毛盛芳
江西省南昌市洪都中医院制剂中心江西省南昌市330008
【摘要】目的：建立治伤三黄酊的质量标准。方法：对治伤三黄酊中赤芍的芍药苷、栀子的栀子苷、黄柏和黄连的盐酸小檗碱和大黄的大黄素用薄层色谱法（TLC）进行定性鉴别，对栀子中栀子苷采用高效液相色谱法（HPLC）进行含量测定，结果：TLC法专属性强，斑点清晰；HPLC法测栀子中栀子苷的含量，条件适宜，分离效果好，栀子苷在0.2352～2.352ug范围内呈良好的线性关系，平均回收率为98.60%，RSD值为1.43%。结论：所建立的方法，灵敏、精密、重现性好，可作为治伤三黄酊的质量控制方法。
【关键词】治伤三黄酊；质量标准；探究
【中图分类号】RQ421.3+1【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-05-362-02
治伤三黄酊是由栀子、当归、川芎、生地、赤芍等15味药材组成，它是我院自制的外用制剂。具有凉血散瘀、清热解毒、活血止痛功效。本研究对方中赤芍的芍药苷、栀子的栀子苷、黄柏和黄连的盐酸小檗碱和大黄的大黄素的用薄层色谱法进行定性鉴别，方法操作简单，专属性强，重现性好；还对栀子中栀子苷采用高效液相色谱法进行含量测定，经实验研究，该法灵敏、精密、重现性好，认为可用于本品的质量控制。
1、仪器与试药
1.1仪器Waters高效液相色谱仪（2487检测器，Waters1525高压泵，Empower工作站）。DiamonsilC185u反相色谱柱（4.6×250mm），FA2004电子分析天平，Sartorius电子天平、UV-2101紫外分光光度计、SK250H超声清洗仪。
1.2试药栀子苷对照品（110749-20131611）购自中国药品生物制品检定所。治伤三黄酊（20151016）为自制。甲醇为色谱纯，水为双蒸馏水，其余均为分析纯。
2、方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1赤芍薄层鉴别取本品30ml，水浴上挥至无醇味，加水10ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸至约3ml，加适量中性氧化铝，在水浴上搅匀，挥干，加至已处理好的中性氧化铝柱（100～200目，5g，内径10～15mm）上，用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版）试验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（8：1：4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.2栀子薄层鉴别取本品30ml，水浴上挥至无醇味，加水10ml，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次20ml，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔树脂柱（内径1.5cm，长12cm），依次用水50ml，40％乙醇50ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版）试验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15：40：22：10）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.3黄柏和黄连薄层鉴别取本品作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典201版）试验，吸取供试品溶液2～5μl，对照品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-水-冰醋酸（7：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。
2.1.4大黄薄层鉴别取本品30ml，水浴上蒸至10ml，加水10ml和盐酸4ml，加热回流提取30分钟，立即冷却，用乙醚提取3次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5ml的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010版）试验，吸取供试品溶液10～15μl，对照品溶液3～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。置氨蒸气中熏后在日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。
2.2含量测定
2.2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B；检测波长为238nm；柱温为35℃；进样量20μl。
2.2.2溶液的制备对照品溶液的制备取栀子苷对照品4mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，精密量取5ml，置10ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含栀子苷40μg的溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备精密量取装量项下的本品1ml，加在中性氧化铝（100～200目，5g，内径10～15mm）上，用50%的甲醇洗脱，收集洗脱液至25ml量瓶中，收集至约25ml，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
阴性对照溶液的制备按处方比例和制备方法，除栀子药材外，用其它各味药材制成阴性样品，照上述供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2.3系统适用性试验：分别精密吸取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各20μl，分别进行高效液相色谱实验，并记录色谱图，见图1、图2、图3。结果表明：本色谱条件下，栀子苷主峰与其他组分峰可达基线分离，保留时间适宜；而不含栀子苷的阴性溶液色谱中，在对照品相应位置无色谱峰，说明阴性样品无干扰。
2.2.4线性关系考察精密称定栀子苷对照品2.94mg，置25ml量瓶中，加甲醇至刻度；精密量取1ml、3ml、5ml、7ml、10ml，分别置10ml量瓶中，加50%甲醇置刻度，摇匀，精密吸取上述溶液各20ul，在上述色谱条件下测定峰面积，以对照品的量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，栀子苷在0.2352～2.352ug范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y=661758x＋19889，R为0.9995。
2.2.5稳定性试验取栀子苷对照品溶液（39.2μg/ml），分别于0h，4h，8h，12h，24h进样分析，测定栀子苷峰面积，得到其峰面积的RSD为1.69%，结果表明样品的供试品溶液在24小时内无明显变化，说明栀子苷稳定性好。
2.2.6精密度试验取同一浓度的栀子苷对照品溶液（39.2μg/ml），连续进样5次，测其峰面积，并求得相对偏差RSD为0.7%，说明仪器精密度良好。
2．2.7重复性试验取同一批样品（20151016）精密量取5份按正文方法进行高效液相色谱试验，样品重现性良好，测得该批样品阿魏酸含量分别为0.80，0.81，0.81，0.79，0.80mg/ml，RSD为1.43%。
2.2.8加样回收试验准确称取已知含量（0.8015mg/ml）的本品1ml，共五份，分别加入一定量的对照品溶液，照“2.2.1”项下方法试验，计算回收率，平均回收率为98.60%，符合要求。
2.2.9样品测定分别取七批治伤三黄酊，按“2.2.1”项下方法测定，以标准曲线法计算样品中阿魏酸的含量，结果如下表格：
七批样品测定结果
3、讨论
3.1供试品溶液的制备：比较①加甲醇溶解和②加在中性氧化铝（100～200目，5g，内径10～15mm）上，用50%的甲醇洗脱后再加50%甲醇溶解二种制备方法，结果方法①样品杂峰较多，方法②样品经过柱后杂峰明显减少，而两种方法含量结果差别不大，因此选用方法②作为供试品溶液的制备方法。
3.2流动相的选择：试验比较了流动相①甲醇-水（25：75）②乙腈-0.1%磷酸溶液（13：87）③甲醇-0.1%磷酸溶液（27：73）④甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱法。结果以流动相④条件下，栀子苷的峰和其他的峰分离效果好，保留时间适宜，峰形较好。因此选择甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱法为本方法流动相。
3.3检测波长的选择：取栀子苷对照品溶液，用UV-2101PC紫外分光光度计，在200～400nm波长处进行光谱扫描，测得栀子苷最大吸收波长为238nm。参照栀子苷测定方法，本试验选择检测波长为238m.
4、结论
4.1对处方中赤芍的芍药苷、栀子的栀子苷、黄柏和黄连的盐酸小檗碱和大黄的大黄素的用薄层色谱法进行定性鉴别，方法操作简单，专属性强，重现性好，可有效控制本品的质量。
4.2对处方中栀子的栀子苷采用高效液相色谱法进行含量测定，经实验研究，该法灵敏、精密、重现性好，可作为本品的质量标准。
4.3栀子苷含量：根据“2.2.9”项下测定结果及考虑到栀子药材产地的差异和生产中各种因素的影响，我们规定本品每毫升含栀子以栀子苷计，不得低于0.50mg。
参考文献：
[1]中华人民共和国药典（一部、二部），中国医药科技出版社，2010
[2]中华人民共和国卫生部药典委员会编《中华人民共和国药典中药薄层色谱彩图集》，广东科技出版社
[3]吕武清等编《中成药中的药材薄层色谱鉴别》人民卫生出版社，1997
[4]徐礼等编《中草药有效成分分析法》（上下册）人民卫生出版社，1984
[5]江苏新医学院编《中药大辞典》上海科学出版社，1985
[6]国家药品监督管理局编国家中成药标准汇编
[7]高万山等编《中药材理化鉴别手册》南京大学出版社，1993
作者简介：
毛盛芳，女，1964、4出生，本科，副主任中药师，就职于江西省南昌市洪都中医院制剂中心。