辛忠涛[1]2003年在《应用细菌表面展示技术快速筛选抗原表位及研制应急疫苗》文中研究表明细菌表面展示技术作为噬菌体表面展示技术的有益补充，已被广泛用于生命科学各个领域。而构建基因工程减毒活疫苗是研究细菌展示系统的最初动因，也是这一系统最活跃的研究方向。但以往研究多是将已知抗原片段或表位展示于细菌表面用作实验性活菌苗。本研究提出了从细菌展示随机肽库筛选获得的抗原表位直接用作应急疫苗的新思路。 本研究首先以针对HBV pres的单克隆抗体为模型，生物淘洗商品化细菌鞭毛展示随机十二肽库，获得该抗体抗原模拟表位，核心序列为R-RG-Y，与HBV preS蛋白的135-140氨基酸同源；将展示模拟表位的菌体克隆直接免疫小鼠，可获得针对HBV preS蛋白的高滴度、高特异性抗体，表明从细菌展示随机肽库中筛选获得的抗原表位直接用于应急疫苗研制是可行的。 为克服常规生物淘洗在多抗表位筛选中的不足，以HBV preS单抗为靶分子利用FACS对模拟文库以及随机肽库FliTrx~(TM)进行筛选，在此基础上建立消减FACS分选HBV preS免疫血清多克隆抗体抗原表位的方法，为今后从病人血清样品中进行抗原表位的筛选奠定了基础。 为更好地获得不同形式抗体的抗原表位，以细菌IgA蛋白酶β结构域为骨架构建一个库容量为5×10~6的线性化随机肽库，经分析库容量与多样性均符合抗原表位筛选要求。该随机肽库是对现有细菌展示系统的有益补充。 总之，本研究以针对HBV-preS蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体为模型，建立从细菌表面展示随机肽库中快速获得抗原表位技术，并探讨这些携带模拟表位的细菌克隆直接应用作实验性活菌苗的可行性，探索一条将筛选到的抗原表位直接用于疫苗研制的技术路线，为在发生突发性的或未知类型的生物袭击时，研制应急防护疫苗进行了有益尝试。
王长军[2]2003年在《抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定》文中认为目的 肾综合征出血热病毒(HFRSV)为布尼亚病毒科汉坦病毒(HV)属成员。因其致病性强，世界卫生组织已将其列为潜在的生物战剂。其中汉滩型(HTN)与汉城型(SEO)在我国广泛分布，引起发病率和病死率较高的肾综合征出血热(HFRS)，每年病例占全球总病例的90%以上。虽然近年来HFRS发病率和病死率在我国呈下降趋势，但疫区仍在不断扩大，并已波及某些中心城市。因而，从分子水平积极开展HFRSV的免疫预防和治疗研究具有重要意义。材料和方法 根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列，设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物。采用一步法提取单克隆抗体(McAb)H7、B11和F3细胞总RNA，通过RT-PCR扩增V基因，并进行核苷酸序列测定和分析。同时，利用McAb F3及B11，应用噬菌体肽文库筛选特异性的抗体结合肽，夹心ELISA和竞争抑制试验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性，阳性克隆序列测定和同源性分析；在此基础上，通过动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒抗原的免疫原性。结果 通过RT-PCR成功克隆5条可变区基因，均为开放阅读框，符合小鼠抗体框架结构。B11-VH隶属于JH4重排，长345 bp，编码115个氨基酸；H7-VK属JK4重排，长357 bp，编码119个氨基酸；H7-VH属JH4重排，长360 bp，编码120个氨基酸；F3-VK属JK1重排，长348 bp，编码116个氨基酸；F3-VH属JH3重排，长366 bp，编码122个氨基酸。将上述基因核苷酸序列输入GenBank查询，证实为新基因，登记号依次为AY245600~AY245604。同时，应用噬菌体肽文库筛选获得的特异性抗体结合肽阳性率达80%以上，可特异性地与筛选抗体结合。序列分析表明，McAb F3特异性结合肽的推导氨基酸序列高度一致，为MHGPTKNQMWHT，与HFRSV M蛋白G2区第750~759位氨基酸有较高的同源性；而McAb B11特异性的结合肽在氨基酸水平表现出一定的多态性(分为4组)，推测其序列基序为(M/F)HR(H/T)X(H/W)或(R/F)HX(H/T)PWL。阳性克隆动物免疫试验表明，噬菌体肽抗原不仅具有良好的免疫反应性，而且具有良好的免疫原性，是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物。结论 上述McAb可变区基因的获得及模拟表位的初步鉴定，为有目的地开展<WP=10>HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究，以及基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础。
岑峻宇[3]2012年在《拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析》文中研究表明水产动物腹水病是由拟态弧菌(Vibrio mimicus，Vm)引起的危害严重的细菌性疾病[1-6]。目前控制该病的主要手段是抗菌治疗，但是随着抗生素的长期使用，细菌产生耐药性，导致抗菌疗效不明显。因此，研制新型疫苗免疫防治腹水病是一个亟待解决的问题，而寻找保护性抗原表位是生产新型疫苗的基础[7-8]。拟态弧菌外膜蛋白U（Outer membrane protein U，OmpU）是一种具有良好抗原性和高度保守性的黏附素蛋白[9-10]，可作为首选疫苗候选分子，但其有效保护性抗原表位至今尚不明确。本研究以纯化的兔抗重组OmpUa多克隆抗体为靶标，应用噬菌体肽库技术筛选和鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个免疫优势模拟表位，并分析了模拟抗原表位的免疫原性和免疫保护性，研究结果为进一步研制黏附素表位疫苗奠定了基础。为了获取用于筛选拟态弧菌OmpU蛋白的B细胞模拟表位的分子靶标，采用饱和硫酸铵分级沉淀结合亲和层析法提纯兔抗重组OmpUa多克隆抗体。纯化的兔抗重组OmpUa抗体的纯度达到95%，浓度为1.5mg/mL，ELISA效价高达1:4096000，完全可用于后续的噬菌体随机肽库筛选试验。为了筛选鉴定OmpU蛋白的B细胞模拟表位，用纯化的兔抗重组OmpUa抗体为筛选靶标，对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗筛选。经过3轮淘洗后，噬菌体的投入产出比呈上升趋势，噬菌体得到较好富集。随机挑选68个噬菌体克隆，经双夹心ELISA和竞争ELISA鉴定出9个阳性噬菌体克隆。提取阳性噬菌体克隆单链DNA进行序列测定与分析，结果显示9个克隆共呈递HDSSKFPYVPSY、FNLHAWPTLDT、HAATVDKIENMR、GLNWSLSPADLI、DTAYEGNIARLM、FSSDSSKVHYPN和SVSEGMKPSPRP7个12肽序列，它们与OmpU蛋白均无3个以上连续的相同氨基酸残基，说明它们是模拟表位。阳性噬菌体克隆C17、C60和C67呈递共同基序DSSK-P，与OmpU蛋白的氨基酸残基（293-316aa）有较高同源性，表明D、S、S、K、P是构成OmpU蛋白B细胞表位的关键氨基酸。使用筛选鉴定的7个噬菌体阳性克隆作为抗原分7组免疫昆明小鼠，每组10只，同时做噬菌体原始肽库阴性对照和拟态弧菌灭活菌体阳性对照。免疫程序为：腹腔免疫，免疫剂量为1012PFU噬菌体/只，首免后14天二免，二免后10天叁免，免疫途径和剂量均同首免。第3次免疫后7天测定出各组免疫小鼠血清中均产生较高滴度的特异性抗体，抗体的ELISA效价在1:51200～1:409600之间。攻毒试验结果显示，各组免疫小鼠分别获得了70%（7/10，C21克隆）、80%（8/10，C20和C25克隆）和100%（10/10，C17、C24、C60和C66克隆）的免疫保护，而噬菌体M13对照组的小鼠全部死亡。说明7个携带OmpU蛋白B细胞模拟表位的噬菌体克隆均具有良好的免疫原性和免疫保护性，C17、C24、C60和C66阳性噬菌体克隆所呈递的模拟表位可作为疫苗侯选表位。综上所述，本研究利用噬菌体随机肽库技术首次筛选鉴定了拟态弧菌OmpU蛋白的7个保护性模拟表位，其研究成果拥有自主知识产权，也为设计安全有效的黏附素表位疫苗奠定了坚实的基础。
徐永娟[4]2016年在《结核分枝杆菌人新B细胞表位及10种特异蛋白的抗原性研究》文中研究说明在结核病(Tuberculosis,TB)的免疫学研究中,特异抗原及其抗原表位的研究对结核病的诊断技术和疫苗发展具有极为重要的作用。抗原表位是决定抗原特异性和免疫效能的特殊基团或空间结构。B细胞表位在感染免疫中发挥了重要作用,如激活体液免疫应答和调节细胞免疫应答。因此,研究抗原B细胞表位,有助于结核病快速诊断试剂和疫苗的研究。本研究一是开展结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)新抗原的B细胞表位预测和筛选,二是选取抗原表位数较多的特异性抗原进行克隆表达纯化,并对纯化的重组蛋白及B表位多肽进行血清学评价,为研发结核病特异诊断试剂和新疫苗提供基础。根据基因组学、蛋白质组学、免疫组学和生物信息学原理,排除PE/PPE蛋白、转座子基因以及已知B表位的蛋白抗原,从结核分枝杆菌全基因组的蛋白质基因序列中筛选新的蛋白抗原。利用生物信息学和SEPPA2.0软件,预测新抗原的B细胞表位,分析、优选并合成B细胞表位多肽。阅读文献、根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)和免疫表位数据库(IEDB),分析并选择有抗原表位的结核分枝杆菌特异性抗原。蛋白抗原的编码基因以标准株H37Rv的DNA为模板,PCR扩增并提取目的基因,以原核表达载体PET32a构建重组质粒,双酶切鉴定和测序100%正确的重组子进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。大量诱导后镍离子亲和层析柱层析纯化,纯化效果不理想的蛋白再次使用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的包涵体进行复性,使用BCA法对蛋白的浓度进行测定。将合成的B细胞表位多肽及纯化后的蛋白包被酶标板,棋盘滴定法确定抗原及多肽、一抗和二抗的最佳稀释度,以结核病人血清及健康志愿者的血清为一抗,间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对B细胞表位多肽及重组蛋白抗原进行评价。本研究经过软件的预测及筛选,成功预测并合成了结核分枝杆菌3个新蛋白的共13条B细胞线性表位多肽,包括蛋白Sod C成功合成3条,Mog为4条和Rv1566c为6条,每条多肽的纯度大于90%,满足实验要求。Mog抗原成功预测了构象表位,构象表位需要通过重组蛋白的克隆表达,再进行血清学验证。本研究通过文献检索及生物信息学筛选,确定了9个已知特异性蛋白抗原,并完成了此九种蛋白及构象表位抗原Mog的克隆表达纯化,酶切鉴定结果正确,测序结果与NCBI中的序列完全一致。10种蛋白的诱导表达纯化,最终得到了纯化效果较理想的重组蛋白。间接ELISA法对B表位多肽及10种蛋白抗原进行评价,棋盘滴定确定多肽的包被浓度为3.13μg/ml,蛋白抗原Pfk B、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Esx R、Fad D28、Dev S和Mog的最佳包被浓度分别为0.46μg/ml、1.03μg/ml、1.31μg/ml、1.53μg/ml、1.20μg/ml、1.15μg/ml、5.53μg/ml、0.85μg/ml、1.08μg/ml和1.65μg/ml。血清的最佳稀释度Pfk B为1:50,Esx R为1:400,Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Fad D28、Dev S、Mog及多肽的血清最佳稀释度均为1:100。该实验选取了104份阳性血清和104份阴性血清,ELISA法分别对10种蛋白抗原及13条多肽进行血清学评价。使用SPSS17.0软件分析实验数据,Pfk B、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、Esx R、Fad D28、Dev S和Mog的灵敏度分别为73.08%、54.81%、58.65%、94.23%、79.81%、77.88%、92.31%、86.54%、91.35%、89.42%,特异度分别为90.57%、94.34%、87.74%、59.43%、86.79%、77.36%、62.26%、82.08%、83.96%、69.81%,ROC曲线下面积分别为0.882、0.789、0.773、0.825、0.884、0.851、0.822、0.891、0.870和0.901。除Rv2628、Rv2653c的Youden指数小于0.5外,其它蛋白的Youden指数均大于0.5,Mog的Youden指数最大为0.734。Sod C的3条B细胞表位多肽,灵敏度分别为88.46%、65.38%、72.12%,特异度为75.96%、91.35%和89.42%,ROC曲线下面积均大于0.85。Mog蛋白的4条B细胞表位多肽中P209的灵敏度、特异度最高,分别为88.46%、88.69%,ROC曲线下面积为0.934。Rv1566c的6条B细胞表位多肽,灵敏度范围为77.88%~92.31%,特异度介于69.23%~85.58%,ROC曲线下面积均大于0.849。本研究成功地筛选出3个结核分枝杆菌新抗原,完成了3个新抗原的13条B细胞线性表位的预测、筛选及多肽的合成,新抗原Mog成功预测构象表位。构象表位Mog及9种已知的特异蛋白抗原完成了克隆、表达和纯化。用血清学抗体检测方法评价了结核分枝杆菌B细胞表位多肽及重组蛋白的抗原性。研究结果将为研制结核病特异诊断试剂和新疫苗提供依据。
王评评[5]2011年在《拟态弧菌OmpU抗原B细胞线性表位的筛选与鉴定》文中提出拟态弧菌(Vibrio mimicus,Vm)是一种水产养殖动物和人共患病病原菌。该菌不仅可引起水产养殖动物严重的腹水病，而且可通过水体和水产品感染人类，导致人类腹泻和食物中毒[1-6]。针对腹水病已成为制约水产养殖业健康发展的现状，开展该病快速诊断方法的研究以及研制其有效疫苗具有十分重要意义，而筛选出理想的侯选抗原或抗原表位则是急需解决的首要问题。本研究联合采用表位预测和实验验证方法对拟态弧菌OmpU蛋白B细胞线性表位进行筛选鉴定，并分析表位间的免疫活性差异，为建立基于抗原表位的快速诊断方法和研制表位疫苗奠定基础。首先，通过生物信息学软件DNAStar Protean综合分析OmpU蛋白的二级结构、柔性区域、表面可及性、亲水性和抗原指数，预测OmpU蛋白可能的B细胞线性表位。在应用Moe2008软件构建OmpU蛋白叁维结构（3D）的基础上，利用Synchronize可视化程序将10个预测表位肽序列展示于OmpU蛋白3D结构上，筛选出位于3D结构表面的7个肽段作为最可能的B细胞线性表位，并进行生物合成，用于鉴定。其次，将OmpU蛋白主要抗原域基因OmpUa亚克隆至表达载体pAML-c4x中进行诱导表达与鉴定，分析重组蛋白的表达形式。根据pAML-c4x表达载体阅读框的要求，设计1对包含Sal I和Hind III酶切位点的特异引物，以拟态弧菌基因组DNA为模板，扩增OmpUa基因，将OmpUa基因克隆至pMD-18T载体中构建重组克隆质粒pMD-18T-OmpUa。pMD-18T-OmpUa经Sal I/Hind III双酶切后，将OmpUa基因亚克隆至表达载体pAML-c4x中构建重组表达质粒pAML-c4x-OmpUa，并转化至大肠杆菌TB1。基因工程重组菌pAML-c4x-OmpUa/TB1经IPTG诱导表达后，收集菌体蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定，SDS-PAGE结果显示出现一条与预期融合蛋白MBP-OmpUa相对分子量大小相同的浓染蛋白条带；Western-blot结果显示重组融合蛋白能被兔抗MBP抗体所识别。这些结果表明OmpUa基因在原核细胞中得到成功表达。基因工程重组菌pAML-c4x-OmpUa/TB1经16℃诱导表达后，分别提取胞内可溶性部分和包涵体进行SDS-PAGE分析，结果显示重组融合蛋白主要以可溶性形式表达。再次，以纯化的重组融合蛋白MBP-OmpUa为抗原制备特异性抗体。重组融合蛋白MBP-OmpUa经麦芽糖直链淀粉树脂纯化后，与双相乳化佐剂充分乳化制成免疫原，并按照一定的免疫程序免疫家兔制备兔抗MBP-OmpUa抗体。结果发现在免疫后第14天即可检测出血清特异性抗体，免疫后第28天血清抗体的ELISA效价达到1:4096000，琼扩效价达到1:32，完全可以满足后续实验的要求。最后，采用肽ELISA方法鉴定预测表位肽，分析不同表位间免疫反应性的大小。以40μg/ml预测表位肽及一个无关肽为包被抗原，以1:400稀释度的兔抗MBP-OmpU抗体、兔抗MBP抗体及阴性血清为一抗，1:7000浓度羊抗兔HRP-IgG为二抗，采用间接ELISA方法检测各预测表位肽的免疫反应性。结果显示7个预测表位肽均能与兔抗MBP-OmpUa抗体发生结合反应而不能与兔抗MBP抗体发生反应，而序列无关肽与上述两种抗体均不发生反应，表明7个预测表位肽均能被兔抗MBP-OmpUa抗体特异性识别，它们保留了天然OmpU蛋白的免疫反应性，是OmpU蛋白的真正表位。7个表位的免疫反应性大小依次为表位3（aa90-98）、表位4（aa239-250）、表位6（aa183-195）、表位2（aa117-126）、表位1（aa25-33）、表位5（aa173-180）和表位7（aa211-218）。综上所述，联合采用表位预测和实验验证方法首次筛选鉴定出拟态弧菌OmpU蛋白的7个B细胞线性表位。它们分别位于OmpU蛋白的25～33、56～66、90～98、100～106、117～125、173～180、184～192、211～218、239～250和284～295氨基酸区段。
殷启风[6]2017年在《人CD55抗原模拟表位的筛选及其对乳腺癌细胞的抑瘤作用研究》文中提出目的:利用噬菌体肽库展示技术从Ph.D.12噬菌体肽库中筛选能够和人CD55单克隆抗体(CD55 Mc Ab)特异性结合的短肽,从中找到CD55的抗原模拟表位,设计出与人肿瘤免疫逃逸蛋白CD55同源的的短肽,为肿瘤治疗奠定理论基础。方法:以人CD55单克隆抗体为靶标,Ph.D.12肽库通过4轮噬菌体筛选淘选出与CD55单克隆抗体特异性结合的短肽,计算每轮回收率。4轮筛选后,随机挑选11个噬菌体单克隆和野生型噬菌体进行竞争结合,计算其结合力。利用ELISA、竞争结合实验鉴定筛选出结合力强的噬菌体单克隆,E.coli ER2378宿主菌表达和纯化噬菌体。将阳性噬菌体克隆交由公司测序,测序结果里找出出现频率高的短肽序列,设计与人CD55单克隆抗体具有高亲和性及特异性的短肽,并对其体外抗乳腺癌作用效果进行研究。CCK8实验检测CD55抗原模拟表位对乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MCF-7细胞)增殖的影响。荧光显微镜验证短肽在细胞中的摄入和分布。透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)和流式细胞术检测该短肽在乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞凋亡中的影响。结果:4轮筛选后,每轮噬菌体回收率都达到了较高数量级。竞争结合实验结果显示11个噬菌体单克隆和第3、4轮筛选后的噬菌体都与CD55单克隆抗体亲和力都非常显着。ELISA结果显示有8个噬菌体单克隆和CD55单克隆抗体亲和力显着。根据测序结果得到两条高表达短肽序列HAHTPTRGVMHA(简称H肽)和QVNGLGERSQQM(简称Q肽)。CCK8实验证明Q短肽序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞的毒性作用显着且具有剂量依赖性,而H短肽较Q肽药效较差,达到相同抑瘤率所需作用浓度较高。荧光显微镜观察到Q短肽分布在细胞膜表面。透射电镜和流式细胞术显示Q短肽具有诱导MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡的作用。结论:利用噬菌体随机12肽库成功得到两条CD55单克隆抗体特异性结合的CD55抗原模拟表位短肽序列HAHTPTRGVMHA和QVNGLGERSQQM,其中Q肽比H肽作用更显着,能够抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡,为乳腺癌靶向治疗提供新思路和新靶标。
张秋丽[7]2017年在《猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选》文中提出猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus,PCV2)是引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原,它能损害患病仔猪的免疫系统,引发其他多种病原混合感染或继发性感染,导致猪的繁殖能力严重下降,给养猪业带来了巨大的经济损失。PCV2感染的早期诊断对PCVD的综合防控具有重大意义。目前,针对PCV2病原的快速检测方法主要有胶体金免疫层析试纸法和ELISA检测方法等,其所用抗体主要是基于杂交瘤细胞制备的单克隆抗体,传统单克隆抗体存在生产周期长、成本高、稳定性差等缺点,在一定程度上限制了PCV2快速、高效、廉价的检测方法的研制。而基因工程方法制备的单链抗体具有生产周期短,成本低、易于改造等优点,其有望取代传统单抗用于PCV2新型免疫学检测方法的研制。实验的主要内容与结果如下:1.PCV2 Cap蛋白的纯化及鉴定本实验将重组表达载体pET28a-ORF2转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析法对目的蛋白进行纯化,并对蛋白进行鉴定。结果显示表达的重组蛋白分子量约26 kDa,主要以可溶形式存在,且能被His单克隆抗体特异性识别,纯化后的重组蛋白纯度比较高。用此蛋白免疫BALB/C鼠,免疫后,经ELISA检测,测得鼠血清中抗体滴度达1∶64000,同时用PCV2抗体检测试纸对鼠血清进行检测,结果为阳性。本实验制备的重组Cap蛋白具有可溶性好、纯度高、免疫原性好等特点,为Cap蛋白单链抗体库的构建提供了必要的实验材料。2.PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选选取免疫效果较好的小鼠脾脏,提取其脾脏总RNA,再以反转录后的cDNA为模板,PCR扩增抗体的重链可变区基因(Heavy chain variable region of antibody,VH)和抗体的轻链可变区基因(Light chain variable region of antibody,VL),经重迭PCR将VH与VL用多肽(G4S)3连接,获得单链抗体基因(Single chain antibody variable region gene fragment,ScFv)。经辅助噬菌体辅助侵染后获得噬菌体单链抗体库,用Cap蛋白作为包被原筛选PCV2单链抗体克隆,获得3株与Cap蛋白特异性反应的噬菌体克隆。取特异性及反应性相对较高的克隆测序,获得PCV2单链抗体基因,并用ELISA鉴定ScFv-P18菌株的诱导表达后粗提物,结果显示获得的粗提物能与Cap蛋白发生反应。本研究表达并纯化到了可溶性PCV2 Cap蛋白,并构建PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库,筛选到具有结合活性的特异性单链抗体,其有望用于PCV2新型快速检测方法的研制。
顾海燕[8]2008年在《A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体的制备及其结合表位的初步定位》文中研究指明目的:A族溶血性链球菌(GAS)是咽部、皮肤、软组织感染的常见致病菌,也是引起儿童中毒性疾病猩红热、毒性休克综合征等的病原,它的危害还在于可以导致感染后的自身免疫性疾病风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎、牛皮癣以及免疫性脑病等。由于耐药菌株的出现及链球菌本身的免疫逃逸,临床上链球菌感染仍然存在着反复性及难以治愈等问题,疫苗有望成为控制链球菌感染的最有效措施。尽管研究链球菌疫苗的历史可以追溯至四十年前,但各种原因导致目前仍没有理想的疫苗问世。M蛋白由于血清型众多及其与人的心脏、肾脏等发生交叉免疫反应,因此其应用受到限制。除此以外,寻求非M蛋白疫苗的脚步也没有停止。世界各地不同实验室的研究涉及到链球菌的F1蛋白、Sse蛋白、C5肽酶、链球菌糖、外毒素等,但免疫效果始终难以超越M蛋白,因此非M蛋白与M蛋白的联合构建也是一种趋势。Fba蛋白(Fibronectin-binding protein a)是2001年由Terao等发现的一种新的链球菌表面蛋白,它与金黄色葡萄球菌Fn结合蛋白(FnBPA)同源性高达69%,其基因被定为Spy2009。经测定该基因含有1068个核苷酸,编码355个氨基酸,分子量为37.8Kda。整个肽链从N端分为信号肽区,双螺旋结构区,富含脯氨酸区及C端的锚定区。它存在于链球菌的M1、2、4、9、13、22、28、44、49、60、67、75、77、79、80、82、87和89等多个血清型中,各型之间的Fba蛋白差异不大。实验结果显示表达Fba蛋白的GAS(Fba+ GAS)侵入上皮细胞的能力较强。它还可以结合补体调节蛋白FH和FHL-1,并可能借此逃避补体攻击、抵抗巨噬细胞的调理吞噬。本室前期研究发现Fba蛋白可诱发与M蛋白相当的保护性免疫应答,因此Fba蛋白具备作为GAS疫苗候选蛋白的极其有利的潜质。本研究旨在研制抗Fba蛋白的单克隆抗体,根据Fba蛋白的结构进行分段克隆表达,并对获得的单克隆抗体结合区域进行初步鉴定,为进一步研究Fba蛋白功能及研制其表位肽疫苗奠定基础。方法:1将GST-Fba重组蛋白联合佐剂免疫雌性BALB/c小鼠。以GST-Fba重组蛋白为包被抗原,采用间接ELISA方法检测小鼠抗血清效价。取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经HAT培养基选择培养,间接ELISA法筛选阳性克隆,有限稀释法进行克隆化,获得稳定分泌抗A族链球菌表面Fba蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,接种小鼠腹腔制备腹水。2鉴定单克隆抗体。以重组的GST-Fba蛋白为抗原包被,采用间接ELISA法测定腹水及上清单克隆抗体效价,免疫印迹分析单克隆抗体特异性,采用全菌ELISA鉴定单克隆抗体的抗原表位是否为位于菌体表面的天然表位。3根据Fba蛋白的结构特点将其划分为四个重迭区域,划分结果为:37~110aa、68~161aa、104~277aa、160~324aa。分别命名为FbaA1、FbaA2、FbaA3、FbaA4。4 PCR方法扩增分段fba基因,PCR产物克隆至原核表达质粒pGEX-2T,测序正确后将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导分段重组蛋白的表达,SDS-PAGE电泳观察结果,Western- blotting鉴定。亲和层析柱纯化重组蛋白。5免疫印迹法、ELISA法鉴定单克隆抗体与四段蛋白的结合区段。6在线预测Fba蛋白的B细胞表位。结果:1经3次亚克隆后获得两株稳定分泌抗GST-Fba融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。分别命名为1号单抗、2号单抗。融合率为37.1%,GST和GST-Fba蛋白双筛阳性克隆率为2%。2杂交瘤细胞培养上清抗体最高效价达1:640,腹水抗体最高效价达1:105。免疫印迹法显示单克隆抗体与GST-Fba融合蛋白有特异性反应带,与GST则未见有反应条带。全菌ELISA结果显示所得的1号单抗和Fba+及Fba-菌的结合力无明显的区别,说明此单抗所针对的表位不位于菌体表面,或并非Fba蛋白的天然表位,也可能与非Fba蛋白存在着交叉反应。2号单抗显示其可以特异的结合Fba+菌,和Fba-菌的结合能力极弱,表明2号单抗结合的表位为位于菌体表面的Fba特异的天然线性表位。3 PCR扩增产物大小约242bp、302bp、540bp、512bp与理论值相附。4表达的重组菌经SDS-PAGE分析出现四条强的诱导表达带,未经诱导的重组菌此处的蛋白带较弱。免疫印迹分析显示表达的该重组蛋白能被抗GST的单克隆抗体识别,说明重组菌表达了Fba的分段融合蛋白。5单抗与表达的四段蛋白的免疫印迹法鉴定结果显示1号单抗结合FbaA3及FbaA4段,2号单抗仅仅结合FbaA2段。ELISA法结果显示与免疫印迹法鉴定结果相一致。2号单抗仅结合FbaA2段,与FbaA1及FbaA3段不结合,其结合的表位可能位于104-110aa左右。6实验结果与在线预测B细胞表位结果相符。结论:1本研究通过常规细胞融合,成功筛选出2株针对Fba蛋白杂交瘤细胞株,并证明了该单抗的生物学活性,为深入研究GAS的致病机制提供了有力的工具。2成功克隆、表达了Fba分段蛋白,初步鉴定出两株单抗的结合区域,为进一步研究Fba蛋白的功能,确定Fba蛋白表位及表位疫苗的研制奠定了基础。
陈小红[9]2016年在《2型猪圆环病毒衣壳蛋白的表达生产》文中提出2型猪圆环病毒(PCV2)是一种侵略性病原,可引起猪的一系列相关疾病(PCVAD),给世界范围内的养猪业造成重大经济损失。PCV2的衣壳蛋白(Cap)是重要的保护性抗原,CapN端41个氨基酸为核定位信号序列(NLS),研究表明NLS序列中不包含蛋白的抗原表位,所以截短NLS序列后的Cap (tCap)与原蛋白相比具有相同的免疫原性,都具有开发成为PCV2亚单位疫苗的潜力。本文利用大肠杆菌,毕赤酵母,杆状病毒叁个表达系统对tCap进行表达生产,为PCV2亚单位疫苗的开发打下了基础。首先,我们在大肠杆菌系统中进行了tCap的表达。将密码子优化的opti-tcap口tcap分别插入到pET28a(+)载体后转入大肠杆菌BL21菌株中表达。对表达的蛋白进行分析发现,密码子优化提升了活性tCap的表达量。收获的tCap通过双向琼脂扩散试验进行体外检测,效价达到1：8,显示出了良好的免疫原性。其次,我们在毕赤酵母GS115系统中进行了tCap的分泌表达。将密码子优化的opti-tcapl和tcap分别插入pPIC9K表达载体中,通过筛选获得表达质粒高拷贝整合的菌株,并在5L生物反应器中进行了菌株的高密度发酵。发酵液上清中检测到了tCap蛋白的分泌表达,产量达到0.25g/L。进一步在小鼠和猪模型上进行了纯化tCap蛋白的体内免疫实验,结果证明：tCap能够在动物体内激发PCV2 Cap特异性抗体的产生,其抗体激活水平与商业化亚单位疫苗相当。最后,我们在昆虫细胞Sf9系统中进行了tCap的表达。将tcap插入到pFastBacHTB转移载体中,通过转座交换到杆状病毒质粒bacmid上。将重组杆状病毒质粒Bacmid-tcap转入Sf9细胞中,收获病毒,并用P3代病毒感染细胞以表达tCap。实验结果表明：杆状病毒表达的可溶性tCap具有良好的免疫原性,体外能够检测到1倍抗体效价。
谭强[10]2014年在《羊口疮病毒的分离鉴定及B2L囊膜蛋白单克隆抗体的制备》文中进行了进一步梳理羊传染性脓疱病（Orf）由羊口疮病毒（Orf Virus，ORFV）引起，是世界范围内危害养羊业发展的人畜共患疾病之一。ORFV不仅能引起小型反刍动物和部分野生动物感染，还可能污染环境，造成与受污染环境密切接触的人员感染发病。目前，一般采用ORFV灭活苗或弱毒苗接种，但效果并不理想，有时会出现免疫羊感染ORFV的情况。由于细胞免疫应答是ORFV引起宿主的主要免疫类型，因此，研制T细胞表位和B细胞表位组合的多表位基因工程疫苗，能够强化细胞免疫途径以及激活高效的体液免疫应答途径，对Orf的防控将有重要的应用价值。本研究在黑龙江大庆地区发现Orf疑似病例，通过病原分离、病毒形态学观察、间接免疫荧光检测（IFA）、DNA序列和氨基酸序列比对、家兔和小鼠的感染试验以及回归动物试验等，最终确定获得一株ORFV，命名为OV/HLJ/04。流行株之间遗传关系分析证明OV/HLJ/04与2011年山西株（HQ221964）之间遗传关系密切。此外，基于B2L基因的系统发育进化树表明OV/HLJ/04应当归类于基因Ⅲ型ORFV。继而，本研究选择ORFV的囊膜蛋白B2L基因为靶基因，构建原核表达载体，将表达产物纯化后用于免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠，制备单克隆抗体。通过杂交瘤技术获得了3株能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，其中2E4具备中和ORFV毒力的能力。抗体的间接ELISA试验和Western Blot证明，2E4能够特异性识别B2L蛋白，显示出良好的抗体—抗原特异性。B2L蛋白单抗的制备、生物学特性分析和单抗腹水制备，为ORFV的实验室诊断提供了更为便捷的方法。
参考文献：
[1]. 应用细菌表面展示技术快速筛选抗原表位及研制应急疫苗[D]. 辛忠涛. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. 抗汉坦病毒单克隆抗体可变区基因分析及其噬菌体配体肽的筛选和鉴定[D]. 王长军. 第叁军医大学. 2003
[3]. 拟态弧菌OmpU抗原模拟表位的筛选鉴定及其免疫特性分析[D]. 岑峻宇. 安徽农业大学. 2012
[4]. 结核分枝杆菌人新B细胞表位及10种特异蛋白的抗原性研究[D]. 徐永娟. 南华大学. 2016
[5]. 拟态弧菌OmpU抗原B细胞线性表位的筛选与鉴定[D]. 王评评. 安徽农业大学. 2011
[6]. 人CD55抗原模拟表位的筛选及其对乳腺癌细胞的抑瘤作用研究[D]. 殷启风. 青岛大学. 2017
[7]. 猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 张秋丽. 郑州大学. 2017
[8]. A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体的制备及其结合表位的初步定位[D]. 顾海燕. 河北医科大学. 2008
[9]. 2型猪圆环病毒衣壳蛋白的表达生产[D]. 陈小红. 华东理工大学. 2016
[10]. 羊口疮病毒的分离鉴定及B2L囊膜蛋白单克隆抗体的制备[D]. 谭强. 黑龙江八一农垦大学. 2014
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