南海珊瑚共附生微生物防污活性化合物的分离纯化及发酵优化

论文摘要

海洋生物污损会对船舶航运业、海洋工程以及水产养殖业等多种人类活动造成严重危害。使用防污涂料是防除海洋污损最经济有效的方法,其中防污剂是防污涂料中的核心成分,涂料通过防污剂的不断释放以阻止海洋污损生物在船舶及海中设施表面附着。由于传统的重金属防污剂如有机锡和氧化亚铜因为具有毒性会污染海洋生态环境而被禁用或限用,急需开发新型环保防污剂。许多软珊瑚和柳珊瑚的体表光滑,其共附生微生物被认为会产生天然防污物质参与宿主的化学防御,是开发环保型防污剂的一个潜在来源。同时微生物具有生长周期短、易培养的特点,可通过发酵解决海洋动、植物源天然防污物质研发中常碰到的产量受限难题。本文选取南海软珊瑚和柳珊瑚作为研究对象,选用多种不同的培养基对珊瑚体表及体内的微生物进行分离,探究不同菌株代谢产物的防污活性和化学多样性,筛选出防污活性良好、代谢产物丰富的目标菌株聚多曲霉Aspergillus sydowii,从聚多曲霉发酵液提取物中分离化合物,对化合物进行化学结构鉴定和防污活性检测;研究目标菌株在不同发酵条件下对防污化合物产量的影响,确定提高防污化合物产量的最优发酵条件。主要结果如下:（1）从南海软珊瑚和柳珊瑚中分离并鉴定了12株真菌,其中包括4株青霉菌属Penicillium、6株曲霉菌属Aspergillus、1菌喙枝孢菌属iRhinocladiella、1株支顶孢属Acremonium,和6株链霉菌属Streptomyces放线菌。以白脊藤壶Balanuslbicostatus和翡翠贻贝Perna viridis为生物模型检测菌株的防污活性。其中青霉菌Penicillium christensenae 等10株真菌提取物均对白脊藤壶幼体附着有显著的抑制作用,4株放线菌Streptomycespactum、Streptomyces koyangensis、Streptomyces griseorubens和Streptomyces tirandamycinicu 对白脊藤壶幼体附着有显著的抑制作用;菌株Aspergillus penicillioides提取物和菌株S.griseorubens提取物对翡翠贻贝足丝分泌有显著的抑制作用。通过HPLC检测了真菌发酵液的化合物多样性,结果表明菌株A.sydowii发酵液中的化合物组成最为丰富。因此结合防污活性检测结果和HPLC检测结果选取该菌株,即壮真从柳珊瑚Euplexaura robusta体表来源的曲霉A.sydowii 作为目标菌株,进行后续的化合物分离纯化。（2）对目标菌株A.sydowii进行大量发酵及化合物分离纯化,获得并鉴定了1个新化合物3,7-dimethyl-1,5-dioxocane-2,6-dione和4个己知化合物对轻基苯甲醛、对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸和diorcinol。其中diorcinol对浒苔Ulva tepida孢子的附着具有抑制作用,EC50为43.82 μg/mL;对羟基苯甲酸、对羟基苯乙酸、diorcinol和3,7-dimethyl-l,5-dioxocane-2,6-dione对多室草苔虫Bugula neritina的幼体附着具有抑制作用,EC50分别为36.00、42.50、37.02、37.01 μg/mL。对3个苯酚类化合物进行了构效分析,发现对羟基苯甲酸和对羟基苯乙酸中的羧基对防污活性起重要作用。（3）针对防污活性较高和毒性较低的化合物diorcinol和对羟基苯甲酸,以提高化合物产量为目标,进行菌株d.sydowi 发酵条件的优化。结果表明对于diorcinol的产量,发酵最适初始pH为8、最适接种量为4%、最适装液量为200 mL、最适海水比例为0%、最适培养基为察氏培养基、最适发酵时间为10天、最适发酵温度为22℃,其中最高产量为16708.25 μg/L。对于对羟基苯甲酸的产量,发酵最适初始pH为9、最适接种量为3%、最适装液量为300mL、最适海水比例为0%、最适培养基为MY培养基、最适发酵时间为15天、最适发酵温度为28℃,其中最高产量为149.97 μg/L。

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Abstract

重要英文缩略词

第一章绪论

1.1 海洋生物污损及其危害

1.2 海洋防污剂研究进展

1.2.1 防污剂的发展历史

1.2.2 海洋天然防污产物

1.3 珊瑚共附生微生物代谢产物的防污活性研究

1.3.1 珊瑚共附生微生物及其天然产物

1.3.2 珊瑚微生物防污活性物质研究

1.4 研究目的及内容

1.4.1 研究目的

1.4.2 研究内容

1.4.3 研究意义

第二章珊瑚共附生微生物分离纯化及代谢产物检测

2.1 实验材料和仪器

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验器材

2.2 实验内容和方法

2.2.1 珊瑚生物样品的采集及预处理

2.2.2 微生物分离培养基配制

2.2.3 珊瑚共附生微生物的分离纯化和保藏

2.2.4 珊瑚共附生微生物的分子鉴定

2.2.5 珊瑚共附生微生物发酵及代谢产物提取

2.2.6 珊瑚共附生微生物代谢产物防污活性检测

2.2.7 珊瑚共附生微生物代谢产物HPLC检测

2.3 实验结果

2.3.1 珊瑚共附生微生物分离鉴定结果

2.3.2 珊瑚共附生微生物代谢产物防污活性检测结果

2.3.3 珊瑚共附生微生物代谢产物HPLC检测结果

2.4 讨论

第三章聚多曲霉Aspergillus sydowii天然产物的分离纯化

3.1 实验材料

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验器材

3.2 实验内容和方法

3.2.1 聚多曲霉的发酵及提取物获得

3.2.2 聚多曲霉发酵液中化合物的分离纯化

3.2.3 化合物结构鉴定

3.2.4 化合物防污活性检测

3.3 实验结果

3.3.1 聚多曲霉发酵液提取物的分相萃取

3.3.2 化合物的分离纯化和结构解析

3.3.3 化合物防污活性检测结果

3.4 讨论

第四章防污活性化合物发酵条件优化

4.1 实验材料

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验器材

4.2 实验内容和方法

4.2.1 发酵优化实验设计

4.2.2 聚多曲霉种子液配置及发酵萃取

4.2.3 防污活性化合物标准曲线制作

4.2.4 聚多曲霉发酵液中防污化合物的产量测定

4.3 实验结果

4.3.1 防污活性化合物标准曲线

4.3.2 防污化合物发酵优化

4.4 讨论

4.4.1 不同发酵条件对防污化合物产量的影响

4.4.2 防污化合物的发酵优化

第五章结论与创新点

5.1 主要结论

5.2 创新点

5.3 不足和展望

在学期间的个人成果

致谢

参考文献

附录Ⅰ 珊瑚共附生微生物代谢产物HPLC图谱

1H-NMR、¹³C-NMR和ESI-MS图谱'>附录Ⅱ 化合物¹H-NMR、¹³C-NMR和ESI-MS图谱

附录Ⅲ 不同发酵条件下多聚曲霉发酵液提取物HPLC图谱

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 方倩云

导师: 冯丹青

关键词: 防污活性化合物,珊瑚共附生微生物,天然产物,发酵优化

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 海洋学,环境科学与资源利用

单位: 厦门大学

分类号: X55

总页数: 101

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南海珊瑚共附生微生物防污活性化合物的分离纯化及发酵优化

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