植物表皮毛发育研究进展

1.2.1 植物表皮毛

1.2.2 表皮毛发育的调控因子

1.2.3 表皮毛发育的分子机制

1.3 本课题研究意义

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料

2.1.2 主要仪器及设备

2.1.3 主要试剂及配制方法

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥栽培管理

2.2.2 拟南芥表型考察

2.2.3 拟南芥杂交与杂交后代筛选

2.2.4 图位克隆

2.2.5 基因组重测序

2.2.6 目的基因实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2.2.7 转基因植物获得

2.2.8 染色质免疫共沉淀（ChIP）

第三章结果与分析

3.1 突变体表型考察

3.2 PRE1-D突变体图位克隆及基因组重测序

3.2.1 图位克隆

3.2.2 基因组重测序

3.3 突变基因分析及验证

3.3.1 WT和 pre1-D突变体中GL1 基因表达量检测

3.3.2 WT和 pre1-D突变体上表皮毛数目统计

3.3.3 dCAPS鉴定结果

3.3.4 转基因验证结果

3.4 GL1 基因突变位点序列分析

3.5 AP2 类转录因子能够直接结合抑制GL1 基因的转录

3.5.1 CHIP分析

3.5.2 遗传材料中GL1 基因表达量检测及表型考察

3.6 PRE1-D突变体MIR156-SPLS通路关键基因遗传分析

第四章总结与讨论

4.1 总结

4.2 讨论

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 钱致远

导师: 吴刚

关键词: 营养生长阶段转变,下表皮毛,通路

来源: 浙江农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 浙江农林大学

分类号: Q943.2

总页数: 62

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