一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

论文摘要

目的:尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于q PCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法:根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果:序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1. 51mg/L,比活力2 295. 08U/mg。Sm UDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论:成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.2方法

1.1.1 大菱鲆形态学鉴定

1.1.2 大菱鲆肝脏组织预处理

1.1.3 UDGase的酶活定义和酶活检测方法

1.1.4大菱鲆尿嘧啶DNA糖苷酶SmUDGase基因的克隆

1.1.5 SmUDGase基因重组表达与纯化

1.1.6 SmUDGase的温度敏感性检测

1.1.7 SmUDGase的热失活检测

1.1.8 SmUDGase的pH、金属离子及抑制剂适应性检测

2 结果

2.1 大菱鲆肝脏匀浆的尿嘧啶DNA糖苷酶粗酶活检测

2.2 大菱鲆尿嘧啶DNA糖苷酶Sm UDGase的基因克隆

2.3 Sm UDGase的重组表达与纯化

2.4 Sm UDGase的酶活力及热敏性检测

2.5 Sm UDGase的反应条件适应性检测

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 韩挺翰,龚雪梅,郦娟,丁亚芳,卢辰,张坤晓,高嵩,许恒皓

关键词: 尿嘧啶糖苷酶,大菱鲆,热敏性,重组表达

来源: 中国生物工程杂志 2019年10期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 淮海工学院江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室江苏省海洋生物产业技术协同创新中心

基金: 湖北省自然科学基金(2017CFB366),江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室开放基金(HY201702,HY201705)资助项目

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20191005

页码: 34-43

总页数: 10

文件大小: 346K

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一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

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