论文摘要
非生物胁迫造成世界主要农作物每年有近50%的产量损失。土壤酸化产生的质子（H+）毒害和钾（K）营养匮乏是其中发生范围较广的两个非生物胁迫。在长期的进化过程中,许多植物已形成了一系列适应H+胁迫和低K+胁迫的机制。氮作为植物生长所需的大量矿质营养元素之一,近年来许多生理学研究初步发现植物的氮素营养与植物对H+胁迫和低K+胁迫的适应能力密切相关,但其机制尚不完全清楚。鉴于植物吸收NO3-需要消耗H+,而对K+吸收会释放H+的基本原理,本论文提出NRTs（硝酸盐转运蛋白）可能在植物适应H+胁迫和改善K+营养中起重要作用的研究假说。为此,本论文以野生型、NRTs突变体、转基因植株及双突变体等拟南芥为研究材料,运用植物生理学和分子生物学等手段,研究了NRTs尤其是NRT1.1在植物适应H+胁迫和改善K+营养中的作用及其机制。取得的主要研究结果如下:1.采用琼脂平板培养的方法,研究了H+胁迫对野生型Col-0和NRT1.1功能缺失突变体生长状况的影响。结果表明,H+胁迫对NRTT1.1的突变体nrt1.1-1和chl1-5根系伸长和生物量的抑制作用显著大于Col-0,Ler背景下的NRTT1.1功能缺失突变体chl1.6的根系伸长和生物量亦显著受抑。此外,本论文也研究了H+胁迫对其他NRTs基因突变体nrt2.1、nrt2.2、nrt2.4、nrt2.5和nrt1.2与其对应野生型Col-0或Ler生长的影响,结果显示野生型和对应突变体之间并无显著性差异,这表明与根系NO3-吸收有关的6个NRTs中仅NRT1.1在植物适应H+胁迫中发挥重要作用。鉴于NRT1.1同时具有NO3-吸收和信号调控的功能,进一步研究了这两种功能在NRT1.1调节植物适应H+胁迫中的作用。为此,对无NO3-和低NO3-条件下Col-0和nrt1.1-1、chl1-5两种基因型植物受H+胁迫后的生长状况进行比较,发现NRT1.1参与的植物耐H+胁迫作用依赖于足量NO3-的供应;进一步通过比较H+胁迫对NO3-的信号功能缺失突变体nlp7-2和NO3-的吸收功能缺失突变体chl1-9生长的影响,发现NRT1.1的NO3-吸收功能而非信号途径参与了植物耐H+胁迫过程。2.采用组织化学染色、根系基因表达分析以及化学测定等方法,进一步研究了NRT1.1在植物适应H+胁迫中的作用机制。结果表明,H+胁迫显著促进了野生型Col-0根系中NRT1.1基因表达和转基因植株pNRT1.1::NRT1.1-GUS根系中NRT1.1-GUS蛋白的表达,并且显著提高了Col-0根系的NO3-吸收速率,但对突变体nrt1.1-1和chl1-5根系的NO3-吸收速率无显著影响。因此,H+胁迫下植物通过诱导根系中的NRT1.1活性增强NO3-的吸收。进一步比较了Col-0和nrt1.1-1、chl1-5的根际pH,发现Col-0受到H+胁迫后的根际pH显著升高,而nrt1.1-1和chl1-5变化不大。进一步研究发现,pH缓冲剂处理的低pH胁迫下,Col-0与nrt1.1-1、chl1-5受到相似的H+毒害作用。这些结果说明低pH条件下,植物通过诱导根系NRT1.1介导的NO3-吸收来提高根际pH,进而增强植物对H+胁迫的适应能力。3.采用琼脂平板培养和非损伤微测技术系统,首先研究了NO3-吸收过程对根系K+吸收的影响。结果显示,适量增加培养介质中NO3-浓度,植物K+积累量和吸收速率也增加。进而研究了低K+胁迫对NRTs功能缺失突变体与其对应的野生型的生长状况和钾含量的影响。结果表明,低K+胁迫对NRT1.1的突变体nrt1.1-1、chl1-5和chl1-6根系伸长、生物量和钾含量的抑制作用显著大于其相对应的野生型植株;而其他NRTs突变体nrt2.1、nrt2.2、nrt2.4、nrt2.5和nrt1.2的低K+胁迫表型和钾含量均与其相对应的野生型相当。此外,NRT1.1功能回补植株pNRT1.1::NRT1.1-GFP受到低K+胁迫时,其表型和钾含量与Col-0野生型一致。这些结果表明,在负责根系NO3-吸收的6个NRTs中仅有NRT1.1在植物耐低K+胁迫中起到重要作用。进一步在低K+胁迫的条件下,通过比较不同供NO3-水平对野生型和nrt1.1突变体的生长和钾含量的影响,发现NRT1.1参与的耐低K+胁迫也需要足量NO3-的供应。为此,通过定量PCR、组织化学染色的方法,研究了NRT1.1对低K+胁迫的响应。结果表明,低K+胁迫显著增加了野生型Col-0根系中NRT1.1基因表达和转基因植株pNRT1.1::NRT1.1-GFP、pNRT1.1::NRT1.1-GUS根系中NRT1.1-GFP、NRT1.1-GUS融合蛋白的表达;同时经低K+预处理的Col-0的根系的NO3-净流入通量均显著高于正常供K+的预处理植株。可见低K+胁迫增强了NRT1.1介导的NO3-吸收。上述结果表明,NRT1.1跨膜转运NO3-活性的诱导是植物适应K+胁迫的重要机制。4.利用非损伤微测技术离子通量检测系统分析了Col-0和nrt1.1-1、chl1-5根系的K+吸收速率。结果显示,正常供K+和低K+条件下,Col-0野生型根系的K+净流入通量均显著高于nrt1.1-1和chl1-5突变体,这表明NRT1.1在根系的K+吸收过程中起重要作用。同时,比较了根系向地上部的钾分配量在上述野生型和nrt1.1突变体之间的差异,发现在低K+胁迫的条件下NRT1.1也参与了根系中的K+向地上部转运的过程。进一步通过对Col-0与nrt1.1-1嫁接植株、pPHO1::NRT1.1和pSultr1;2::NRT1.1转基因植株进行钾含量分析,发现NRT1.1改善植物K营养的作用部位在植株根系而非地上部,且利用PHO1启动子回补NRT1.1在根系表皮-皮层中的功能显著促进了K+吸收,而利用Sultr1;2启动子回补NRT1.1在根系中柱组织中的功能显著促进了低K+条件下的K+向地上部转运。这表明,NRT1.1利用其在根系表皮-皮层组织和中柱组织中的空间表达特异性来分别驱动根系对K+吸收及其吸收后向地上部转运的过程。通过在K+吸收缺失的酵母R5421中表达NRT1.1发现其不具有直接吸收K+的活性。进而,以nrt1.1-1背景构建了系列的K+吸收或转运通道/蛋白功能缺失的双突变体（nrt1.1-1/akt1、nrt1.1-1/hak5-3、nrt1.1-1/kup7和nrt1.1-1/skor-2）,并利用两因素方差分析了这些双突变体的钾含量发现NRT1.1在植物根表皮-皮层和中柱组织中分别与K+吸收通道/蛋白和K+转运通道/蛋白协同配合来促进根系的K+的吸收及其向地上部的转运。综上,在H+胁迫和低K+胁迫的条件下,植物均可通过诱导NRT1.1跨膜转运NO3-的活性来增强对这两种胁迫耐性。由此可见,利用生物技术或遗传育种手段,增强作物中NRT1.1同源蛋白的活性,可望实现改善作物氮、钾肥利用效率和酸性土壤环境适应能力的多重收益。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 方先芝
导师: 金崇伟
关键词: 胁迫,低胁迫,吸收,转运
来源: 浙江大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 浙江大学
基金: 国家重点研发项目(2016YFD0200103),国家自然科学基金(31622051),国家自然科学基金(31670258)
分类号: Q945.78
DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.002091
总页数: 150
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