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不同胁迫条件下沙冬青叶片膜脂组成和叶绿体FAD基因功能分析

2020-12-02阅读(483)

不同胁迫条件下沙冬青叶片膜脂组成和叶绿体FAD基因功能分析

论文摘要

膜脂是构成细胞膜系统的基本骨架,其组成及不饱和度与植物抵抗温度胁迫等逆境密切相关。沙冬青是中亚荒漠区唯一的常绿阔叶植物,具有极强的抗寒抗旱特性。本论文围绕沙冬青叶片膜脂组成及不饱和度与抗逆性的关系开展了三方面工作:（1）分析了在室内不同胁迫处理下和野外复合逆境中叶片脂肪酸不饱和度以及叶绿体膜脂相对含量与不饱和度的变化；（2）分析了叶绿体脂肪酸去饱和关键酶基因在不同胁迫条件下的表达变化；（3）克隆了叶绿体co-3脂肪酸去饱和酶基因AmFAD7和AmFAD8在抗逆性中的功能。主要结果如下:（1）在沙冬青叶片中共检测到11种脂肪酸,其中包括亚油酸（18:2）和亚麻酸（18:3）,但无十六碳二烯酸（16:2）和十六碳三烯酸（16:3）,因此该物种属于18:3植物。（2）在室内培养的沙冬青幼苗叶片中,脂肪酸不饱和度在低温和干旱处理下增加,而在热和盐胁迫处理下降低。在野外自然生长的沙冬青成株叶片中,脂肪酸不饱和度在夏季较低,在秋季和冬季较高。（3）在低温处理下,室内培养的沙冬青幼苗叶片中叶绿体膜脂组分单半乳糖甘油二酯（Monogalactosyldiacylglycerol,MGDG）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol,PG）和硫代异鼠李糖甘油二酯（Sulfoquinovosyldiacylglycerol,SQDG）含量降低,而双半乳糖甘油二酯（Digalctosyldiaculglycerol,DGDG）含量增加，同时这四种脂类的脂肪酸不饱和度均增加。在热胁迫处理下,MGDG和DGDG含量降低,PG和SQDG含量增加,而四种脂类的脂肪酸不饱和度均降低。在干旱处理下,MGDG含量降低,而其余三种脂类含量均增加；DGDG中脂肪酸不饱和度增加,而其余三种脂类的不饱和度均降低。在盐胁迫处理下，MGDG和PG含量降低,DGDG和SQDG含量增加,四种脂类的脂肪酸不饱和度也均增加。有趣的是,在四种胁迫处理下MGDG的含量均降低,而DGDG与MGDG的比值均增加。在野外生长的成株叶片中,在春季和初夏MGDG含量较高,DGDG含量较低,而在其他季节这两种组分的含量正好相反。此外,在春季PG的脂肪酸不饱和度较高；在夏季MGDG和DGDG的不饱和度较低；在秋季MGDG和SQDG的不饱和度较高;在冬季四种脂类的不饱和度均较高。与室内培养的幼苗相比,野外生长的成株叶片中DGDG含量以及DGDG与MGDG的比值均较高。此外,其MGDG的不饱和度较低,而其余三种脂类不饱和度较高。（4）在沙冬青幼苗叶片中,持续两周的低温处理使AmFAD7和AmFAD8的转录水平高于对照,而AmFAD6低于对照；持续两周的热处理引起AmFAD6和AmFAD8的转录水平先上调后下调,而AmFAD7的转录水平始终低于对照；同样时长的干旱处理可诱导AmFAD6和AmFAD8，尤其是后者转录水平上调,而AmFAD7则下调；盐胁迫处理一周后可引起这三个基因的转录水平均上调。在野外生长的沙冬青嫩叶中,AmFAD6的转录水平在冬季略低于其他季节;AmFAD7的转录水平在秋、冬季总体上高于春、夏季；AmFAD8的转录水平在全年无明显的规律性变化。（5）AmFAD7和AmFAD8的编码蛋白分别由455和457个氨基酸残基组成,其中均含有1个叶绿体转运肽和3个保守的组氨酸簇。二者的gDNA编码区分别由2247 bp和2132 bp组成,其中均含有7个内含子和8个外显子。（6）在AmFAD7和AmFAD8的启动子中均包含光照和激素作用元件,在AmFAD8的启动子中还有低温和脱水应答元件。（7）在0～48 h胁迫处理期间,AmFAD7在幼苗地上部的表达量受低温和高温诱导而上调,但被盐胁迫抑制而下调;在幼苗根中,该基因则受低温和盐胁迫的诱导,而被热胁迫抑制。AmFAD8在幼苗地上部中受低温和盐胁迫诱导,而被热胁迫抑制；在幼苗根中,该基因受盐胁迫诱导而上调,被低温和热胁迫抑制而下调。（8）在野外生长植株中,AmFAD7和AmFAD8均在嫩叶中表达量最高,而分别在嫩枝和侧根中表达量最低。（9）AmFAD7和均可以提高其转基因拟南芥的抗冻性和耐旱性（AmFAD8耐旱作用更明显）,但却降低了其耐热性。此外,转基因株系在低温和干旱胁迫下细胞膜的稳定性和抗氧化胁迫能力均明显提高。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 1 引言
  •   1.1 高等植物细胞生物膜的组成
  •     1.1.1 高等植物叶绿体膜脂的组成
  •     1.1.2 甘油脂的合成
  •     1.1.3 脂肪酸去饱和酶
  •   1.2 生物膜与植物的抗逆性
  •     1.2.1 生物膜与植物的低温抗性
  •     1.2.2 生物膜与植物的高温抗性
  •     1.2.3 生物膜与植物的干旱抗性
  •     1.2.4 生物膜与植物的耐盐性
  •   1.3 脂肪酸去饱和酶与植物抗逆性
  •   1.4 强抗逆植物沙冬青
  •   1.5 本研究的目的和意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 实验试剂、酶及其他材料
  •     2.1.3 缓冲液及试剂配制
  •     2.1.4 引物序列
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 植物培养
  •     2.2.2 沙冬青幼苗胁迫处理
  •     2.2.3 膜脂的提取、分离及脂肪酸组分分析
  •     2.2.4 总RNA的提取与纯化
  •     2.2.5 cDNA的合成
  •     2.2.6 RT-qPCR
  •     2.2.7 基因组DNA的提取
  •     2.2.8 基因克隆与测序
  •     2.2.9 PCR产物的回收
  •     2.2.10 大肠杆菌转化
  •     2.2.11 菌落PCR鉴定及测序
  •     2.2.12 蛋白序列分析
  •     2.2.13 植物表达载体构建
  •     2.2.14 农杆菌的转化与PCR检测
  •     2.2.15 拟南芥的转化
  •     2.2.16 转基因植株的筛选、繁殖与PCR检测
  •     2.2.17 转基因拟南芥抗逆性表型鉴定
  •     2.2.18 电导率测定
  •     2.2.19 MDA和H202含量及POD和CAT活性测定
  •     2.2.20 离体叶片失水率测定
  •     2.2.21 数据统计分析
  • 3 结果与分析
  •   3.1 不同逆境胁迫下沙冬青叶片膜脂组分及其不饱和度的变化
  •     3.1.1 沙冬青叶片脂肪酸种类的鉴定
  •     3.1.2 室内不同胁迫处理下沙冬青幼苗叶片中脂肪酸和叶绿体膜脂的变化
  •     3.1.3 野外复合逆境下沙冬青成株叶片中脂肪酸和叶绿体膜脂的变化
  •   3.2 不同胁迫条件下沙冬青叶绿体FAD基因的表达分析
  •     3.2.1 用于RT-qPCR引物质量的评估
  •     3.2.2 室内不同胁迫处理下沙冬青叶绿体FAD基因的表达分析
  •     3.2.3 野外复合逆境下沙冬青叶绿体FAD基因的表达分析
  •   3.3 沙冬青AmFAD7和AmFAD8基因的克隆与功能研究
  •     3.3.1 AmFAD7和AmFAD8基因及其编码蛋白的基本特征
  •     3.3.2 AmFAD7和AmFAD8基因的表达分析
  •     3.3.3 AmFAD7和AmFAD8转基因拟南芥的获得与分子检测
  •     3.3.4 AmFAD7和AmFAD8转基因拟南芥抗逆性鉴定
  • 4 讨论
  •   4.1 沙冬青属于18:3植物
  •   4.2 叶绿体膜脂中DGDG与MGDG的比值可能与沙冬青抗逆性关系密切
  •   4.3 叶绿体膜脂不饱和度可能与沙冬青抗逆性关系密切
  •   4.4 AmFAD7和AmFAD8基因可能在沙冬青响应和抵抗逆境胁迫中起重要作用
  • 5 结论
  • 6 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 薛敏

    导师: 王茅雁

    关键词: 沙冬青,非生物胁迫,膜脂,基因,表达分析,功能研究

    来源: 内蒙古农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 内蒙古农业大学

    分类号: Q945.78

    总页数: 112

    文件大小: 7883K

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