芸薹生链格孢转录因子AB04837基因的克隆与功能研究

论文摘要

芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）能够引起十字花科蔬菜产生黑斑病,造成产量和质量下降,食用安全性降低,为该类蔬菜生产带来巨大的经济损失。转录因子对真菌的生长发育及致病性等都具有重要的调控作用,C6型锌指转录因子参与多种真菌的产孢及致病性等的调控,但在芸薹生链格孢中尚未报道。通过对该类转录因子基因功能的研究,有助于我们更加深入的认识芸薹生链格孢的生长发育及致病机理,对有效防治黑斑病具有重要意义。本研究主要以芸薹生链格孢（A.brassicicola）为研究对象,克隆了芸薹生链格孢一个C6型转录因子AB04837基因,根据同源重组的原理,利用Split-marker PCR重组技术以及PEG介导的原生质体转化的方法,成功获得了AB04837基因缺失突变体（ΔAB04837）,并构建了互补体C1。通过基因缺失突变体与野生菌的对比研究发现:（1）AB04837基因全长为2104 bp,cDNA全长为2055 bp,共编码684个氨基酸,含有一个保守的Zn2+结构域,有一个49 bp的内含子,与小麦长蠕孢菌（Pyrenophora tritici-repentis）亲缘关系最近。（2）AB04837基因参与调控芸薹生链格孢的菌落形态和生长,突变体菌落呈白色,气生菌丝茂盛,且生长速度显著快于野生菌。（3）AB04837基因调控芸薹生链格孢分生孢子的产生,突变体丧失了产孢能力。（4）AB04837基因参与调控芸薹生链格孢的抗氧化胁迫的能力,突变体在氧化胁迫培养基中的生长速度显著降低,对氧化胁迫敏感性增强。（5）AB04837基因参与芸薹生链格孢的渗透胁迫应答,与野生菌相比,突变体对低浓度的渗透胁迫耐受性增强,对高浓度渗透胁迫的耐受性显著降低。（6）AB04837基因参与调控芸薹生链格孢的致病性,其突变体致病力显著降低,推测AB04837基因缺失影响了芸薹生链格孢的寄主定殖能力,但对其寄主穿透能力影响较小。（7）AB04837基因参与调控芸薹生链格孢细胞壁的完整性,基因缺失突变体对SDS、CFW、CR的敏感性增强。综上所述,AB04837基因参与了芸薹生链格孢对营养生长、分生孢子的产生、渗透胁迫应答、致病力以及细胞壁生长发育等的调控。

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1 前言

1.1 转录因子概况

1.1.1 转录因子的定义及作用

1.1.2 转录因子的分类

1.1.3 转录因子的研究现状

1.2 芸薹生链格孢概况

1.2.1 芸薹生链格孢侵染循环

1.2.2 芸薹生链格孢的危害

1.2.3 芸薹生链格孢转录因子研究概况

1.3 研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌株及其培养条件

2.1.2 载体

2.1.3 主要试剂、培养基及试验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 AB04837 基因的查找与分析

2.2.2 芸薹生链格孢菌全基因组DNA的提取

2.2.3 芸薹生链格孢菌总RNA的提取

2.2.4 cDNA第一条链的合成

2.2.5 AB04837 基因的克隆

2.2.6 Split-marker PCR重组技术构建打靶载体

2.2.7 大肠杆菌转化

2.2.8 打靶载体的验证

2.2.9 大肠杆菌的扩大培养

2.2.10 质粒提取

2.2.11 重组DNA片段的克隆

2.2.12 重组DNA片段的纯化

2.2.13 重组DNA片段的浓缩

2.2.14 原生质体的制备

2.2.15 PEG介导的原生质体转化

2.2.16 基因缺失突变体的筛选与纯化

2.2.17 突变体DNA的提取

2.2.18 突变体验证

2.2.18.1 普通PCR验证

2.2.18.2 Southern验证

2.2.18.3 构建回补体验证

2.2.18.4 所用引物序列

2.3 AB04837 基因缺失突变体的功能研究与分析

2.3.1 菌丝及孢子的形态观察

2.3.2 菌落生长速度测定

2.3.3 氧化胁迫敏感性测定

2.3.4 渗透胁迫敏感性测定

2.3.5 致病力检测

2.3.6 细胞壁完整性检测

3 结果与分析

3.1 AB04837 基因的分析

3.2 Split-marker PCR重组技术构建打靶载体

3.3 突变体的筛选验证

3.4 Southern杂交验证

3.5 构建互补体验证

3.6 功能研究

3.6.1 AB04837 基因缺失对菌落形态的影响

3.6.2 AB04837 基因缺失对菌丝及孢子形态的影响

3.6.3 AB04837 基因缺失对菌落生长速度的影响

3.6.4 AB04837 基因缺失对胁迫应答反应的影响

3.6.4.1 AB04837 基因缺失对氧化胁迫应答反应的影响

3.6.4.2 AB04837 基因缺失对渗透胁迫应答反应的影响

3.6.4.3 AB04837 基因缺失对盐胁迫应答的影响

3.6.5 AB04837 基因缺失对致病力的影响

3.6.5.1 小油菜致病性检测

3.6.5.2 小白菜致病力检测

3.6.6 AB04837 基因缺失对细胞壁完整性调控的影响

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 国钦君

导师: 徐后娟

关键词: 芸薹生链格孢,产孢,致病力

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 山东农业大学

分类号: S432.44

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芸薹生链格孢转录因子AB04837基因的克隆与功能研究

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