LncRNA n341773在HELF细胞表型转化中的作用及机制

论文摘要

研究目的:1、检测lnc RNA n341773在TGF-β1诱导的HELF细胞表型转化中表达的变化。2、探索上、下调lnc RNA n341773在HELF细胞表型转化中的作用。3、探索上、下调lnc RNA n341773调节HELF细胞表型转化的分子机制。研究方法:1、实验分为两组:Control组和TGF-β1组,TGF-β1组给予5ng/ml的TGF-β1,处理72h;Control组给予相同体积培养基。Western Blot检测α-SMA蛋白的表达,q RT-PCR检测lnc RNA n341773基因的表达。2、在HELF细胞表型转化模型的基础上,使用慢病毒干预lnc RNA n341773的表达。实验分为10组:空白对照组（Control）、干扰慢病毒空载体组（Lentivirus（GV493）-RNAi-NC）、干扰慢病毒组（Lentivirus（GV493）-RNAi-lnc RNA n341773）、过表达慢病毒空载组（Lentivirus（GV367）-oe-NC）、过表达慢病毒组（Lentivirus（GV367）-oe-lnc RNA n341773）、TGF-β1组、干扰慢病毒空载体（Lentivirus（GV493）-RNAi-NC）+TGF-β1组、干扰慢病毒（Lentivirus（GV493）-RNAi-lnc RNA n341773）+TGF-β1组、过表达慢病毒空载体（Lentivirus（GV367）-oe-NC）+TGF-β1组、过表达慢病毒（Lentivirus（GV367）-oe-lnc RNA n341773）+TGF-β1组。干扰慢病毒、过表达慢病毒及其各自的空载慢病毒分别转染HELF细胞,构建干扰lnc RNA n341773、过表达lnc RNA n341773细胞模型,5ng/ml的TGF-β1处理72h后收集细胞。3、q RT-PCR检测上述10组细胞中lnc RNA n341773的表达。4、Western Blot检测上述10组细胞中GAPDH、α-SMA、CollagenⅠ、PI3K、Akt、P-Akt（S473）、P-Akt（T308）、m TOR、P-m TOR（S2448）、PCNA、Cyclin B、Cyclin E蛋白的表达水平。5、Ed U实验检测上述10组细胞的增殖能力。6、细胞周期实验检测上述10组细胞的细胞周期分布情况。研究结果:1、Western Blot检测发现HELF细胞经TGF-β1（5ng/ml）处理72h后,α-SMA蛋白的表达明显增加,表明体外模型成功建立。q RT-PCR检测结果发现lnc RNA n341773在HELF细胞表型转化的模型中表达明显降低。2、q RT-PCR方法检测各组细胞内lnc RNA n341773的表达,结果显示过表达慢病毒组lnc RNA n341773的表达明显增加,干扰慢病毒组lnc RNA n341773的表达明显降低。过表达慢病毒空载体组及干扰慢病毒空载体组与空白对照组中lnc RNA n341773的表达无明显差异。过表达lnc RNA n341773能够逆转TGF-β1导致的lnc RNA n341773降低,而干扰lnc RNA n341773能够促进TGF-β1导致的lnc RNA n341773降低。3、Western Blot检测α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达水平的结果表明,经TGF-β1处理的HELF细胞中α-SMA、CollagenⅠ的表达明显增加,而过表达lnc RNA n341773能够抑制TGF-β1的促蛋白表达作用;干扰lnc RNA n341773能够扩大TGF-β1的促蛋白表达作用。表明:lnc RNA n341773在HELF细胞表型转化过程中发挥重要作用。4、Western Blot检测PI3K、Akt、P-Akt（S473）、P-Akt（T308）、m TOR、P-m TOR（S2448）蛋白表达水平。HELF细胞经TGF-β1诱导后,总蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达无明显改变,而磷酸化蛋白P-Akt（S473）、P-Akt（T308）、P-m TOR的表达明显增加,表明TGF-β1诱导的HELF细胞表型转化中PI3K/Akt/m TOR信号通路被激活。过表达lnc RNA n341773能够逆转TGF-β1的PI3K/Akt/m TOR信号通路激活作用,而干扰lnc RNA n341773能够促进TGF-β1的PI3K/Akt/m TOR信号通路激活作用。Ed U实验结果:TGF-β1处理的HELF细胞增殖能力增强,过表达lnc RNA n341773能够抑制TGF-β1的细胞增殖作用,干扰lnc RNA n341773能够促进TGF-β1的细胞增殖作用。随后用Western Blot进行蛋白水平的验证,检测PCNA蛋白表达水平。经TGF-β1处理的HELF细胞中PCNA的表达明显增加,过表达lnc RNA n341773能够抑制TGF-β1的促PCNA表达作用,而干扰lnc RNA n341773能够扩大TGF-β1的促PCNA表达作用。这与Ed U的结果一致。细胞周期检测结果:TGF-β1处理的HELF细胞G1/G0期细胞比例减少,S期及G2/M细胞比例增多;过表达lnc RNA n341773能够抑制TGF-β1的细胞周期作用,而干扰lnc n341773的表达能够促进TGF-β1的细胞周期作用。随后用Western Blot进行蛋白水平的验证,检测Cyclin B、Cyclin E蛋白的表达水平。经TGF-β1处理的HELF细胞中Cyclin E的表达明显增加,Cyclin B的表达明显降低;过表达lnc RNA n341773能够抑制TGF-β1的Cyclin E增加作用,同时增加Cyclin B的表达;干扰lnc RNA n341773能够加重TGF-β1的Cyclin E增加作用同时减少Cyclin B的表达。这与细胞周期的结果一致。以上结果提示:lnc RNA n341773通过调节PI3K/Akt/m TOR信号通路以及细胞增殖参与HELF细胞表型转化。研究结论:1、lnc RNA n341773在TGF-β1处理的HELF细胞中的表达降低。2、过表达lnc RNA n341773能够逆转TGF-β1诱导的HELF细胞表型转化,而干扰lnc RNA n341773能够促进TGF-β1诱导的HELF细胞表型转化。3、lnc RNA n341773能够通过调节PI3K/Akt/m TOR信号通路及细胞增殖参与HELF细胞表型转化。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 武丹

导师: 曾林祥

关键词: 肺纤维化,长链非编码,成纤维细胞,表型转化

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 南昌大学

分类号: R329.2

总页数: 59

文件大小: 2909K

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标签：肺纤维化论文;  长链非编码论文;  成纤维细胞论文;  表型转化论文;