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草莓FaWRKY44基因克隆及功能鉴定

2020-12-02阅读(375)

草莓FaWRKY44基因克隆及功能鉴定

论文摘要

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属多年生草本植物。草莓的果实中含有大量类黄酮物质。花青素为其中主要的类黄酮物质,其保健功能和经济价值均值得重视。研究发现WRKY家族成员拟南芥TTG2和矮牵牛PH3均参与植物体内花青素和原花青素的生物合成。基于Wei和Zhou等对二倍体森林草莓中WRKY家族成员鉴定结果,通过BLAST确定栽培草莓FaWRKY44为拟南芥TTG2与矮牵牛PH3的同源基因,实验证明同源基因FaWRKY44也参与植物体内花青素和原花青素的生物合成。本研究得到以下结论:(1)通过克隆得到FaWRKY44基因的CDS区1407bp,生物信息学分析显示其蛋白的分子量为116.29kD,无信号肽和跨膜结构。通过亚细胞定位确定该基因位于细胞核。克隆得到FaWRKY44启动子序列2000bp,生物信息学分析显示启动子含有响应光、逆境胁迫、植物激素等顺式作用元件。(2)运用荧光定量构建FaWRKY44表达谱,结果如下:该基因在功能叶表达量最高,全红果实中表达量最少;表达量受蓝光抑制;对于低钾、ABA、盐害、干旱、低磷和低温逆境均有规律性表达。(3)原核表达获得可溶性FaWRKY44重组蛋白,分子量78.8Kd,GST树脂柱可纯化该蛋白。(4)草莓中瞬时VIGS沉默FaWRKY44成功,注射区域呈白色,果实中花青素含量极显著下降,原花青素含量极显著上升。草莓中瞬时过表达FaWRKY44成功,注射区域呈粉红色,果实中花青素含量极显著上升,原花青素含量显著下降。荧光定量结果表明FaWRKY44对DFR、CHS、MYB10和ATP10基因显著正调控,对原花青素调控路径影响不显著,推测FaWRKY44调控花青素方式与矮牵牛PH3通过直接作用花青素调控类黄酮路径类似。本实验初步鉴定了FaWRKY44的生物功能,为该基因在草莓分子育种的研究中提供现实参考。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 1.文献综述
  •   1.1 引言
  •   1.2 花青素的研究现状
  •     1.2.1 花青素的分类
  •     1.2.2 花青素的生物合成
  •     1.2.3 花青素的转录调控
  •   1.3 WRKY转录因子家族的研究进展
  •     1.3.1 WRKY转录因子家族结构特征及分类
  •     1.3.2 WRKY与生物胁迫、非生物胁迫以及生长发育的研究
  •     1.3.3 WRKY与类黄酮调控的研究
  •   1.4 本研究的内容及意义
  • 2.材料与方法
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 红蓝光及逆境处理材料
  •     2.1.2 时空表达材料
  •   2.2 菌株与质粒
  •   2.3 试剂和试剂盒
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 草莓果实总RNA的提取及cDNA第一链的合成
  •     2.4.2 草莓果实DNA的提取
  •     2.4.3 草莓FaWRKY44 基因克隆、生物信息学分析及亚细胞定位
  •     2.4.4 FaWRKY44 基因的亚细胞定位
  •     2.4.5 草莓FaWRKY44 基因启动子克隆、生物信息学分析
  •     2.4.6 FaWRKY44 基因的表达分析
  •     2.4.7 原核表达及蛋白纯化
  •     2.4.8 FaWRKY44 功能验证
  • 3 结果与分析
  •   3.1 总RNA和 DNA的提取
  •   3.2 FaWRKY44 基因及其启动子的克隆
  •   3.3 FaWRKY44 基因的生物信息学分析
  •     3.3.1 FaWRKY44 编码蛋白的特征
  •     3.3.2 FaWRKY44 蛋白结构预测
  •     3.3.3 FaWRKY44 的进化树分析
  •     3.3.4 草莓FaWRKY44 启动子顺势作用元件分析
  •   3.4 FaWRKY44 基因的亚细胞定位
  •   3.5 FaWRKY44 基因的表达
  •     3.5.1 草莓FaWRKY44 基因时空表达
  •     3.5.2 草莓FaWRKY44 基因红蓝光处理下的表达
  •     3.5.3 草莓FaWRKY44 基因在不同逆境下的表达
  •   3.6 原核表达及蛋白纯化
  •     3.6.1 原核表达载体构建
  •     3.6.2 重组蛋白的表达及分析
  •     3.6.3 草莓FaWRKY44 蛋白的纯化
  •   3.7 草莓FaWRKY44 功能验证
  •     3.7.1 VIGS验证
  •     3.7.2 瞬时过表达注射验证
  • 4 讨论
  •   4.1 FaWRKY44 基因及其启动子的分析
  •     4.1.1 FaWRKY44 基因的生物学信息学分析及亚细胞定位
  •     4.1.2 FaWRKY44 基因启动子功能预测
  •   4.2 FaWRKY44 基因的表达
  •     4.2.1 草莓FaWRKY44 基因的时空表达
  •     4.2.2 红蓝光处理下FaWRKY44 基因的表达
  •     4.2.3 草莓FaWRKY44 基因不同逆境下的表达
  •   4.3 FaWRKY44 基因的原核表达及蛋白纯化
  •   4.4 FaWRKY44 功能研究
  • 5.结论
  • 6.展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王熙然

    导师: 汤浩茹

    关键词: 草莓,蛋白纯化,功能验证,花青素

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,园艺

    单位: 四川农业大学

    分类号: S668.4;Q943.2

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000885

    总页数: 60

    文件大小: 3067k

    下载量: 37

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