邢继红[1]2003年在《玉米大斑病菌菌丝蛋白单克隆抗体制备》文中认为玉米大斑病菌HT-毒素是引起玉米大斑病的重要毒性因子。前期研究表明，玉米大斑病菌致病的可能机制是HT-毒素与玉米细胞膜上的受体相结合，通过影响细胞膜透性和活性氧的产生引起病害。HT-毒素为低分子量的小分子化合物，利用免疫学技术研究它在寄主玉米细胞膜上的作用位点以及可能的受体蛋白非常困难。本文利用单克隆抗体技术获得了与HT-毒素产生有关的1号小种菌株蛋白的单克隆抗体，从而为研究HT-毒素的产生机制和致病机理奠定基础。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析0号小种菌株和1号小种菌株的菌丝蛋白发现，在1号小种中存在一条特异性的蛋白质条带。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定该蛋白质的分子量为25kD。以1号小种99-2菌株产生的25kD蛋白(浓度为173.8μg／mL)为抗原皮下注射分3次免疫6～8周BALB／C小鼠，获得了效价大于1／1600的抗血清。取小鼠的脾脏进行单克隆抗体制备，用间接酶联免疫技术(ELISA)筛选得到12株效价较高的单抗，即Mb1～12。交叉反应试验发现，Mb4与0号小种菌株和除99-2菌株以外的其他1号小种菌株的菌丝蛋白均不发生阳性反应，特异性最强；Mb1、Mb2、Mb3、Mb5、Mb6、Mb10、Nb11只能与1号小种菌株的菌丝蛋白发生阳性反应；Mb7、Mb8、Mb9、Mb12与0号小种和1号小种的菌丝蛋白均可以发生交叉反应。另外，研究还发现，Mb2、Mb3、Mb8和Mb9能与1号小种99-2菌株产生的HT-毒素发生特异性阳性反应。 试验结果表明，0号小种与1号小种不但在HT-毒素组成上有差异，在菌丝蛋白组成上也存在显着区别。从1号小种中分离的特异性菌丝蛋白可能与1号小种HT-毒素中特异性毒素组分HT-Ⅳ产生有关。
邢继红, 董金皋[2]2006年在《玉米大斑病菌菌丝蛋白单克隆抗体制备》文中认为人们在研究玉米大斑病菌与寄主互作的模式时,推测病菌可能的致病机制是大斑病菌产生的HT毒-素先与玉米细胞膜受体蛋白(结合蛋白)结合,进而引发寄主的生理生化过程并导致表型的病变。基于HT毒-素为低分子量小分子化合物,具体的化学结构尚不清楚,因此研究HT毒-素
邢继红[3]2006年在《拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析》文中研究说明灰霉病是一种世界性的重要病害,病原为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),其寄主范围广,常造成严重的经济损失。本论文在研究拟南芥不同生态型对不同病原菌抗性反应的基础上,探讨了拟南芥抗灰葡萄孢侵染的表型特征、细胞学证据和生化机制,对拟南芥抗灰葡萄孢基因进行了连锁分析和定位,应用抑制性消减杂交(SSH)和mRNA差异显示—PCR(DDRT-PCR)技术获得了大量拟南芥抗灰葡萄孢的相关基因片段,克隆了2个拟南芥抗灰葡萄孢相关基因,同时通过原核基因的表达初步验证其中1个抗病相关基因对灰葡萄孢的生长有一定的抑制作用。为更好地利用模式植物拟南芥的遗传资源和信息,促进植物抗病基因的克隆和相关作物的遗传改良奠定了良好的基础。 1.通过对拟南芥11个生态型对不同植物病原菌的抗病性反应测定,筛选出了具有抗/感差异表现的拟南芥—病原菌组合。供试40个菌株中,有19个菌株对拟南芥的11个生态型都表现抗/感差异,其中10株为灰葡萄孢菌株。试验选择灰葡萄孢菌株BC18为供试菌株,确定对其表现抗病的Col-0、Ws-0生态型和对其表现感病的Ler生态型为供试拟南芥。Col-0、Ws-0生态型接种灰葡萄孢菌株BC18后表现的抗病症状不同。Col-0生态型接种后表现免疫,Ws-0生态型接种后则出现过敏性坏死斑点。 2.试验对3个拟南芥生态型的细胞组织形态进行显微观察,比较在3个拟南芥生态型的叶片上,病菌的萌发、侵入及扩展的情况,获得了拟南芥Col-0和Ws-0生态型抗灰葡萄孢以及Ler生态型感灰葡萄孢的细胞学证据。同时,试验通过比较拟南芥抗病生态型Ws-0和感病生态型Ler接种灰葡萄孢后寄主防御酶系活性和非酶类物质丙二醛的含量变化,探讨了防御酶系和非酶类物质与拟南芥抗灰葡萄孢侵染的关系。确定了POD、CAT、PPO和PAL活性及MDA含量与拟南芥对灰葡萄孢的抗性密切相关:SOD活性与拟南芥对灰葡萄孢的抗性关系不密切。 3.本研究将抗灰葡萄孢拟南芥生态型Col-0与感病生态型Ler进行杂交,分析F_1和F_2代对灰葡萄孢的抗病表现,确定了拟南芥对灰葡萄孢的抗性受2个基因控制。应用图位克隆技术,确定了与2个抗病基因连锁的分子标记,将抗灰葡萄孢基因(暂命名为BC1和BC2)分别定位于拟南芥第4染色体和第5染色体上。BC1位于CCR1和DHS1之间,分别与CCR1和DHS1相距1.2cM和1.6cM;BC2位于CA72/NGA151和NGA106之间,分别与CA72/NGA151和NGA106相距1.4cM和2.4cM。 4.利用抑制性消减杂交(SSH)技术,获得拟南芥不同生态型接种灰葡萄孢后基因表达的差异cDNA片段。同源性分析表明,接种灰葡萄孢后,诱导了一些与转录、膜内外物质转移、蛋白合成、信号转导等有关的基因表达,并有可能启动多种调控机制,尤其是转录过程中的调控。片段AM-2含有GAF保守区域,与组氨酸激酶传感器有较高的同源性,与拟南芥的乙烯信号转导有关,因此初步判断AM-2序列可能与
赵辉[4]2009年在《玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）生理分化和遗传多态性研究》文中研究说明本论文从寄主-病原菌互作角度,采用性状培养、Ht单基因鉴别寄主鉴定技术、同工酶电泳技术、扩增片段长度多态性分析技术(AFLP)和血清学技术,系统研究了我国玉米大斑病菌(Exerohilum turcicum)生理分化和遗传多态性。本研究从我国玉米大斑病菌生理小种组成和种群变化等方面,全面分析了近年来我国玉米大斑病危害加重的原因。采用两套Ht单基因(Ht1、Ht2、Ht3和HtN)鉴别寄主,对2005年和2006年采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、陕西、山西、河南、四川和北京-天津-唐山地区共10个省区28个地区的204株玉米大斑病菌菌株进行了生理小种鉴定,共鉴定出0、1、2、3、12、13、23、123和23N等9个生理小种,其中0号和1号生理小种为优势小种,分别占供试菌株的62.25%和19.12%。毒力频率分析结果表明,玉米大斑病菌小种组成对Ht1抗性基因的毒力频率最高,为33.33%;对HtN抗性基因的毒力频率最低,为1.47%。Ht1和Ht2抗性基因在我国玉米产区均有不同程度的抗性“丧失”。玉米大斑病菌不断有新小种出现,生理分化明显。生理小种组成较复杂的省份为东北叁省、河北和四川等地区。本研究从病原物的环境适应性、同工酶和DNA多态性等方面,系统探讨了导致病原菌生理小种变异的生理和分子生物学机制。利用继代培养、连续接种和rDNA ITS序列比较,探明了在稳定的寄主选择压力条件下,玉米大斑病菌生物学特征、致病性和rDNA-ITS序列是相对稳定的,rDNA-ITS序列同源性达96.9%～100%。在培养性状方面,玉米大斑病菌不同生理小种间菌落形态、菌丝生长速度、产孢量、孢子萌发和菌落产色素能力均存在明显的多态性。在同工酶方面,玉米大斑病菌不同生理小种在6种同工酶水平上均表现出不同程度的多态性,其中酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)的多态性尤为明显。这种同工酶水平上的多态性,反映了病原菌遗传表达的多态性。在DNA遗传多态性方面,采用扩增片断长度多态性分析技术(AFLP)分析了玉米大斑病菌的遗传变异,供试菌株间遗传相似系数在0.6～1.0之间,表现出明显的遗传多态性。聚类结果表明,该病菌的遗传多态性与其生理分化存在明显相关性。但不同地域的同一生理小种的菌株相似系数达到了1.00,说明其生理分化与地域无关。在玉米大斑病菌生理小种辅助鉴定方法的研究方面,本研究首次利用AFLP特异条带序列设计,筛选出玉米大斑病菌生理小种的特异引物,引物组合可以为0、13号等生理小种鉴定提供准确的分子生物学辅助鉴定。在病原菌遗传多态性的基础上,首次利用免疫学方法制备了玉米大斑病菌1、2、12、13号生理小种的抗血清,在提高抗血清稀释度的情况下,经效价、交叉反应、ELISA和Western blot试验,发现1、12号生理小种菌株的抗血清表现出小种特异性。本研究完成了辽宁省主栽玉米品种对玉米大斑病菌生理小种的抗性鉴定。各品种对不同生理小种的抗病性存在明显差异,其中高抗品种占17.86%,中抗至抗的品种占53.57%。抗病性鉴定结果与品种系谱相关性分析表明,品种对不同生理小种的抗性与品种血缘关系相关。另外,气候条件对抗病性鉴定结果亦有影响。综合上述研究结果:玉米大斑病菌存在明显的生理分化。新小种的出现及其种群数量的上升和某些垂直抗病品种抗性的“丧失”是玉米大斑病逐年加重的重要原因。寄主更换的选择压力变化和病原菌种群内的遗传多态性是玉米大斑病菌发生变异的重要原因。AFLP和免疫学技术可以作为玉米大斑病菌生理小种的辅助鉴定技术。辽宁省主栽品种对玉米大斑病菌主要优势小种表现出较好的抗性。
王兰英[5]2018年在《天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导》文中进行了进一步梳理天名精内酯酮属于倍半萜内酯类化合物,广泛分布于天名精属的多种植物中。西北农林科技大学无公害农药中心首次报道了该化合物的农用活性,并通过系统测试表明该化合物具备开发为新型杀菌剂的潜质,但该化合物的作用机理尚不明确。亚细胞定位对于揭示杀菌剂的作用机理具有重要的指导作用。本研究以小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var.tritici(Ggt)为供试靶标菌,采用荧光示踪技术、免疫荧光技术以及免疫胶体金技术研究天名精内酯酮的靶向细胞器,并在此基础之上,测定其对靶标菌氧化胁迫与细胞凋亡的诱导,以期初步明确天名精内酯酮的作用机理。主要研究结果如下:1、设计合成天名精内酯酮荧光标记物TTY,以线粒体探针MitoTrackerR Green FM和细胞核探针RedDot?为共定位探针,研究TTY在小麦全蚀病菌内的亚细胞分布。结果表明,TTY在菌丝内的分布区域与MitoTrackerR Green FM探针很好的重迭,其皮尔森共定位系数为0.83。因此,推测天名精内酯酮作用的细胞器是线粒体。2、制备天名精内酯酮多克隆抗体TPAbs-4,以线粒体探针MitoTrackerR Red CMXRos作为共定位探针,采用免疫荧光法研究天名精内酯酮在靶标菌内的亚细胞定位。结果表明,荧光二抗Anti-Mouse IgG(whole molecule)-FITC在菌丝细胞内的分布和线粒体探针(MitoTrackerR Red CMXRos)能够很好的重迭,其皮尔森共定位系数为0.86。由此推断,天名精内酯酮分布于线粒体。3、制备天名精内酯酮单克隆抗体F2B4,该抗体对天名精内酯酮敏感性强,其IC_(50)为2.05 ng/mL,且特异性好,与天名精内酯醇交叉反应率仅为1.8%,与γ-苯基-α-亚甲基-γ-丁内酯无明显交叉反应。随后,采用免疫胶体金法观察天名精内酯酮在靶标菌内亚细胞定位,结果表明:(1)经天名精内酯酮孵育30 min,细胞膜上有大量的胶体金颗粒排列;1 h后,胶体金颗粒向细胞质和线粒体迁移,细胞膜、细胞质及线粒体均有分布;2 h后,胶体金颗粒主要分布在线粒体上,其它细胞器未见分布。(2)经天名精内酯酮孵育2 h,线粒体的脊清晰可见,而孵育6 h、12 h线粒体的脊逐渐变得模糊,孵育48 h线粒体脊消失且出现空泡化。这些结果再次证明了天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体。4、检测天名精内酯酮对靶标菌氧化胁迫的诱导,结果表明:(1)经天名精内酯酮孵育3 h,菌丝内出现活性氧迸发,且6 h后线粒体膜电位明显降低。(2)天名精内酯酮能够抑制线粒体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽还原酶(GR)的活性,同时促进谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,从而使谷胱甘肽(GSH)含量显着降低,导致ROS消除通路受阻,ROS蓄积,造成氧化胁迫。(3)抗氧化系统中,GR对天名精内酯酮最敏感,其IC_(50)值低于3.125μg/mL,由于天名精内酯酮能够与其活性中心起催化作用的半胱氨酸残基反应,推测该酶可是天名精内酯酮的潜在靶标作用靶标之一。5、检测天名精内酯酮对靶标菌细胞凋亡的诱导,结果表明,经天名精内酯酮孵育2h,可检测到磷脂酰丝氨酸(PS)外翻;孵育6 h DNA明显受损,TUNEL检测结果为阳性,DNA电泳条带200 bp处出现明显弥散状,且弥散区域随着时间延长变大。同时,相关基因Ggmet1和Ggmet2的表达量显着上调。以上结果证明天名精内酯酮可诱导小麦全蚀病菌的细胞凋亡。综上所述,天名精内酯酮作用细胞器为线粒体,该化合物可以诱导靶标菌产生氧化应激与细胞凋亡。结合前期研究结果推测其作用机理为:天名精内酯酮进入靶标菌后在线粒体内逐渐富集,影响线粒体复合酶III的活性,阻断线粒体呼吸链电子传递,影响能量生成;同时对GR等抗氧化酶的抑制作用导致ROS蓄积,使线粒体膜通透性增加,激活线粒体介导的细胞凋亡通路,最终使得菌体死亡。
李潮霞[6]2007年在《小麦赤霉病菌血清学检测方法建立及在品种抗病性评价中的应用》文中研究表明小麦赤霉病(wheat scab disease)是小麦生产上的重要病害。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起我国小麦赤霉病的主要病原菌。赤霉病菌侵染穗部，不仅引起穗枯直接造成小麦减产，而且可侵染籽粒并产生毒素影响小麦和面粉质量，严重时造成人蓄中毒。本研究制备了赤霉病菌多克隆抗体、建立了酶联免疫吸附定性和定量检测方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，并应用于分析测定小麦品种对赤霉病抗病性的研究。主要研究结果包括以下3个方面：1赤霉病菌免疫原蛋白的制备测定了小麦赤霉病菌---禾谷镰刀菌BDX4-5的生长曲线，在菌丝最大生长量期间收集菌丝体，采用液氮研磨法提取菌体孢内蛋白质，经离心、浓缩和纯化将蛋白浓度定溶到1mg/mL。蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝G-250方法，以牛血清蛋白制作标准曲线。以3株小麦赤霉菌(BDX4-5，BDX3-2，HwH4-5)的混合蛋白质作为免疫原制备多克隆抗体。2赤霉菌多克隆抗体的制备用上述免疫原蛋白分别免疫3只兔子，分别免疫了5次。对来源于3只兔子的抗血清进行ELISA测定，取反应性最好(OD值最高)的抗血清经饱和硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析纯化，获得高纯度的多克隆抗体。间接ELISA法测得抗体的最高效价为1:64，000，对赤霉病菌蛋白的最低检测浓度为5ng/mL；与供试的6种镰刀菌(Fusarium spp.)有较高特异性反应，而与供试的非镰刀菌属真菌不发生交叉反应。3不同小麦品种样品中赤霉菌的ELISA检测用上述建立的间接ELISA法对田间人工接种赤霉菌的10个小麦品种样品进行检测。在供试的10个小麦品种中，扬麦10号的肉眼检查有穗枯症状(病穗率为17.3％)，而间接ELISA的检测结果显示为阴性(没有镰刀菌侵染)。其余9个小麦品种的目测调查结果与ELISA测定的蛋白质含量呈显着正相关，相关系数r=0.74，P=0.01。为进一步验证实验结果，对纯化后的抗体进行了生物素标记，用双抗夹心法对实验样品进行了检测，其检测结果与田间调查结果和间接ELISA检测结果相符合。结果表明，本研究制备的多克隆抗体可用于小麦赤霉菌的检测，建立的ELISA检测法为小麦赤霉病的早期和准确诊断提供了依据。
张亮[7]2010年在《棉花黄萎菌DAS-ELISA检测方法的建立与应用》文中认为棉花黄萎病是一种严重的世界性病害,至今已遍布世界30多个国家和地区,成为影响棉花产量与质量的主要障碍。本研究利用多克隆抗体富集能力强、生物素-亲和素高亲和性及高特异性的特点,通过以棉花黄萎菌的菌丝蛋白作为抗原免疫家兔,制备了棉花黄萎菌多克隆抗体,并对该抗体进行了特异性、灵敏度等性质的检测,以此建立了灵敏度高、特异性强的棉花黄萎病菌DAS-ELISA检测技术体系,该检测技术体系灵敏度可达到0.18 ng/mL棉花黄萎菌菌丝蛋白。应用该检测技术体系,对棉花黄萎菌侵染棉花时间、在棉花体内扩散、不同罹病病株中分布规律、品种抗病机制及种子带菌与其抗病性关系开展了研究。结果如下:1、明确病原菌侵染棉苗方式及在棉花体内扩散规律:温室测定试验采用人工切根蘸孢子的接种方法,每隔24h取样,将植株根部切下作为第一部分,其后每3cm为一段样本提取黄萎菌菌体蛋白进行检测,前8d取样根部检测结果可以看出,根部带菌量随时间的延长而增长,并且在第6d到第8d时呈现指数性增长,对于第8d整株检测结果显示,植株中病原菌菌量随取样部位上升病原菌含量呈现增加的趋势,说明棉花黄萎菌随病级升高向植株上部扩展。2、明确田间罹病病株中病原菌分布情况:在0级健株和其他不同发病程度的棉花根部均可检测到棉花黄萎菌的存在,且0级健株根部棉花黄萎菌的浓度较高,1到4级病株根部的黄萎菌量呈下降趋势;地上部分除0级病株中病原菌菌量很少外,其他级别病株病原菌量均显着增高,并呈现随病级升高向植株上部扩张的趋势,4级病株表现为上部菌量最高。3、以海岛棉7124、鄂荆一号及以海岛棉7124为砧木接种植株为研究对象,明确了不同棉花品种对棉花黄萎病抗性的部份机制。通过对普通棉苗的检测。结果显示,海岛棉7124以及鄂荆1号对于棉花黄萎病菌并没有抵抗黄萎菌侵入的能力,但是海岛棉7124具备阻止棉花黄萎菌向上传导的能力,而鄂荆1号则不具备此能力。以此推断棉花植株对于棉花黄萎病的抗性主要是对棉花黄萎菌在棉株体内的扩展起到抗性作用。4、通过对不同品种棉花种子的检测,明确了棉花种子带菌量与品种抗病性呈负相关,与理论上及其他方法研究结果一致。本研究说明,该检测技术体系在棉花黄萎菌检测上是可行的,具有重要的应用前景。
闫海霞[8]2010年在《小麦赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遗传转化研究》文中研究指明赤霉病(Fusarium head blight, FHB)是由镰刀菌引起的谷类作物病害之一,其产生的单族毒素对人、畜毒性大,可引起多种中毒症状。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearium Schwabe) Tri101基因编码的单端孢酶烯3-O-乙酰转移酶通过加乙酰基的形式使单族毒素降解为低毒物质。本文研究了禾谷镰刀菌的DON毒素及其降解基因Tri101的克隆、表达和在小麦中的遗传转化,为作物脱毒和有效防治赤霉病奠定理论基础,为经济、安全和高效净化食物和饲料中真菌毒素提供科学依据。主要包括:1.野生型禾谷镰刀菌0623(F. graminearum 0623,简称Fg0623)在PDA平板上28℃分别培养3d、5d、7d,气生菌丝生长旺盛,中心菌丝在培养第7d开始老化;菌落基质由白色变为红色,部分基质呈深红色;在绿豆汤培养基中25℃、180rpm振动培养3d时,其镰刀状孢子清晰可见。在小麦培养基上25℃分别培养10d、20d、30d、40d、50d,高效液相色谱法测定DON的含量,结果显示DON产量与培养时间呈近似抛物线型关系,在30d时最高,30d后迅速下降。2.利用RT-PCR克隆Fg0623的Tri101基因cDNA片段并测序,Tri101基因核苷酸序列阅读框架全长1 356bp(GenBank序列号:GQ907236),编码451个氨基酸的多肽,推测分子量为49.45 kDa,等电点为5.14。氨基酸序列同源性比对结果表明,它与Kimura报道的禾谷镰刀菌Tri101氨基酸序列同源性最高,为99.56%,与其它13种镰刀菌的Tri101氨基酸序列同源性分别为97.91%~75.68%。系统进化树分析结果表明,Fg0623与F. sporotrichioides属于同一进化枝且与F. asiaticum有较近的亲缘关系,而与F. oxysporum、F. moniliforme、F. nygamai、F. nisikadoi和F. decemcellulare的亲缘关系较远。3.构建的原核表达载体pGEX-4T2/Tri101转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,Tri101基因在BL21中高效表达,融合蛋白GST-Tri101分子量为75.45 kDa。将该融合蛋白切胶纯化制备兔抗GST-Tri101多克隆抗体,经ELISA法测定抗体效价为1: 256 000,Western blot分析表明制备的抗体与原核细胞体外表达的Tri101蛋白可以特异性结合。应用该抗体验证了感赤霉病小麦中Tri101基因的表达。4.采用农杆菌介导的小麦生长点转化法将pCAMBIA1301-Tri101-EHA105转入小麦品种豫麦18、郑麦366和郑麦9962中。100mg/L潮霉素筛选后的转化植株用PCR进一步验证,获得T0代小麦植株分别为32、15和29株,GUS染色结果显示有蓝色位点,证明Tri101基因已经整合进小麦基因组中并成功表达。
参考文献：
[1]. 玉米大斑病菌菌丝蛋白单克隆抗体制备[D]. 邢继红. 河北农业大学. 2003
[2]. 玉米大斑病菌菌丝蛋白单克隆抗体制备[J]. 邢继红, 董金皋. 植物病理学报. 2006
[3]. 拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D]. 邢继红. 河北农业大学. 2006
[4]. 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）生理分化和遗传多态性研究[D]. 赵辉. 沈阳农业大学. 2009
[5]. 天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导[D]. 王兰英. 西北农林科技大学. 2018
[6]. 小麦赤霉病菌血清学检测方法建立及在品种抗病性评价中的应用[D]. 李潮霞. 河北农业大学. 2007
[7]. 棉花黄萎菌DAS-ELISA检测方法的建立与应用[D]. 张亮. 河北农业大学. 2010
[8]. 小麦赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遗传转化研究[D]. 闫海霞. 内蒙古农业大学. 2010
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