王润芝, 吴皓, 刘一鸣, 曹丁, 吴涯昆[1]2016年在《阻断Kupffer细胞IRE1-XBP1通路对大鼠肝移植排斥反应的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨阻断Kupffer细胞IRE-XBP1通路对大鼠原位肝移植排斥反应的作用。方法术前用Gd Cl3处理或未处理建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,未处理大鼠随机数字法分为XBP1-shRNA组(A组),Scrambled-shRNA组(B组),PBS组(C组);处理大鼠随机分为Gd Cl3+XBP1-shRNA组(D组),Gd Cl3+Scrambled-shRNA组(E组),Gd Cl3+PBS组(F组)。未处理组术后检测血清ALT、AST、IFN-γ、IL-10、IL-17的表达水平;RT-PCR检测T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA水平;Western blot检测CD86、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构,根据Banff方案进行RAI评分,各组剩余大鼠观察术后生存率。处理组术后检测IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA以及蛋白表达水平,HE染色观察肝组织结构。结果在未处理组中,与B、C组比较,A组各时间点肝功能指标ALT、AST明显下降(P<0.05),A组血清表达IFN-γ、IL-10明显受到抑制(P<0.05),IL-10的表达水平则呈明显上升趋势(P<0.05),与RT-PCR和Western blot结果趋势相符合,另外A组CD86蛋白表明显下降(P<0.05),而表达CD206上升(P<0.05),T-bet/RORγt mRNA相对表达量也明显下降(P<0.05),B、C组上述指标与A组对比则呈相反趋势,而且B、C组之间比较差异无统计学意义(P>0.05);A组RAI评分(3.83±0.14),明显低于B、C组RAI评分(9.13±0.20)、(8.95±0.26)(P<0.05),并且A组大鼠的生存时间明显高于B、C组大鼠(P<0.05)。在处理组中,D、E和F组肝脏局部IFN-γ、IL-17、IL-10 mRNA和蛋白表达情况以及病理组织AcR程度比较无统计学上的差异(P>0.05)。结论阻断IRE1-XBP1通路促进了KCs的M1型极化,引起Th1/Th17向Th2/Treg的免疫偏移,在一定程度上减轻了移植肝脏急性排斥反应的程度。
姚辉华[2]2004年在《Kupffer细胞功能对大鼠肝移植急性排斥反应的影响》文中研究说明目的 (1) 探讨建立稳定大鼠原位肝移植模型的方法,观察Wistar→SD大鼠肝移植后急性排斥反应的发生,以选择适宜、可靠的大鼠原位肝移植急性排斥模型。(2) 氯化钆、非损伤剂量脂多糖(LPS)及门静脉输血预处理改变Kupffer细胞功能,研究其对移植后Kupffer细胞FasL表达、脾淋巴细胞增殖与杀伤作用的影响。(3) 研究Kupffer细胞功能改变对大鼠肝移植急性排斥反应的影响,探讨其可能的机制,进一步探索Kupffer细胞在同种异基因大鼠肝移植免疫耐受诱导中的作用。通过以上叁部分实验,试图进一步阐明Kupffer细胞在大鼠原位肝移植免疫耐受诱导中的确切作用,为进一步利用Kupffer细胞特异性地诱导肝移植免疫耐受的实验研究及临床应用提供依据和基础。 方法 (1) 参照Kamada“二袖套法”,加以适当改进,建立Wistar→SD大鼠原位肝移植动物模型,并以Wistar→Wistar大鼠原位肝移植为对照,观察两组受鼠生存时间,全自动生化分析仪测定术后3天、5天、7天血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平变化,观察肝脏组织病理改变。(2) 氯化钆、非损伤剂量脂多糖(LPS)及门静脉输血1ml预处理供体Wistar大鼠以改变Kupffer细胞功能,未处理组为对照。肝移植后7天分离上述四组动物肝脏Kupffer细胞,对分离的Kupffer细胞进行计数,流式细胞技术检测Kupffer细胞的FasL表达。各组Kupffer细胞与激活SD脾淋巴细胞混合培养,MTT法检测淋巴细胞增殖,流式细胞技术检测淋巴细胞凋亡百分率。(3) 按上述方法建立Wistar→SD大鼠肝移植动物模型和进行动物分组,观察各组生存时间;观察术后7天肝脏功能和组织病理改变,双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清细胞因子白介素-10(IL-10)、转化生长因子β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子
梁绍勇[3]2008年在《肝再生增强因子防治大鼠肝移植急性排斥反应实验研究》文中进行了进一步梳理目的(1)通过建立大鼠原位肝移植动物实验,观察从Lewis大鼠供体到BN大鼠受体肝移植后移植肝脏能否产生急性排斥反应,以及输入肝再生增强因子(Agumenter of liver regeneration, ALR)后,对移植肝脏免疫急性排斥反应(Acute rejection, AR)的影响。(2)观察移植肝脏中Th1淋巴细胞因子IL-2和IFN-γ基因和蛋白质的表达以及肝脏内淋巴细胞的凋亡率和活化率,以了解ALR对肝脏内淋巴细胞的影响。(3)观察移植肝脏中枯否细胞(Kupffer cells, KCs)细胞因子TNF-α和IL-2基因和蛋白质的表达变化,阐明ALR对KCs功能的影响。(4)通过体外分离培养脾脏淋巴细胞和肝脏KCs,观察KCs在ALR抑制脾脏淋巴细胞的增殖活化、凋亡和细胞因子表达的作用,探讨KCs在ALR改善大鼠肝移植后急性排斥反应中的作用机制。通过以上四部分实验,试图阐明ALR在大鼠原位肝移植急性排斥反应中的作用及其确切机制。方法(1)按“二袖套法”建立近交系大鼠原位肝移植动物模型,将大鼠分为3组:①同基因移植组(Isograft group),②同种异基因组(Allograft group),③同种异基因ALR干预组(ALR group)。后者于移植后用ALR 100μg/kg经尾静脉注入受体大鼠体内,以后每日腹腔内注射ALR 100μg/kg至处死受体大鼠。分别于术后3天、5天和7天活杀,收集标本。观察各组受鼠存活率;急性排斥反应组织病理学分级按Banff标准进行,各项评分的总和为最终急性排斥反应评分,即急性排斥反应指数(rejection activity index, RAI);全自动生化分析法测定血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平变化,确定近交系大鼠同种异基因肝移植后急性排斥反应的形成及ALR对移植肝脏急性排斥反应的影响。(2)肝移植7天后分离上述叁组动物肝脏淋巴细胞,对分离淋巴细胞用流式细胞仪检测淋巴细胞活化率和凋亡率,用real time-PCR法测定淋巴细胞中IFN和IL-2基因表达,用免疫组化法和Western blot蛋白印迹等方法测定淋巴细胞中IFN和IL-2蛋白质表达;探讨ALR减轻大鼠肝移植后急性排斥反应的机制。(3)按上述方法建立大鼠肝移植动物模型和进行动物分组,于肝移植术后7天活杀动物取其肝脏分离KCs,提取KCs中的总蛋白和总RNA,用免疫组化法测定肝组织中TNF-α和IL-10的基因表达,用Western blot蛋白印迹法和Real time-PCR法测定KCs中TNF-α和IL-10基因和蛋白质的表达,探讨ALR对肝移植后KCs功能的影响,阐明ALR减轻大鼠肝移植后急性排斥反应的机制。(4)分别分离BN大鼠KCs和Lewis大鼠脾脏淋巴细胞。共分为4组:①ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞(A组),②ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+30μg/ml ALR(B组),③ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+KCs(C组),④ConA 5μg/ml+脾脏淋巴细胞+KCs+30μg/ml ALR(D组)。用流式细胞仪检测各组脾脏淋巴细胞凋亡率和活化率;H3掺入法检测脾脏淋巴细胞增殖;ELISA检测各组IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α细胞因子水平。结果(1)叁组大鼠原位肝移植主要手术步骤所需时间无明显差异。在未应用任何免疫抑制剂的情况下,Allograft组大鼠原位肝移植后叁天后开始出现急性排斥反应,7天时进展迅速。术后3天,叁组大鼠RAI评分和肝功能没有明显差异(P>0.05)。术后5天各组RAI评分分别为:Allograft组(6.33±1.03), Isograft组(1.50±0.55)和ALR组(2.83±0.75);ALR组和Isograft组急性排斥反应,肝功能损害较Allograft组明显减轻(P<0.05)。术后7天RAI评分分别为:Allograft组(8.17±0.75),Isograft组(1.33±0.52)和ALR组(2.83±0.75);Allograft组急性排斥反应进一步加重,肝功能进一步恶化,而ALR组和Isograft组变化不明显(P>0.05)。叁组平均生存时间分别为:Allograft组(11.17±1.47d), Isograft组(49.67±17.31d)和ALR组(46.17±10.22d);ALR组受体大鼠的平均生存时间较Allograft组明显延长(P<0.05)。(2)肝移植组术后7天,肝移植组中免疫组织化学显示:Allograft组IL-2和IFN-γ在肝脏组织中较Isograft组表达明显增高,主要集中于汇管区的淋巴细胞和枯否细胞胞浆中;而在ALR组,这种增高的表达被明显减弱。Realtime-PCR检测分离的肝脏淋巴细胞中IL-2和IFN-γ基因转录,Allograft组分别为:8.53±0.75和9.32±0.83,较Isograft组(1.96±0.24和1.29±0.19)明显增加(P<0.05); ALR组分别为:2.19±0.19和1.48±0.21,同种异基因肝移植后应用ALR能够明显减弱淋巴细胞中IL-2和IFN-γ基因转录,与Allograft组比较有显着性差异(P<0.05),但与Isograft组比较无显着性差异(P>0.05)。Western blot蛋白印迹法测定IL-2和IFN-γ基因表达三组分别为:Isograft组(0.0079±0.0006和0671±0.011),ALR组(0.0102±0.0005和0.0954±0.0006)和Allograft组(0.0917±0.001和0.1963±0.0007);显示出相同的趋势。肝移植后分离的受体大鼠肝脏淋巴细胞IL-2R阳性率:Allograft组为较Isograft组明显增高分别为0.25±0.07和0.07±0.03(P<0.05);而ALR组肝脏中淋巴细胞IL-2R阳性率为0.08±0.03,与Allograft组比较明显减低(P<0.05);与Isograft组比较,无显着性差异(P>0.05)。凋亡率Allograft组为0.16±0.04,较Isograft组(0.49±0.05)和ALR组(0.45±0.06)凋亡率明显下降(P<0.05)。(3)肝移植组术后7天,肝脏组织免疫组织化学结果显示:Allograft组中肝脏组织TNF-α的表达较Isograft组明显增强,ALR能够明显抑制TNF-α的表达增强;Allograft组较Isograft组IL-10蛋白表达明显减弱,ALR能够增强IL-10的表达。Realtime-PCR测定分离的KCs中TNF-α的基因转录为8.69±0.63,较Isograft组(3.43±0.34)和ALR组(3.86±0.42)明显增高(P<0.05),ALR明显降低了同种异基因肝移植KCs中TNF-α的基因转录。Allograft组KCs中IL-10的基因转录为1.24±0.18,较Isograft组(4.58±0.57)和ALR组(5.76±0.32)明显增高(P<0.05);ALR明显增强了同种异基因肝移植KCs中IL-10的基因转录。Western blot蛋白印迹法测定TNF-α和IL-10基因表达叁组分别为:Isograft组(0.2131±0.0049和0.0404±0.0013)、ALR组(0.2586±0.0059和0.0644±0.001)和Allograft组(0.5336±0.0013和0.0157±0.0006);显示出相同的趋势。(4)在ConA的刺激下B组脾脏淋巴细胞增殖和IL-2R阳性率(2.0083±0.245×10~6cpm和0.2817±0.0392)较A组(3.9817±0.2101×10~6cpm和0.465±0.0568)明显减少(P<0.05),但是明显高于C组(1.545±0.2239×10~6cpm和0.2983±0.0319)和D组(0.64±0.1401×10~6cpm和0.0783±0.0271)(P<0.05); C、D两组中,C组淋巴细胞增殖、IL-2R阳性率明显高于D组(P<0.05)。凋亡率检测发现,B组(0.0622±0.0148)与A组(0.0457±0.008)脾脏淋巴细胞凋亡率没有明显差异(P>0.05),但是C组(0.1617±0.0263)脾脏淋巴细胞凋亡率较A和B组明显增加(P<0.05),应用ALR的D组(0.2775±0.0199)中脾脏淋巴细胞凋亡率较C组明显增加(P<0.05)。ELISA检测各组培养上清液中的细胞因子发现,B组上清液中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量(609±30.45 pg/ml、466.57±20.98 pg/ml和444.35±33.65 pg/ml)较A组(1455.83±101.35 pg/ml、894.05±23.17 pg/ml和931.48±43.34 pg/ml)显着下降(P<0.05), B组IL-10含量(155.57±16.06 pg/ml)较A组(96.65±23.18 pg/ml)升高(P<0.05)。C组中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量(695.35±30.23 pg/ml、490.77±21.5 pg/ml和410.42±21.22 pg/ml)较A组减少(P<0.05),但是IL-10含量(253.93±27.98 pg/ml)明显增加(P<0.05)。在同时加入KCs和ALR共培养的D组中IL-2、IFN-γ和TNF-α含量分别为(240.9±16.36 pg/ml、229.4±26.89 pg/ml和124.17±22.82 pg/ml)较C组明显减少(P<0.05),IL-10的含量为578.8±20.55 pg/ml,较C组明显增加(P<0.05)。四组中D组中IL-2、IFN-γ及TNF-α含量最低,IL-10含量最高;而A组则相反。结论(1)在未应用任何免疫抑制剂的情况下,从Lewis大鼠供体到BN大鼠受体之间的同种异基因原位肝移植术后7天产生明显的急性排斥反应,首次证实ALR能够明显减轻同种异基因原位肝移植术后急性排斥反应,改善肝功能,降低死亡率,延长生存时间。(2)首次证实ALR减轻同种异基因原位肝移植后急性排斥反应与ALR降低肝脏内IL-2和IFN-γ表达,进而抑制肝脏内Th1淋巴细胞活化促进凋亡有关。(3)首次证实ALR可能通过调节肝移植后移植肝脏内KCs细胞因子的表达抑制抑制肝脏内Th1淋巴细胞的功能,进而抑制急性排斥反应。(4)首次发现ALR可以直接作用于淋巴细胞,抑制淋巴细胞增殖活化,但是不能直接促进其凋亡。(5)首次证实ALR促进淋巴细胞凋亡与ALR调节KCs中细胞因子的表达,使KCs中TNF-α基因和蛋白质的表达减弱,增强抑制性细胞因子IL-10的基因和蛋白表达,促进KCs对浸入移植肝内T淋巴细胞的杀伤作用有关。
彭勇[4]2005年在《核因子-κB圈套协同CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的研究》文中进行了进一步梳理目的 (1)分离培养大鼠 Kupffer 细胞(KCs),观察在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下 KCs 的活化情况,以及 LPS 刺激前转 染 人 工 合 成 的 NF-κB 圈 套 寡 脱 氧 核 苷 酸 ( decoy oligodeoxyribonucleotide, decoy ODN)对 KCs 活化的抑制作用。(2)建立大鼠原位肝移植动物模型,总结手术技巧和方法,观察 Lewis(Lew)到 Brown Norway(BN)大鼠同种异体急性排斥反应(acute rejection, AR)的发生发展以及基本病理生理指标变化过程。(3)观察细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4-Ig(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4-Ig,CTLA4-Ig)单独应用或与 NF-κB 圈套联合应用对大鼠急性排斥反应的抑制作用。通过以上叁部分实验,试图阐明 NF-κB 圈套协同CTLA4-Ig 抗大鼠肝移植急性排斥反应的确切机制。方 法 (1)胶原酶原位灌注法分离大鼠 KCs 并随机分为 3 组:正常对照组、LPS 刺激组及 NF-κB 圈套组,后者在 LPS 刺激前用脂质体将人工合成的 NF-κB 圈套(异硫氰酸荧光素标记)转染 KCs(4μg/1x105 KCs),并通过荧光显微镜鉴定转染效果。除对照组外,两个实验组培养液中加入终浓度为 1mg/L 的 LPS,于 LPS 刺激 6h 后,检测 KCs 吞噬功能改变(吞噬墨汁实验),免疫组化检测 NF-κB 细胞内易位情况,凝胶电迁移率改变分析法(EMSA)检测 NF-κB 蛋白结合活性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 KCs 膜表面 CD80 mRNA表达, ELISA 检测培养上清 TNF-α 和 IL-6 表达情况,确定 LPS 对 KCs的激活,以及 NF-κB 圈套对 KCs 活化的抑制作用。(2)用“两袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型,即肝上下腔静脉用缝合法连续吻合,门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合,胆管内支架法完成胆道重建。实验分 3 组进行:正常对照组、同基因移植组(LEW-LEW)及同种异基因移植组(LEW-BN)。除观察大鼠存活率外,移植组受体分别于术后 3 d,5 d,7 d 和 10 d 活杀取标本,观察肝脏组织病理和超微结构变化,全自动生化分析法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平变化,ELISA 检测血清 IL-2 含量,阐明肝移植急性排斥的发生发展过程,以及基本病理生理指标变化特征。(3)按上述方法建立大鼠肝移植急排模型(LEW-BN),实验分 4 组进行:急排组(术后不给予任何免疫抑制剂处理)、CTLA4-Ig 组(移植术后当天至术后第 7 天,每天腹腔内注射 CTLA4-Ig 0.25mg/kg 体重)、NF-κB圈套组(移植术前 2 天供体经尾静脉注射 120μg 脂质体包裹的 NF-κB圈套)、联合用药组(供、受体同时接受圈套和 CTLA4-Ig 治疗,用药方法和剂量同前两组)。除观察大鼠存活率外,各组大鼠于术后第 7d活杀动物,取其肝脏分离 KCs,荧光显微镜检测圈套的转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 NF-κB 转录活性,RT-PCR 观察 KCs膜表面共刺激分子 CD80、CD40、CD54 mRNA 表达,原位杂交检测移植肝中 TNF-α、IFN-γ mRNA 表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肝脏和脾脏细胞凋亡,同时观察肝脏组织病理、超微结构,及肝功变化。阐明 NF-κB 圈套协同 CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的分子机制。结果 (1)脂质体可以介导 NF-κB 圈套高效转染 KCs,转染后48 h 荧光显微镜下鉴定转染效果达 85%;在 LPS 刺激下,培养的 KCs表现出活化特性: 吞噬墨汁功能明显增强,免疫组化显示 NF-κB 由胞浆易位进入胞核,EMSA 显示细胞核内 NF-κB 活性明显增强,RT-PCR
张光永[5]2007年在《供体Kupffer细胞功能调节对肝移植后肝脏功能和急性排斥反应影响的研究》文中研究指明研究背景：肝移植已经成为治疗终末期肝病的有效方法，但目前原发性移植肝无功能仍可高达15％，肝移植仍然面临着免疫排斥的问题，为了解决这些问题，肝移植前选择性的对供体肝脏进行预处理是一种有价值的方法。研究表明，移植肝脏是否存活的关键因素之一在于肝脏内非实质细胞的功能。Kupffer细胞是肝脏非实质细胞的重要成员之一，在肝脏损伤的病理生理变化中扮演着重要的角色，Kupffer细胞可对移植肝起一定的保护作用；但其被激活后分泌的促炎性细胞因子又可导致移植肝的损伤，而且Kupffer细胞也参与了移植肝的免疫反应。在肝移植过程中Kupffer细胞的活化是一个普遍存在的现象，如何在强化Kupffer细胞对肝脏的保护功能的同时，避免或减轻其对肝脏的损害性作用，已成为这个领域的研究重点。在移植肝的再灌注过程中，Kupffer细胞可以被活性氧类化合物和类脂化合物所激活，使其释放如促凝血素、白叁烯、前列腺素(prostaglandin，PG)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白介素(interleukin，IL)和蛋白酶等介导物质，Kupffer细胞还可上调MHCⅡ(主要组织相容性复合物Ⅱ)类抗原的表达，可引发白细胞和内皮细胞的粘连和抗原递呈，增强移植肝的抗体识别。因此对供体肝脏的Kupffer细胞进行处理，对移植肝脏的功能和免疫反应有什么样的影响是一个值得深入探讨的问题。已有动物实验表明，氯化钆可有效的抑制Kupffer细胞的活化，而对肝实质细胞、内皮细胞、体循环中的单核细胞和其它巨噬细胞功能无直接影响；甘氨酸是人体的一种非必需氨基酸，它除了对多种实体器官的缺血再灌注损伤有明显的保护作用外，对机体还有免疫抑制作用，近年来发现Kupffer细胞上存在甘氨酸受体。所以我们选择氯化钆和甘氨酸对供肝Kupffer细胞进行功能调节，研究其对肝移植后肝脏的功能和急性免疫排斥反应各有怎样的影响及其可能的机制，为进一步筛选不同调节剂调节Kupffer细胞功能，特异性地保护肝功能和减轻肝移植急性排斥的实验研究及临床应用提供依据和理论基础。目的：(1)第一部分：建立稳定大鼠原位肝移植模型，观察Wistard→Wistard和Wistard→SD大鼠模型的稳定性及是否符合实验要求，选择适宜可靠的大鼠原位肝移植免疫耐受和急性排斥模型。(2)第二部分：用氯化钆和甘氨酸处理供体Kupffer细胞，研究Kupffer细胞调节对肝移植后肝脏功能的影响，并探索其可能的作用机制。(3)第叁部分：用氯化钆和甘氨酸处理供体Kupffer细胞，研究Kupffer细胞调节对肝移植急性免疫排斥反应的影响，探讨其可能的机制。通过以上叁部分实验，为进一步筛选不同调节剂调节Kupffer细胞功能，特异性地保护肝功能和减轻肝移植急性排斥的实验研究及临床应用提供依据和理论基础。方法：(1)第一部分：参照Kamada“二袖套法”，加以适当改进，建立Wistard→Wistard和Wistard→SD大鼠原位肝移植动物模型，观察两组受鼠生存时间，测定术后3天、5天、7天血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)水平变化，并观察肝脏组织病理改变，对大鼠肝移植免疫耐受和免疫排斥模型进行评估。(2)第二部分：Wistard→Wistard肝移植大鼠分为叁组，氯化钆组(供体大鼠术前24 h经尾静脉注射0.2％氯化钆溶液，10 mg／kg体重)、甘氨酸组(供体大鼠术前1h经尾静脉注射300mmol／L甘氨酸1.5ml)和对照组(供体大鼠术前1 h经尾静脉注射等渗生理盐水1.5ml)。每组分为两小组，8只观察生存率，8只进行实验检查。术后3天、5天和7天受体大鼠剖腹经肝上下腔静脉取血制成血清，取肝右前叶组织1cm~21块，制成电镜标本，术后3天的肝组织一部分进行肝细胞悬液的制备，剩余的肝组织立即固定、石蜡包埋。检测血清总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)、细胞因子TNFα和IL-1，免疫组化法检测肝组织中Kupffer细胞FasL表达、流式细胞术检测移植肝的肝细胞凋亡率，并对相应的标本进行病理学光镜和Kupffer细胞电镜学观察。(3)第叁部分：按上述方法建立Wistard→SD大鼠肝移植动物模型，实验动物分为叁组：氯化钆组、甘氨酸组和对照组，供体预处理同方法(2)。每组肝移植分为两小组，8只观察生存率，8只进行实验检查研究。术后7天进行血浆中TBIL、ALT与AST水平、细胞因子TGF_β和IL-10、肝组织中Kupffer细胞FasL表达、移植肝脏的中淋巴细胞凋亡率，电镜下Kupffer细胞计数，并对相应的标本进行病理学观察。以上叁部分数据以(?)±s表示，以SPSS软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有显着性。结果：(1)第一部分：Wistard→Wistar大鼠原位肝移植组完成38例，36例获得成功，1周存活率为70％；Wistard→SD大鼠肝移植免疫排斥组完成37例，33例手术获得成功，1周存活率为50％。Wistard→Wistar大鼠原位肝移植组术后ALT、AST、和TBIL逐渐下降，病理学检查未发现急性排斥反应，最长生存时间可达33天；而Wistard→SD组术后3-7天ALT、AST及TBIL呈逐渐上升，术后7天可见到明显的免疫排斥，排斥指数为7.06±0.78，最长生存时间12天。(2)第二部分：在免疫耐受研究中，改变供体Kupffer细胞功能后，氯化钆组和甘氨酸组1周生存率87.5％，对照组为75.0％；氯化钆组和甘氨酸的血清AST、ALT和TBIL的水平明显低于对照组；肝移植后氯化钆组IL-1水平低于对照组，而TNFα水平显著高于对照组，甘氨酸组的TNFα和IL-1水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；术后3天免疫组化染色显示，氯化钆组肝组织中Kupffer细胞存在散在的FasL蛋白表达；而甘氨酸组和对照组Kupffer细胞FasL表达均较高；术后3天Kupffer细胞FasL免疫组化染色阳性面积百分率分别为3.21±0.07％、7.03±0.86％和7.24±0.31％。氯化钆组与对照组比较存在显着的差异(P＜0.05)，而甘氨酸组与对照组无显着性差异。术后3天肝细胞凋亡凋亡率分别为：氯化钆组7.57±0.77％，甘氨酸组14.33±1.05％，对照组14.72±2.25％，氯化钆组同对照组相比有显着性差异，甘氨酸组和对照组相比无显着性差异。术后3天叁组的病理学变化，以甘氨酸组炎性浸润最轻，氯化钆组次之，同对照组差异明显，电镜下观察同对照组相比，氯化钆组和甘氨酸组Kupffer细胞分泌功能均受到不同程度的抑制，以氯化钆组受抑制最明显。(3)第叁部分：在急性排斥反应研究中，氯化钆组大鼠生存率明显降低，甘氨酸组生存率最高；经氯化钆处理后血清肝功能指标的水平显着高于对照组，而经甘氨酸处理后肝功能指标的水平显着低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；肝脏移植后7天甘氨酸组大鼠血清TGF_β最高，显著高于对照组，但IL-10的水平同对照组比较无显着性差异；而氯化钆组TGF_β和IL-10水平最低，同对照组比较，有显着性差异(P＜0.05)。免疫组织化学检测(SP法)显示，氯化钆组Kupffer细胞FasL免疫组化染色阳性面积百分率与对照组比较存在显着的差异(P＜0.05)，甘氨酸组和对照组相比无显着性差异。术后7天淋巴细胞凋亡凋亡率分别为：氯化钆组2.83±0.42％；甘氨酸组7.81±1.06％，对照组7.64±1.28％，氯化钆组同对照组相比有显着性差异(P＜0.05)，甘氨酸组和对照组相比无显着性差异。在同样电镜倍数下对每组术后7天的标本进行Kupffer细胞的计数，氯化钆组为4.25±0.43，甘氨酸组为7.92±0.52，对照组为8.01±0.47，氯化钆组与对照组比较存在显着的差异(P＜0.05)，甘氨酸组与对照组比较无显着性差异。根据Banff排斥活动性指数积分，氯化钆组免疫排斥最重，甘氨酸组免疫排斥最轻，同对照组比较均有显着性差异。结论：(1)Wistard→Wistard大鼠原位肝移植组合是一种免疫耐受模型，Wistard→SD大鼠原位肝移植是一种中重度急性排斥模型，可用于肝移植免疫耐受和急性排斥的研究。(2)调节Kupffer细胞功能在免疫耐受和免疫排斥状态下均可影响肝移植肝脏的功能，这种影响是通过TNFα、TGF_β、IL-1和IL-10细胞因子的释放、Fas／FasL表达、细胞凋亡等多种机制实现的；(3)氯化钆调节供体Kupffer细胞功能对移植肝功能影响具有双重作用：一方面通过抑制Kupffer细胞功能降低炎性细胞因子IL-1释放、抑制FAS／FASL表达和肝细胞凋亡等保护移植肝脏功能；但另一方面其抑制Kupffer细胞功能后减少了下调免疫反应性细胞因子TGF_β和IL-10的释放、抑制了活化的T淋巴细胞凋亡，加重了肝移植急性排斥反应，其临床应用价值有限。(4)甘氨酸调节供体Kupffer细胞，一方面抑制了主要炎性细胞因子的释放，发挥对移植肝的保护作用，另一方面促进释放下调免疫性细胞因子TGF_β，抑制T淋巴细胞活化并减轻其细胞毒性作用，减轻了肝移植急性排斥反应，其临床应用价值较大，但需要进一步探索临床应用安全有效的剂量，甘氨酸对Kupffer细胞功能调节影响TGF_β和IL-10释放的机制，也需做深入研究。
刘宁[6]2006年在《TGF-β_1基因修饰树突状细胞对大鼠肝移植免疫排斥反应抑制作用的研究》文中指出背景： 器官移植已逐渐成为治疗各种终末期肾、肝、心、肺疾病的首选治疗方案，非特异性免疫抑制剂(如环孢素A，FK506)的长期使用不仅花费巨大而且常导致严重的副作用，如机会感染、动脉硬化、肝肾损害以及恶性肿瘤的发生等。因此，寻找一种有效的方法，在不使用免疫抑制剂的情况下，使受者机体对于移植物产生特异性的耐受已经成为移植免疫学领域最为关注的问题。移植排斥反应的核心是T细胞介导的连锁免疫应答，主要通过受者T细胞表面的受体(TCR)识别移植物细胞表面的同种异型抗原而引发。在这个过程中，抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)起了至关重要的作用。树突状细胞(dendritic cell，DC)是机体的专职APC，它既可通过提呈抗原和协同刺激分子(costimulatory molecules)激活体内静息T细胞，引起T细胞分化、克隆扩增和发生免疫应答，又能通过T细胞凋亡，T细胞无能和促进T调节细胞的生成等进一步介导外周免疫耐受，大量实验证明，未成熟DC(immature，imDC)低表达MHC(major histocompatibility complex)Ⅰ类和Ⅱ类分子，缺少或低表达协同刺激分子B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和CD40等，因而在提呈特异性抗原的同时，诱导T细胞特异性无能或凋亡，此现象称为否决效应(veto effect)，在移植免疫中显示出其独特的应用价值。但未成熟DC进入受者体内后，在受者体内微环境作用下，很快上调其表面的MHC Ⅱ类分子和B7-2分子的表达，趋向成熟。因而寻求一种新的方法，使DC在输注体内后的一定时间内维持于未成熟状态，从而最大限度地抑制急性排斥反应或诱导供者特异性耐受，已成为亟待解决的课题。已有研究表明，人转化生长因子β_1(TGF-β_1)是一种具有免疫抑制作用的调节因子，也是抑制移植排斥反应的重要细胞因子。基因工程修饰为改造DC提供了可行性方案。目前基因转导诱导移植耐受的研究主要集中于叁个方面：对受者骨髓或胸腺细胞转染供者MHC基因、对移植物细胞转染免疫抑制基因以及对供者来源DC转染免疫抑制性基因。本课题拟以人全长TGF-β_1基因通过腺病毒重组，转染供者骨髓来源的imDC，构建TGF-β_1-DC，提高供体来源TGF-β_1基因过表达的DC在受者体内的微嵌合水平，达到诱导大鼠移植肝脏耐受状态的目的，并进一步探讨相关机制。 目的： 1 建立从大鼠骨髓前体细胞分离、培养imDC的方法
夏宗江[7]2006年在《银杏叶提取物对大鼠肝移植缺血/再灌注损伤凋亡及其调控基因的影响》文中指出第一章 大鼠原位肝移植模型(OLT)的建立 目的：探讨大鼠原位肝脏移植(Orthotopic Liver Transplantation，OLT)模型的建立方法，为临床肝脏移植的相关实验研究提供理想的动物模型。 方法：采用Kamada's二袖套法，并在此基础上加以改良，共施行了150例大鼠原位肝脏移植手术。 结果：在90例定型手术中，供肝热缺血时间0～1min，冷缺血时间90min，无肝期平均为18～22min(19.7±1.6min)。手术成功率91.1％(82／90)。 结论：该动物模型稳定可靠，可为肝脏移植的基础及临床相关研究提供较为理想的研究手段和方法。 第二章 银杏叶提取物对大鼠肝移植缺血／再灌注损伤凋亡及其调控基因的影响
张先兵, 李勋, 熊平, 易传超, 陈曦[8]2019年在《叁七总皂苷对大鼠肝移植排斥反应的影响及相关机制》文中进行了进一步梳理目的探讨叁七总皂苷(PNS)对Kupffer细胞(KCs)功能状态、肝移植术后免疫环境的影响,及其相关机制。方法分离大鼠KCs,吞墨台盼蓝鉴定KCs活性,细胞实验分LPS(-)组、LPS(+)+PNS(0μmol)组、LPS(+)+PNS(10μmol)组,、LPS(+)+PNS(20μmol)组,Western blot、ELISA检测各组细胞及上清液炎症因子和氧化应激产物的表达,免疫荧光检测KCs CD206的表达,Western blot检测NF-κB和Keap1-Nrf2-ARE通路蛋白表达。建立大鼠移植模型,分为SHAM组、LT(PBS处理)组和PNS(200 mg/kg)组,术后检测各组肝功能、炎症因子、肝组织病例、凋亡情况,并观察大鼠生存时间。结果随着PNS浓度的增加,KCs分泌促炎因子和氧化应激产物MDA水平逐渐降低,明显低于PNS(0μmol)组,而抗炎因子IL-10以及抗氧化应激产物SOD水平逐渐升高,明显高于PNS(0μmol)组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光示PNS提高了KCs表型CD206的表达。同时,PNS减少了KCs IRAK4、p-IKKα、p-IκBα、p-p65、Keap1蛋白表达,而Nrf2、ARE蛋白表达水平逐渐升高,且与低PNS浓度组比具有统计学上的差异(P<0.05)。与LT组比,PNS组的大鼠肝移植后肝功能明显改善,促炎因子表达水平降低,肝细胞凋亡减少,肝组织急性排斥病理改变减轻,大鼠生存时间明显增高(P<0.05)。另外,大鼠注射GdCl3封闭KCs功能发现,PNS组出现严重的急性排斥反应,与LT组比较无统计学上差异(P>0.05)。结论 PNS能够通过抑制NF-κB和Keap1-Nrf2-ARE通路减少活化KCs的炎症和氧化应激反应,促进KCs向免疫耐受的M2型极化,提高大鼠移植术后的生存时间。
祝哲诚[9]2003年在《免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中研究表明FK506、MMF、anti-CD28mAb联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究研究背景目前，器官移植已经成为临床治疗终末期疾病的有效和常规措施。然而，尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用，在过去20年间，移植物的长期存活率仍未明显提高。免疫抑制剂的成功应用，有效地抑制了急性排斥反应，但不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。而且，免疫抑制剂的长时间应用，不可避免地产生感染、肿瘤等并发症。因此，意味着移植物可长期存活的免疫耐受的诱导，成为移植学家和免疫学家所追求的目标。在啮齿类动物，已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床，由于在大动物模型中得不到相同的结果，却受到了限制。回顾近年来这一领域的研究成果，多集中在拟通过建立供受体细胞的混合性嵌合状态，来诱导移植物的免疫耐受，尤其是通过新型的、无明显毒副作用的建立混合性嵌合的处理方案。本研究正是基于以上观点，试图建立一种无明显毒副作用、非骨髓抑制的处理方案，通过建立大鼠肝移植模型，采用以FK506、MMF、anti-CD28mAb为主并联合供者骨髓输注的处理措施，来诱导大鼠肝移植免疫耐受。同时，进一步分析其诱导长期存活的可能机制，包括移植物和外周血中细胞因子的表达、细胞凋亡的发生在免疫耐受诱导中的可能作用等。本部分研究的具体内容总结如下：第一部分目的：利用套管技术建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型，模型的建立是本项研究的基础。方法：采用“二袖套法”完成200例次大鼠原位肝移植模型，同时结合自己的体会，对“二袖套法”进行适当改进，包括套管的制作、受体的麻醉、腹主动脉的灌注以及肝上、肝下下腔静脉、门静脉等血管的吻合。结果：肝上下腔静脉的吻合时间为10～15分钟，无肝期为12～18分钟，一周生存率可达75％以上。术后常见的并发症为出血、血栓形成、感染以及胆道梗阻。结论：技术的改进增加了生存率，包括供肝腹主动脉灌注，在供肝的质量上明显优于单纯门静脉灌注。另外，减少供肝的机械性损伤、避免套管的扭曲、提高血管的吻合质量以及缩短无肝期，都是减少术后并发症和提高移植物存活的关键。
管文贤[10]1999年在《1. XJ-1器官保存液的研制及TLSF_（JM）对大鼠肝、心移植急性排斥反应防治作用的实验研究 2. 我国首例血缘关系活体肝移植患者的临床观察》文中认为无论是肝脏移植还是心脏移植，目前都已成为治疗中末期肝病和心脏器质性病变的唯一有效手段，至今临床肝脏或心脏移植全球累计总例数都已逾6万例，并且移植疗效良好。而我国在肝、心移植领域与国外还存在巨大的差异，因此加强这一领域的研究是极其必要的。本研究的选题正是基于这样的出发点，围绕大鼠肝脏和心脏移植的模型进行了有关器官保存和免疫抑制治疗的研究；还对1例临床活体肝移植患者作了长期的随访观察，并就免疫监测与免疫抑制治疗的方法作了初步的探讨。 第一部分 有关大鼠肝脏和心脏移植模型的建立 研究一：“叁袖套”法大鼠原位肝移植模型的建立 目的：在国内现有条件下探讨“叁袖套”法大鼠原位肝移植的可行性。方法：以SD大鼠为对象，通过自制血管袖套、手术牵开器，按Miyata法复制大鼠原位肝移植模型。结果：经60余次预试验后行正式试验18次，术中死亡5例，术后4h内死亡4例，24h存活率50％，1周存活率11.1％。术后早期死亡原因主要为气胸、血管套接失败、出血。结论：现有实验条件下“叁袖套”法原位肝移植模型难以获得稳定的长期生存率，不适合慢性实验研究。
参考文献：
[1]. 阻断Kupffer细胞IRE1-XBP1通路对大鼠肝移植排斥反应的影响[J]. 王润芝, 吴皓, 刘一鸣, 曹丁, 吴涯昆. 第叁军医大学学报. 2016
[2]. Kupffer细胞功能对大鼠肝移植急性排斥反应的影响[D]. 姚辉华. 四川大学. 2004
[3]. 肝再生增强因子防治大鼠肝移植急性排斥反应实验研究[D]. 梁绍勇. 重庆医科大学. 2008
[4]. 核因子-κB圈套协同CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的研究[D]. 彭勇. 重庆医科大学. 2005
[5]. 供体Kupffer细胞功能调节对肝移植后肝脏功能和急性排斥反应影响的研究[D]. 张光永. 山东大学. 2007
[6]. TGF-β_1基因修饰树突状细胞对大鼠肝移植免疫排斥反应抑制作用的研究[D]. 刘宁. 昆明医学院. 2006
[7]. 银杏叶提取物对大鼠肝移植缺血/再灌注损伤凋亡及其调控基因的影响[D]. 夏宗江. 中南大学. 2006
[8]. 叁七总皂苷对大鼠肝移植排斥反应的影响及相关机制[J]. 张先兵, 李勋, 熊平, 易传超, 陈曦. 南方医科大学学报. 2019
[9]. 免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 祝哲诚. 复旦大学. 2003
[10]. 1. XJ-1器官保存液的研制及TLSF_（JM）对大鼠肝、心移植急性排斥反应防治作用的实验研究 2. 我国首例血缘关系活体肝移植患者的临床观察[D]. 管文贤. 第四军医大学. 1999