程永刚[1]2004年在《一株发酵液体石蜡菌株的生物学特性及产物初步研究》文中指出液体石蜡通过微生物的作用能被转化为具有高附加值的长链二元酸、生物表面活性剂和单细胞蛋白。从扬子石化的淤泥中筛选到一株能发酵液体石蜡产二元酸的菌株，经鉴定，该菌属假丝酵母属。 该菌在产二元酸的同时，也能产生一种物质，其产量远大于二元酸的产量，并且这种物质能将水的表面张力从72.3mN／m降为32.5mN／m左右，可以作为一种表面活性剂，对这种物质的理化性质进行测定后，得知它的化学稳定性和热稳定性都较好。尤其对于温度和盐度的稳定性较为突出，在121℃维持30min和饱和NaCl浓度下处理1.5h后仍然不失活。其临界胶束浓度为150mg／L。 通过薄板层析、红外、GC／MS分析，得知这种物质为脂肽类物质。 对其对发酵过程优化，得出了发酵的最适培养基，最高产量可以达到1.43g／L，是优化前产量的2.5倍。
李旭[2]2012年在《生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略》文中提出为满足“资源节约型、环境友好型”社会建设和绿色工业发展对绿色净水剂的需求，生物破乳剂作为一种高效、低毒、环保的绿色净水剂，成为破乳剂领域研究的新热点。在高含水原油乳状液以及其它工业乳状液副产品的处理和处置中，应用生物破乳剂替代大量使用的化学破乳剂，对提高乳状液脱水率，降低环境污染风险具有深远意义。但是，生物破乳剂的实际应用进程受到破乳剂产生菌代谢过程不稳定、破乳有效成分复杂及缺少大规模发酵生产经验等问题的制约。基于此，开展破乳菌筛选方法；菌种破乳效能强化；粗产品分离与鉴定；发酵工艺优化及产破乳剂相关蛋白质功能解析等方面的研究，将为生物破乳剂的大规模生产、推广和应用奠定良好基础。将可用于间接表征生物破乳剂破乳效能及破乳菌初筛的6种生物表面活性剂检测方法与破乳试验相结合，提出破乳菌筛选原则，构建高效筛选模式。确定了高效破乳菌(24h排油率≥90%)的判断依据：发酵液表面张力≤40mN/m或细胞表面疏水性(MATH)≥50%。筛选得到7株高效破乳菌，经16S rDNA鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacilllus sp.)和戈登氏菌属(Gordonia sp.)，实验室编号分别为LXH-1、LXH-2、LXH-3、LL1、LL-1、LL-2和LL-3。以生物破乳剂产生菌XH1为研究对象，改进破乳菌复壮方法，其核心是通过烃类物质-液体石蜡为底物排除负变细胞，调节菌株的破乳活性；改进的复壮方法可成功将菌株XH1的表面活性、破乳功能等特性恢复至原始水平，效果优于常规复壮。研究表明烃类物质-液体石蜡对菌株XH1合成破乳有效组分具有刺激和促进作用，利用液体石蜡预先刺激强化菌种，再经生产培养基扩大培养，获得的生物破乳剂可将破乳半衰期t1/2从16h缩短为2h。根据胞外蛋白破乳比活性、细胞表面疏水性等相关试验结果，初步分析液体石蜡强化促进菌株XH1破乳特性的作用机制。菌株XH1经液体石蜡强化后，破乳有效组分主要分布于上清液和附着在菌体表面。分离得到生物破乳剂粗产品，产量为2.01g/L，4mg的排油率(24hR.D.)>93%。利用可见-紫外光谱、红外光谱和薄层层析(TLC)确定粗产品主要功能组分为蛋白质和脂肽类物质；平均分子量为2.59×106Da。并从中粗提得到脂肽类物质的量为0.08±0.01g/g (24h R.D.:65.3%)；破乳活性蛋白复合物可由饱和度25%，45%的(NH4)2SO4粗提得到，产量为0.36±0.02g/g (24h R.D.:67.4%)。利用SDS-PAGE电泳和质谱技术确定疏水蛋白质Oxalate Decarboxylase为一种破乳有效蛋白质。为了提高生物破乳剂的产率，采用响应面法(RSM)确定最优培养基组成为：8.5g/L葡萄糖、3%(v/v)液体石蜡、15g/L磷酸盐(K2HPO4&KH2PO4)、1.5g/L酵母膏和3.36g/L氯化铵；与优化前相比排油率(24h)提高了35.5%，破乳剂粗产品产量提高了1倍。进一步确定最佳发酵条件为：培养温度29℃、摇床转速200r/min、培养时间21h和种子液菌龄24h。为了确定破乳菌XH1的发酵方式，首先基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程及Luedeking-Piret-Like方程建立描述菌株XH1分批发酵生产破乳剂的动力学模型，经检验该组模型能较好的拟合XH1发酵过程。进一步比较不同的发酵方式，结果表明分批补料半连续式发酵优于分批发酵，最佳补料参数：初始葡萄糖为2.0g/L；补料方式为间歇式，间隔时间为5h；补料量为：控制每次补料量比前一次增加0.02%~0.04%。破乳菌XH1在最佳补料方式下破乳剂粗产品产率提高55.9%，产品对糖得率提高44%，高效破乳剂(24h排油率>80%)连续生产周期延长了50h。为了确定参与生物破乳剂合成的相关蛋白质，采用SDS-PAGE电泳研究液体石蜡刺激强化培养和单一营养物质缺失对XH1破乳效能和菌体总蛋白变化的影响，获得差异表达蛋白复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。通过nanoESI-Q-TOF MS/MS共鉴定出66个差异表达蛋白质，分属于碳水化合物的转运和代谢、能量产生与转换、翻译/核糖体结构和生物合成等14个蛋白质功能。确定以上差异表达蛋白质中与糖酵解途径(EMP)、叁羧酸循环(TCA)以及蛋白质合成相关的酶与菌株XH1合成蛋白质和脂肽类生物破乳剂关系密切，进一步从蛋白质组层面分析不同发酵条件影响菌株XH1产生物破乳剂能力的作用机制。基于以上研究结果，建立发酵工艺条件、差异蛋白质功能以及生物破乳剂合成过程叁者的关系，从代谢调节、菌种特性和发酵工艺叁个层面综合分析强化破乳菌XH1产破乳剂能力的策略，并提出菌种高效筛选→菌种改进复壮→液体石蜡刺激强化→半连续发酵生产的破乳菌XH1发酵形式，对于今后生物破乳剂大规模生产具有重要的参考价值。
刘畅[3]2012年在《生物破乳剂产生菌突变株的破乳性能及环境适应性的强化》文中研究表明绿色生物制剂生物破乳剂以其低毒、无二次污染、可生物降解等独特的环境友好特性，逐渐成为该领域的研究热点。原油采出液因为使用水驱、蒸汽驱以及聚合物驱、碱驱、叁元复合驱等强化驱油技术导致温度偏高，pH值变化范围大，使其破乳脱水增加了难度。运用生物破乳剂替代大量使用的化学破乳剂，对提高乳状液脱水率，降低环境污染风险具有深远意义。但随着生物破乳剂研究的不断深入，野生菌的产量或性能难以满足工业生产的要求、生物破乳剂的使用受环境条件制约以及生产成本高等问题，已成为阻碍其大规模生产和推广的关键。本课题围绕以上问题开展相关研究，采用诱变方法改良生物破乳剂产生菌菌种的破乳能力，通过环境条件定向筛选的方法改良菌种极端环境适应能力；从蛋白质组学角度解析环境条件定向筛选对耐高温、耐碱和耐酸突变株的作用机制；初步开展破乳菌复配培养产复合型生物破乳剂的研究，为今后实际生产获得高效、稳定、广谱，廉价的生物破乳剂奠定理论基础。为了提高野生菌株的破乳能力，本文对野生破乳菌XH1(Bacillus sp.)进行诱变育种。通过比较不同的诱变因子对破乳菌XH1的诱变效应，确定最佳诱变方式为紫外线+亚硝基胍（NTG）的复合诱变，筛选获得的最佳破乳突变株XN5，与出发菌株相比破乳能力提高15.12%。优化突变株XN5的培养条件，确定最佳培养条件为：培养温度35℃、摇床转数140min、培养基初始pH值7.0、培养时间21h。考察复合诱变对突变株XN5破乳性能的影响，发现与原始菌株XH1相比，诱变后所产生物破乳剂的投加量减少，破乳速率提高，但环境温度和pH值适应范围无显着变化。通过诱变后进行环境条件定向筛选分别获得了耐高温、耐酸和耐碱的突变株XT3、XP3-3和XP11-2。突变株与原始菌株XH1相比在目的环境条件下的破乳性能大幅提高。利用SDS-PAGE、2-DE和nanoESI-Q-TOF MS/MS质谱结合的蛋白质组学研究手段，对原始菌株和突变株在相应条件下获得的差异表达蛋白质进行分离、鉴定和功能解析，从蛋白质组层面对环境条件定向筛选对与生物破乳剂产生菌的作用机制进行初步的分析。采用生物表面活性剂检测方法及破乳试验相结合的筛选方法，从太平污水处理厂曝气池污泥泡沫中筛选出1株以液体石蜡为碳源的高效、稳定的破乳菌（24h排油率98.5%），实验室编号L1，经鉴定为Gordonia sihwensis。该菌全培养液的破乳能力不受升温处理，高压灭菌和反复冻融的影响(24h排油率>90%）。在无机盐培养基(MSM)中考察培养条件对破乳菌L1破乳效能的影响，获得最佳培养条件为：培养温度30℃、摇床转数140min、培养基初始pH值7.0、培养时间60h。为了摸索复配培养产复合型生物破乳剂的最优培养条件，选择破乳菌XH1与L1在初始无葡萄糖的改进无机盐培养基(MMSM)中进行培养，利用响应面法(RSM)对复配培养条件进行优化，经模型的分析与验证，确定最佳培养条件为：种子液比例(L1:XH1)为3:2、葡萄糖投加时间为第4d，液体石蜡含量3.6%(v/v)，投加葡萄糖后再培养21h，获得复合型生物破乳剂排油率>95%(24h)。与单株菌培养相比，表现出投加量少、破乳接触时间短、对温度和pH的适应性高的优势。同时双株破乳菌复配培养有效的提高了培养中主要营养物质的利用率，生产每吨破乳粗产品与单独培养XH1相比可节约72.6%底物所需的成本。
韩波波[4]2008年在《高温菌的分离纯化及性质研究》文中提出高温菌广泛分布于自然界之中,具有耐热嗜热的特性。其降解性能好,代谢效率高,所产生的嗜热酶已经应用于一些工业当中。但现在对高温菌的研究还相对不足,仍然需要大量降解性能好的优良高温菌株,以便能够更好地利用高温菌资源,使其在工业上具有更广阔的应用前景。本文从高温堆肥中分离出多种高温菌株,研究这些菌株的生长特性、生理生化性质及有机物降解性能,并进行了高温菌保藏技术的初步研究,结果如下:1.利用LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基,从高温堆肥中分离到得到形态不同的高温菌217种,其中在60℃、65℃和70℃的温度条件下分离出的高温菌株分别为91株(YB 54株/LB 37株)、71株(YB 42株/LB 29株)和55株(YB 38株/LB 17株)。2.通过测定高温菌株的生长曲线来观察其生长速率的快慢。数据表明,大部分高温菌的迟缓期较短(≤4h),该数值低于大多数常温菌的迟缓期。此外,大部分高温菌的对数期持续时间较长,许多高温菌株的对数期持续时间均超过了18h。这也体现在高温菌分离纯化过程中平板容易长成一片的现象。3.通过对淀粉、油脂、蛋白质及纤维素四类大分子有机物降解性质研究表明,大多数高温菌表现出对淀粉和油脂较强的降解能力,一些高温菌株对纤维素也具有良好的降解能力。4.生理生化性质的研究表明,叁个温度条件下分离出高温菌株的细胞形态以杆状为主。60℃和70℃温度条件下分离出的高温菌株主要以革兰氏阳性菌为主,而65℃温度条件下分离出的高温菌株则以革兰氏阴性菌为主。许多高温菌株都够形成芽孢。有相当数量的菌株都能够产生氧化酶和接触酶,并具有运动性,而且也可以发现绝大多数菌株的需氧性为兼氧,一小部分菌株为好氧,余下的极个别菌株为厌氧。5.对高温菌保藏技术进行的初步研究表明,液体石蜡覆盖传代培养保存法、冷冻保存法、冷冻干燥保存法在低温冰箱和超低温冰箱冷冻条件下具有较好的保藏效果。
刘晓娇[5]2011年在《拮抗放线菌对烟草黑胫病的控病研究》文中研究说明烟草是我国重要的经济作物之一。近几年来,重庆烟区烟草黑胫病发病甚为严重,造成大量经济损失。在烟草病害的多种防治方法中,生物防治对烟叶生产的可持续发展具有较好的应用前景。放线菌是生防微生物的重要来源,在植物病害的生物防治中占有重要地位。本试验针对烟草黑胫病菌,主要进行了拮抗放线菌的筛选、发酵液抑菌活性研究、发酵液的稳定性及发酵条件的优化,并进一步探讨其生防控病机理及其防效。具体结果如下：1、采用对峙法将实验室已分离的30株放线菌进行初筛和复筛。初筛结果表明：21株放线菌对烟草黑胫病菌有拮抗活性,其中菌株YSL 5-2拮抗效果最好,达到了36mm。抑菌带宽在10mm以上的菌株有7株。复筛平板拮抗试验中,初筛时拮抗效果最好的7株放线菌均保持较好的拮抗作用,抑菌圈带宽达到了12～30mm。采用抑制孢子萌发法和抑制菌丝生长速率法测定平板复筛拮抗效果较好的11株放线菌发酵液对烟草黑胫病菌的抑制作用。测定表明：7株放线菌发酵液对烟草黑胫病菌孢子萌发有较好的抑制作用,抑制率均在50%以上,其中菌株CWA-4、LZ 2-7、SYZ 2-6对烟草黑胫病菌孢子萌发抑制率均达到100%。对烟草黑胫病菌菌丝生长抑制率达到80%以上有8株,抑制率在90%以上的有5株,其中菌株CWA-4对烟草黑胫病菌菌丝生长抑制率达96.97%。2、对4株拮抗效果较好的放线菌进行抑菌谱测定。结果表明：4株放线菌对23株供试病原菌有较好的抑制作用。菌株LZ 2-7、CWA-4、YYZ-8分别对5株供试病原菌抑菌带宽达15mm以上,对12株供试病原菌抑菌带宽达10mm以上。菌株YSL5-2的抑制效果最好,抑菌带宽达15mm以上的供试病原菌有22株,其中11株抑菌带宽达20mm以上。3、为了筛选一种拮抗放线菌较好的保存方法,选用斜面保存法、蒸馏水保存法、甘油保存法、液体石蜡覆盖保存法和砂土管保存法5种方法保存7株拮抗放线菌。试验结果显示：除保存6个月时蒸馏水保存法和液体石蜡保存法各有6株菌株对烟草黑胫病菌的拮抗活性较高,在3个月时甘油保存法有6株菌株拮抗活性较高,保存9和12个月时,采用甘油保存法保存7株菌株拮抗活性均为较高。由此可看出,甘油保存法较其他保存方法较好。但是,5种方法保存的菌株对烟草黑胫病菌拮抗活性在保存6个月比保存3个月时明显下降,说明5种保存方法对保持拮抗放线菌拮抗活性稳定性还不理想。4、初步研究了菌株LZ 2-7的发酵条件,确定了最佳发酵培养基配方和发酵条件。单因素发酵试验表明：最佳发酵培养基配方为：玉米粉10g、蔗糖10g、氯化钠2g、硫酸铵3g、碳酸钙2g、pH值7.2-7.4、蒸馏水1000mL。最佳发酵条件为：培养基初始pH为7.0,28℃培养,装瓶量为250 mL,摇床转速为140 r/min,培养5d左右抑菌物质活性达最高峰。以烟草黑胫病菌为指示菌,测定了菌株L Z 2-7、CWA-4发酵液的稳定性。结果表明：两个菌株随时间增长,抑制率不断下降,但在贮藏前30d两株放线菌抑制率均保持在80%以上,均有较好的抑菌活性,贮藏90d时,抑制率几乎下降叁分之一,而且两株菌同一时间在4℃条件下贮藏抑菌活性较高。两个菌株都在弱酸性和中性条件时抑菌活性较高。温度在80℃以下抑菌活性都比较稳定,80℃以上随加热时间的延长,抑制率下降速率较快,尤其是发酵液CWA-4121℃处理30min抑制率下降至2.66%。在日光照射下两个菌株抑菌活性较稳定,但紫外光照射下,抑菌活性不断下降,尤其是菌株CWA-4经过4h紫外光的连续照射抑制率下降了27.84%。5、初步研究了菌株L Z2-7、CWA-4对烟草黑胫病菌的抑制机理。试验表明：放线菌对烟草黑胫病菌菌丝生长、游动孢子囊的产生、释放、游动孢子游动、萌发、病原菌的侵入及致病性都有明显的抑制作用。经放线菌发酵液处理的烟草黑胫病菌菌丝表现为菌丝凹陷、干瘪、皱缩、变形、菌丝溶解等现象。6、选用4株放线菌采用五种不同处理方法对烟草黑胫病进行温室控病试验。试验结果表明：只接入病原菌的发病对照CK2的发病率高达70%,而接入拮抗放线菌的烟苗发病率相对较轻,其中采用处理二接入菌株CWA-4的烟苗仅有一株发病,其相对防效达到了95.55%。4株菌株各处理的相对防效均超过50%,其中菌株CWA-4各处理的相对防效均在70%以上,菌株LZ 2-7各处理的相对防效均在69%以上。五种处理方法比较,菌株LZ2-7、CWA-4和YYZ-8采用处理方法五的相对防效较高,分别为93.64%、96.18%、73.24%；菌株YSL5-2采用处理方法二相对防效较好,为82.17%。不同菌株相对防效最好的处理方法不同,具体生产应用中可根据不同菌株选用适宜的处理方法。在接入病原菌7d、14d后,调查烟苗发病情况,计算拮抗菌相对防效的统计结果显示,施加拮抗放线菌对烟草黑胫病都有很明显的防控作用,总体来说,接病原菌后7d的防效均较高,随着时间的增长,防效有下降趋势。个别菌株也有例外,如菌株CWA-4处理五及YSL5-2处理一的相对防效较稳定。从选择对烟草黑胫病有长期、较好的防治效果的优良菌株来看,菌株CWA-4采用处理方法五防效最好,而且相对稳定。选用温室控病试验防效较好的菌株LZ 2-7和CWA-4进行小区防治试验。实验结果表明：放线菌发酵液对烟草黑胫病有较好的防治作用,处理后的烟草发病率和病情指数均明显低于对照。只接入病原菌的发病对照CK2的发病率高达46.67%,而接入拮抗放线菌的烟苗发病率相对较轻,其中采用处理方法五接入菌株LZ2-7的烟苗仅有3株发病,发病率为10%。菌株LZ 2-7五种施用方法中,处理五的防治效果最好,相对防效达74.32%。其次是处理叁和处理一。菌株LZ 2-7与CWA-4同时采用第一种施菌方法,LZ 2-7的防治效果较好,相对防效达27.03%,而CWA-4的相对防效仅为10.84%。
宋维霞[6]2014年在《粉红粘帚霉IK726的诱变选育及其室内药效研究》文中认为草莓、黄瓜、番茄等果蔬在种植或采收贮藏过程易受灰葡萄孢引起的灰霉病的感染，造成果蔬花、茎的萎缩，果实的腐烂。粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)是自然界中广泛存在的一种真菌，可有效的防治灰霉病。作为生防真菌，粉红粘帚霉具有生长速度快、寄主范围广、寄生能力强、拮抗机制多样等优点，但其野生型菌株产孢量较低、抑菌效果较差，目前尚无法进入工业化阶段。本文以粉红粘帚霉菌IK726为出发菌株，对其进行紫外、温度、亚硝酸钠单因素诱变及温度-紫外复合诱变、亚硝酸钠-紫外复合诱变选育，确定各种诱变的最佳诱变条件。对筛选得到的突变菌株进行生物学特性对比，最后进行室内药效研究，评价其生防性能，为大田试验做准备。实验得出诱变选育的最佳条件分别为：紫外诱变：100s；温度诱变：4min；亚硝酸钠诱变：12min；温度-紫外复合诱变：先温度诱变4min，再紫外照射100S；亚硝酸钠-紫外复合诱变：先亚硝酸钠诱变12min再紫外照射100S。通过生物形态、产孢量初筛，抑菌活性复筛，筛选得到了五株性状优良的突变菌株UVG-4、TMG-1、NAG-3、TUG-1和NUG-2；产孢量分别为原始菌株的2.70倍、1.73倍、2.95、2.41倍和2.86倍，其遗传稳定性、生物学性状和抑菌效果均优于原始菌株。通过单点对峙、多点对峙实验，筛选出各方面性状均优于其它突变菌株的亚硝酸钠-紫外复合诱变菌株NUG-2。对原始菌株及突变菌株NUG-2进行室内药效实验，得出：粉红粘帚霉菌的抑菌活性随其孢子浓度的增大而增强，NUG-2的抑菌活性优于原菌。NUG-2孢子浓度在1.0×106个/mL时对灰霉菌丝生长的抑制率达95.01%；孢子浓度在1.0×107个/mL时对灰霉菌孢子萌发相对抑制率达83.48%。在盆栽实验中，NUG-2对草莓叶片灰霉病病斑的抑制作用最好，且在发病前48h施用效果最好，说明粉红粘帚霉适用于对灰霉病的预防。
张俊会[7]2015年在《驱油菌株筛选及其对原油与石蜡理化性质的影响及机理研究》文中进行了进一步梳理微生物提高原油采收率技术(Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR)被认为是目前最有发展前景的采油技术,对于高含水的枯竭油藏开采具有更为重要的意义。本论文从陕北安塞及志丹油田筛选出一批性能优良的真菌和细菌,以农副产品为原料生产真菌酶制剂及细菌固态菌剂,研究酶制剂与细菌固态菌剂对原油与石蜡理化性质的影响,并从原油与石蜡的组分变化、产酸、产气以及脱附性等角度探讨其作用机理;同时对3株优势细菌进行了清防蜡效果及其作用机理研究,依据上述研究结果对真菌粗酶制剂、固态细菌制剂及细菌菌体提高原油采收率与清防蜡的可行性及其应用于微生物采油的潜力进行了初步评价。论文主要研究结果如下:1.驱油真菌筛选鉴定从陕北安塞油田的油污土壤中分离筛选出6株真菌,其编号分别为PJ1,PJ2,PJ3,PJ4,PJ5,PJ6。通过菌落形态特征、显微形态观察及ITS序列分析将其鉴定到种,6株驱油真菌PJ1、PJ2、PJ3、PJ5均为烟曲霉(Aspergillus fumigatus),PJ4为黄曲霉(A.flavus),PJ6为土曲霉(A.terreus)。研究发现,这6株真菌对原油及石蜡具有很强的降解作用,其最大降解率分别为79.4%及38.3%,表明这6株真菌具有高活性的烃类物质降解酶系。2.真菌粗酶制剂酶活性及酶油反应配比研究将6株真菌制成粗酶粉,测定其脱氢酶和2,3双加氧酶活性,并进行粗酶制剂活性影响因素及酶油反应配比研究。结果表明:6株真菌均能合成脱氢酶和加氧酶,活性分别为29.68~93.57 mg·g-1·h-1和21.06~25.40 mmol·g-1·h-1,不同菌株酶活性差异较大,菌株PJ5合成的脱氢酶和加氧酶活性较高。在对脱氢酶的耐受性试验中,E1和E5两种粗酶制剂具有较强的耐盐性和耐酸碱性,当NaCl浓度升高到50 g/L、含油地层水矿化度升高到92.43 g/L时,脱氢酶活性才显着下降;pH对脱氢酶活性影响较小,在pH值6.0~10.0这个范围内,两种粗酶制剂均具有较强活性。表明这两种真菌粗酶制剂具有较强的环境适应性。在原油与酶液配比试验中,从使用效果及经济性综合考虑,在酶液浓度8 g/L及原油与酶液配比为1:15进行反应时,原油的脱附性及乳化性均较好。3.真菌酶对原油及石蜡理化性质的影响真菌胞外酶能大幅度降解原油中的烷烃、芳香烃、胶质及沥青,对胶质及沥青质的最大降解率达到38.9%及24.7%;酶降解作用能够大幅度提高原油中230℃可气化小分子烃的含量并降低原油黏度,其中可气化烃各组分总含量较对照增加5.6%~28.8%,40℃时的原油粘度较对照降低40.5%~59.0%;降解过程中产生大量CO2和H2,产气率分别为发酵液体积的21.3%~53.3%和38.3%~100%;并产生草酸与丙酸等短链有机酸,使酶解液的ph也较对照下降22.7%~29.4%,产酸总量为22.25~24.13mmol/l,酸值达到1335~1448mg/l。供试6株真菌酶制剂均能够产生表面活性物质,有助于原油脱附:供试酶液对原油在滤纸上的脱附率达到83.4%~87.8%,为对照的7.37~7.75倍。真菌胞外酶也能够大幅度降解石蜡,经酶降解处理,固体石蜡在正己烷中的溶解性显着增加,其中,18℃时在正己烷中的可溶组分占石蜡总量的78.6%~86.2%,较对照增加31.9%~44.6%;18℃时正己烷可溶组分中230℃可气化成分中保留时间较短的小分子烃数量较对照减少3.7%~26.9%,保留时间较长的大分子烃数量较对照增加5.5%~19.6%;石蜡固液态转化时的初始相变点提高4℃;并在降解过程中产生大量co2和h2,产气率分别为水解液体积的26.7%~66.7%和50.0%~125.0%;并产生草酸与丙酸等短链有机酸,酶解液ph也较对照下降22.3%~28.5%,产酸总量为21.44~23.25mmol/l,酸值达到1327.8~1395.0mg/l。4.驱油细菌筛选鉴定从陕北安塞油田、志丹油田的原油及油污土壤中,分离筛选出3株细菌,其编号分别为5-2a、6-2a及2a。通过形态特征及16srdna全序列分析,将这3株降解菌株鉴定到种:5-2a为萎缩芽孢杆菌(bacillusatrophaeus);6-2a为巨大芽孢杆菌(bacillusaryabhattai);2a为墨西哥微小杆菌(exiguobacteriummexicanum)。这3株细菌均为好氧菌,不运动,在30~80℃温度范围及0~100g/l这个浓度区间内,能够存活。研究发现这3株细菌的发酵液能大幅度降解原油中的烷烃、芳香烃、胶质及沥青,其降解率分别为30.0%~57.8%、47.4%~73.1%、61.4%~72.8%及42.1%~57.9%。细菌降解作用能够大幅度提高原油中230℃可气化小分子烃的含量并降低原油黏度,其中可气化烃轻质组分总含量较对照增加27.4%~61.0%,原油粘度降低7.4%~11.1%。发酵液对原油的脱附率达到66.5%~94.2%,为对照的5.32~7.53倍。5.固态细菌制剂对原油及石蜡理化性质影响细菌菌剂能大幅度降解原油中的烷烃、芳香烃、胶质及沥青,其降解率分别为12.5%~15.1%、23.7%~39.3%、19.8%~24.2%及53.1%~56.2%;菌剂降解能够提高原油中230℃可气化小分子烃的含量并降低原油黏度,其中可气化烃各组分的总相对含量较对照增加了108.0%~62.6%,40℃时的原油粘度较对照降低24.7%~29.4%;菌剂在降解原油过程中能产生大量co2和h2,产气率分别为水解液体积的74.0%~81.0%和138.3%~152.3%;并产生草酸与丙酸等短链有机酸,酶解液的ph也较对照下降26.47%~36.03%,产酸总量为23.5~26.0mmol/l,酸值达到1410~1560mg/l。细菌菌剂对固态石蜡也具有良好的降解作用,经过菌剂降解,固态石蜡在正己烷中的溶解性显着增加,经过菌剂降解作用,18℃时,在正己烷中可溶解的石蜡量已达到石蜡总量的68.6%~77.2%,较对照增加15.0%~29.5%;18℃时正己烷可溶组分中230℃可气化成分中保留时间较短的小分子烃的相对含量较对照减少6.9%~14.9%,保留时间较长的大分子烃数量较对照增加18.4%~25.7%;降解过程中产生大量co2和h2,产气率分别为水解液体积的65.0%~80.0%和120.0%~150.0%;并产生草酸、丙酸和甲酸等小分子有机酸,反应液ph也较对照下降27.3%~36.8%,产酸总量为22.88~25.75mmol/l,酸值达到1373~1545mg/l;同时改变了石蜡的蜡晶形态。6.细菌清防蜡效果及作用研究经过细菌发酵液处理,石蜡的化学结构发生改变,其在正己烷中的溶解性显着增加,18℃时可在正己烷中溶解的石蜡达到石蜡总量的57.7%~62.0%,较对照增加1.5%~9.0%。细菌发酵液对固体石蜡具有很好的脱附作用,脱附率达到及36.2%~100.0%。3株细菌具有很好的防蜡、清蜡作用,其中防蜡率达到了94.6%~98.1%,清蜡率达到了69.1%~89.3%。此外,3株细菌均能附着在玻璃质及钢质载体表面生长,细胞密度大,结合紧密,其在玻璃及钢片表面的附着密度分别达到了1.95×106~7.67×108cfu/cm2及8.67×104~7.48×108cfu/cm2,其中,紧结合态细胞附着密度达到3.22×104~6.81×106cfu/cm2及6.67×103~2.00×108cfu/cm2。7.萎缩芽孢杆菌所产的表面活性物质及其对原油脱附效果本研究筛选出的萎缩芽孢杆菌能以尿素为氮源合成脂肽类阳离子型表面活性物质。该表面活性物质具有以下特性:良好的排油活性、乳化活性及较低的表面张力值,其排油圈达19.1cm,乳化指数达59.49%,表面张力值为25.43mn/m,液态发酵所得表面活性物质粗干品收率为0.77g/l;能够耐受高温及高盐,在20~100℃温度范围及10g/l~90g/l盐浓度时,排油圈直径、乳化指数及表面张力值相对稳定;具有较强的ph适应性,适应范围为6~13,耐碱性较强;对滤纸及细沙上附着的原油均具有良好的脱附作用,其脱附率分别为93.1%及90.0%。8.真菌粗酶制剂与固态细菌制剂对原油及石蜡理化性质影响的作用机理真菌胞外酶与固态细菌制剂均可通过以下途径影响原油及石蜡理化性质:①降解作用:可降解固体石蜡及原油中的烷烃、芳香烃、胶质及沥青,使石蜡及原油中的重质组分分解为轻质组分,降低原油黏度,减少可沉积的石蜡量,有效改善原油的流动性及石蜡的蜡晶形态。②产气:酶及菌剂在降解原油及石蜡过程中产生大量co2和h2,这些气体能够增加油层内部压力,气体溶入原油会降低原油黏度,改善原油流动性。③产酸:酶及菌剂在降解原油及石蜡过程中产生大量草酸、丙酸等有机酸,可有效溶解储油岩层孔隙中的碳酸盐,增加油层的孔隙度和渗透率,同时还能降低油水之间的界面张力,形成油水乳浊液,从而提高原油采收率。④产生表面活性物质:6株真菌及3株细菌均能够产生表面活性物质,有助于原油脱附,同时对石蜡具有一定的乳化、分散作用,改变蜡晶颗粒,使其变细变小而被采出液带出油井,从而起到清蜡作用。9.细菌清防蜡作用机理①降解作用:供试细菌对石蜡具有一定的降解作用,可降低重质组分在原油中的含量,减少可沉积的石蜡量。②在载体表面形成菌膜:供试细菌可较牢固地附着在金属表面生长繁殖,形成由微生物细胞组成的具有很强的抗流体冲刷能力的细胞膜,可阻止蜡质在载体表面结晶沉积。③合成表面活性物质:供试细菌代谢产生的表面活性物质等粘附在金属表面,改变其表面湿润性,使非极性的蜡晶难以在金属表面沉积;供试细菌产生的表面活性物质对石蜡具有一定的乳化、分散作用,使蜡晶颗粒变细变小而随采出液流出油井,从而起到清蜡作用。
陈云瑛[8]2008年在《脂肽生物表面活性剂的制备、理化性质和抑菌活性研究》文中提出生物表面活性剂具有许多自身优势:可生物降解,不会造成再污染;无毒或低毒;一般不致敏、可消化,因此可用于化妆品领域和作为食品的添加剂;可以从工业废物中生产,用于生物环境治理;具有更高的起泡性;在极端温度、pH、盐浓度下的更好选择性和专一性;结构多样,在特殊领域具有一定的可适用性。生物表面活性剂以其化学合成表面活性剂所无法比拟的环境兼容性及广阔的发展前景,日益受到国内外科学界的关注。因此,丰富生物表面活性剂产生菌的资源、提高其在发酵液中的产量具有广泛的生物学和经济意义。本论文主要从生物表面活性剂产生菌的筛选、高产菌株的紫外诱变选育、菌株的鉴定、发酵条件的优化、产物的理化性质以及产物的提取纯化和抑菌活性的应用等方面作了较全面的研究,为其工业化生产和应用奠定了理论基础。(1)利用表面张力、排油圈直径和乳化能力相结合的方法,筛选获得生产表面活性剂的优势菌L-104-1,采用紫外诱变的方法对菌L-104-1进行诱变处理,得到的诱变菌株命名LY,LY菌的各项指标都优于原出发菌株,其在葡萄糖作为碳源时表面张力为30.4mN/m,对液体石蜡-水的乳化能力为84.5%,正十六烷-水中的排油圈直径为11.2cm,且传代后性质稳定,表明紫外诱变的结果是具有致突变作用的,是可遗传的变异。对筛选出的LY菌株进行了系统鉴定,通过形态观察、VITEK2全自动细菌鉴定仪和Biologe微生物系统鉴定仪最后鉴定结果为枯草芽孢杆菌。LY菌产生的活性物质主要分泌到细胞外,是胞外代谢产物,引起发酵液表面张力降低的主要活性物质为脂肽类。(2)对LY菌的发酵液进行初步分离提取,得到具有生物活性的发酵上清液提取物-生物表面活性剂,初步考察了该生物表面活性剂的种类和理化性质,进行了稳定性试验。实验表明该生物表面活性剂为脂肽类物质;临界胶束浓度为30mg/L;对液体石蜡等疏水性有机物质有较强的乳化能力,10d后的油水乳化能力仍能达到80%以上;对盐浓度的耐受性达到15%;对pH的适应范围较宽,在2~12的范围内变化不大;对温度变化表现出极强的耐受性,经120℃的热处理后,其表面张力仍能保持。(3)对枯草芽孢杆菌LY摇瓶发酵工艺进行了优化,确定优化后的培养基主要成分和培养条件为:即碳源为60g/L的蔗糖,氮源为硫酸铵,其合适的C/N比为13/1、初始pH值7.0、氯化钠添加量1%、接种量4%、摇床转速160r/min。基本明确该综合条件下发酵过程的参数变化规律,发酵周期为72h,此时菌体生长量比优化前的最大值增加了20.5%,所产的脂肽生物表面活性剂浓度比优化前的最大值增加了25.3%,为211.2mg/L。(4)对从LY菌中所提取的脂肽生物表面活性剂溶液进行抑菌实验,结果表明该生物表面活性剂溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌都高度敏感,有较好的抑制效果,尤其是对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌,当浓度稀释到0.005g/L时仍具有抑菌效果。且抑菌活性物质既能耐受低温也能耐受高温,热稳定性良好,并且在中性及碱性条件下比较稳定,酸性条件下,抑菌活性有所降低。在菌体浓度较低的时候,随着生物表面活性剂加入量的增加其抗菌或杀菌效果变得越来越显着;而当菌体浓度过高时加入生物表面活性剂,其杀菌效果变弱,并且出现杀菌效果的时间延迟。初步研究脂肽的抑菌机理是因为加入的脂肽可以导致菌体的细胞膜通透性增加,从而导致细菌细胞死亡。
张林达[9]2008年在《生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究》文中提出生物表面活性剂(biosurfactant)是由植物、动物或微生物产生的具有表面活性的生物分子,目前研究最多的是通过微生物发酵法生产的生物表面活性剂。与化学表面活性剂相比,生物表面活性剂不仅具有同样甚至更为良好的降低表面张力和稳定乳化液等特性,还具有无毒、能够被微生物完全降解和不对环境造成污染等优良的环境兼容性,并且具有选择性好、用量少等优点,从而在农业、建筑、食品饮料、工业清洗、皮革、造纸、医药、石油及环境保护等众多行业和领域得到了广泛重视和应用。使得生物表面活性剂的产生菌及其产物得到了广泛而深入地研究。但是,目前生物表面活性剂的低产量、高成本严重制约了生物表面活性剂的规模化和工业化。为此,广泛探索和深入研究产生物表面活性剂的菌株及其生产途径、产物分子结构和功能间的关联性,是促进其工业化发展必由之路。所以,通过结构筛选和计算机模拟,生产出具有特定用途和高附加功能的生物表面活性剂是未来研究发展的重要任务。而一旦筛选出高效的生物表面活性剂产生菌,研究的关键便在于优化生产条件和提纯方法,并找到与之相关的应用领域。为此,综合其它学科和各种技术,如模拟技术、纳米技术、生物技术等,必将是目前发展的总体趋势。目前产生物表面活性剂菌株已经有大量报道,但是,微生物是地球上十分丰富的资源,为人们所认知的微生物还不到自然界中微生物总数的1%,因此,还有大量的、具有开发潜力的生物表面活性剂菌种未被发现。所以,本文首先通过设计筛选培养基,从有机农药的活性污泥中筛选出叁株具有产生物表面活性剂特性的细菌,并经过形态学、生理生化试验和基因鉴定,均属于不动杆菌。其中不动杆菌W2产表面活性剂的性能最好,所以,继续对其发酵产表面活性剂的影响因子进行了摸索,初步得到了最优化的发酵条件。这对生物表面活性剂的开发研究具有广泛的生物学和经济意义。同时,当前微生物学和分子生物技术得到了空前的发展,微生物的发酵途径和代谢调控的分子机制得到了广泛而深入地研究,并越来越明朗化。为此,筛选目的菌株,对其进行目的基因分析,并通过分子生物技术构建高性能的基因工程菌是实现工业化的必要手段。本文也对筛得的细菌W2进行了功能基因的研究。通过细菌质粒的消除法和快速检测技术,发现该菌至少存在一个较大质粒;通过电泳检测,结果发现未消除质粒的细菌能产生噬油斑(即产表面活性剂),消除了质粒的细菌不能产生噬油斑(即不产表面活性剂)。从而初步断定该菌产表面活性剂的功能基因位于这个质粒上。这项工作为进一步研究表面活性剂产生菌的目的基因作了一定的铺垫。
陈启和[10]2003年在《弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究》文中指出弹性蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，它主要用作治疗高血脂症、防止动脉粥样硬化的生化药物，同时由于其广谱的蛋白水解活性，不仅在医疗上有其应用价值，而且在食品工业、日用化学工业上有着广阔的应用前景和较高的商业价值。本文主要从菌种的选育入手，研究了弹性蛋白酶的发酵技术和发酵工艺，同时构建了分批发酵动力模型。研究了氧载体吐温80在调控细胞生长和弹性蛋白酶合成过程的作用，以及弹性蛋白酶的纯化和酶学性质及酶促反应动力学，最后探讨了弹性蛋白酶在肉类嫩化中的应用效果和作用机理。主要研究结论如下： (1)从土壤中筛选的菌株EL3所产弹性蛋白酶的酶活为60U／ML，发酵24h，经鉴定该菌株为芽孢杆菌。经紫外、微波和硫酸二乙酯复合诱变，突变株EL314CF10的产酶水平明显提高，为出发菌株的2.9倍。葡萄糖、酪蛋白最有利于菌株产生弹性蛋白酶，而麸皮和羽毛粉作为一种廉价的碳源、氮源分别可以取代葡萄糖和酪蛋白。无机氮源不利于细胞生长和弹性蛋白酶的产生。玉米提取物作为生长因子，发现它能极大提高生物量积累和弹性蛋白酶分泌。对获得的最佳单因子-葡萄糖、酪蛋白和玉米提取物进行了最适浓度正交实验，发现叁个因子对产酶影响的优先顺序是：酪蛋白＞葡萄糖＞玉米提取物，叁因子的优化水平组合为4％葡萄糖、2％酪蛋白和0.5％的玉米提取物。装液量影响弹性蛋白酶的产生反应出溶氧对细胞生长和产物合成的显着影响。 (2)用响应面优化方法对种子培养基进行了优化，牛肉膏和酵母膏对种子的生长影响尤为显着，而氯化钠和蛋白胨对种子的影响不是很明显。 对发酵培养基进行了系列优化，得到了优化后的培养基组成为(g／L)：葡萄糖74.0，酪蛋白11.30，玉米提取粉6.16，磷酸氢二钾2.06，硫酸镁0.34，pH7.5，与部分优化的培养基相比，全优化培养基能明显提高生物量的积累和弹性蛋白酶的分泌；外加无机盐和表面活性剂、大分子聚合物影响着菌体生长和弹性蛋白酶合成，结果揭示钙离子能在一定程度上可以提高弹性蛋白酶活，但提高幅度不大；低浓度的Tween-80能显着改善酶的分泌和细胞生长，0.1％的SDS对细胞生长和弹性蛋白酶合成的影响是完全不一致的。高浓度的聚合物中只有0.1％的胶原蛋白能显着提高细胞的生长和弹性蛋白酶的积分泌，而其它聚合物对菌体生长和酶分泌存在一定的抑制或促进作用不明显；对两种培养基发酵生产弹性蛋白酶的发酵过程比较可以看出，全优化后的培养基无论是对细胞生长还是对弹性蛋白酶合成都有着明显的促进作用。浙江大学博士学位论文 (3)采用部分因子设计和中心组合设计对培养条件进行了筛选和优化，影响细胞生长和弹性蛋白酶产生的主要因子是培养时间和摇床转速，两个因子对弹性蛋白酶合成和细胞生长的影响是不一致的，并获得了摇瓶发酵下较优的发酵条件为:220r/min，25h，此时模型预测的最大响应值为434U/ml。探讨不同培养温度下细胞生长、底物消耗和产物合成发现，37℃下培养更有利于弹性蛋白酶合成，35℃下细胞的比生长速率要明显高于37℃ 添加弹性蛋白能明显提高生物量的积累，但对产物合成提高不明显。同时对不同添加时间进行了研究，发现所试验的两种时间下，弹性蛋白对弹性蛋白酶合成和细胞生长的调控效果是完全不同。 细胞生长过程中存在比较明显的波动现象。首先分析了玉米提取物对生长的影响，玉米提取物是细胞生长和弹性蛋白酶合成的必需因子，无论添加与否，菌体生长过程中都出现了比较明显的波动;摇瓶发酵和罐发酵的数据相结合探讨了菌体生长波动现象的原因。实验结果显示无论是采用摇瓶还是5一L罐作为发酵体系，细胞生长波动的本质并没有改变。SDS一PAGE分析了不同发酵条件和发酵方法下胞外蛋白质的变化，从电泳的蛋白质条带数量上似乎并不能很好解释细胞生长波动的原因。 (4)研究了芽抱杆菌EL3 14CFIO的分批发酵工艺和发酵动力学，芽抱杆菌EL3 14CF10生产弹性蛋白酶的发酵类型可能属于生长部分关联型。4%的葡萄糖浓度更有利于底物代谢，菌体生长速度要快，但最大生物量和弹性蛋白酶分泌水平没有7.4%的高，因此可以考虑在发酵过程中采取流加碳源来解除过高葡萄糖浓度对生长比速率抑制。 一定范围内提高搅拌转速能加快底物的转化和菌体的生成，有利于弹性蛋白酶的分泌，尤其是前期的通气量对发酵影响尤为显着。发酵中的溶解氧是指导发酵过程的一个非常重要参数，可以将它作为发酵放大的依据。 用Logistie方程、Leudeking一piret方程不[1 Leudeking一Piret一Like方程分别描述细胞生长、产物合成和弹性蛋白酶合成的动力学规律，动力学模型如下:击丁=0.44(1一云)x ‘召了丝一35150竺一45二dtdt一塑一3 .01竺十o.o6x dtdt浙江大学博士学位论文 对叁个动力学模型参数的检验结果也可以显示，所建立的菌体生长和底物消耗的动力学模型可以很好地解释实际发酵中细胞生长、底物代谢的过程。在转速400r/min，ZL/min通气量下发酵30小时弹性蛋白酶分泌水平达到近350U/ml。 (
参考文献：
[1]. 一株发酵液体石蜡菌株的生物学特性及产物初步研究[D]. 程永刚. 南京理工大学. 2004
[2]. 生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略[D]. 李旭. 哈尔滨工业大学. 2012
[3]. 生物破乳剂产生菌突变株的破乳性能及环境适应性的强化[D]. 刘畅. 哈尔滨工业大学. 2012
[4]. 高温菌的分离纯化及性质研究[D]. 韩波波. 华东师范大学. 2008
[5]. 拮抗放线菌对烟草黑胫病的控病研究[D]. 刘晓娇. 西南大学. 2011
[6]. 粉红粘帚霉IK726的诱变选育及其室内药效研究[D]. 宋维霞. 青岛科技大学. 2014
[7]. 驱油菌株筛选及其对原油与石蜡理化性质的影响及机理研究[D]. 张俊会. 西北农林科技大学. 2015
[8]. 脂肽生物表面活性剂的制备、理化性质和抑菌活性研究[D]. 陈云瑛. 中国海洋大学. 2008
[9]. 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究[D]. 张林达. 湖南大学. 2008
[10]. 弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究[D]. 陈启和. 浙江大学. 2003
标签：一般化学工业论文; 液体石蜡论文; 破乳剂论文; 真菌孢子论文; 细菌培养论文; 生物技术论文; 细菌结构论文; 对照实验论文; 烟草行业论文;