肖滨[1]2004年在《心肌缺血预处理的抗血小板活化和内皮保护作用》文中研究说明目的：本研究旨在探讨心肌缺血预处理(IPC)对缺血-再灌注(I／R)期血小板活化、血管内血栓形成、血管内皮细胞功能和再灌注区域炎症反应的影响。 方法：40只成年新西兰大白兔随机分为对照组(C)和缺血预处理(IPC)组(n=20只／组)。所有动物麻醉后均经历冠状动脉前降支(LAD)阻断40分钟所至的心肌缺血和随后120分钟再灌注，IPC组在此之前先进行5分钟阻断和10分钟再通的预处理。分别在基础状态(B)、缺血前(pre-Occlusion)、缺血40分钟(Occ40min)、再灌注60分钟(Rep60min)和再灌注120分钟(Rep120min)抽血行全血红细胞、白细胞和血小板计数；测定血浆可溶性P-选择素(sP-selectin)、血栓烷B_2(TXB_2)和6-酮-前列腺素F_(1α)(6-keto-PGF_(1α))的浓度(n=12只／组)。通过颈总动脉—颈外静脉旁路法观测基础状态和Rep60min时的血栓湿重，测量结束即处死动物留取心脏标本作常规HE染色病理切片和血管内皮细胞P-选择素表达的免疫组化病理切片，以观察组织炎症反应程度和血管内皮细胞激活情况(n=8只／组)。 结果：(1)再灌注期，两组实验动物血浆sP-selectin、TXB_2浓度和血栓湿重与基础状态时相比均升高(P＜0.05)，组间比较为IPC组低于对照组，SP-selectin在Rep60min和Rep120min分别为50.2±10.8 vs 56.1±8.0(ng/mL，P＞0.05)、47.3±9.0 vs 55.3±8.1(ng／mL，P＜0.05)；TXB_2在Rep60min和Rep120min分别为319.1±65.7 vs 370.2±51.2和300.8±46.5 vs 353.0±47.8(pg／mL，P心肌缺血预处理的抗血小板活化和内皮保护作用中文摘要均<0.05);Rep6omin时血栓湿重为15.3士2.9 vs 17.9士2.6(mg，尸<0 .05)。(2)再灌注期，两组实验动物血浆6一keto一PGFI。浓度与基础状态时相比均降低(P<0.05)，组间比较为IPC组高于对照组，在Rep60min和Rep 1 Zomin时分别为2 1 .1士6.1 vs 1 5.5士2.4和20.8士3.6vs 1 3.6士2.4(pg/mL，P均<0.05)。免疫组化病理切片显示，IpC组实验动物血管内皮细胞P一选择素表达明显低于对照组。(3)再灌注期，两组实验动物全血白细胞(WBC)计数与基础状态时相比均升高 (P<0.05)，组间比较表现为IPC组缺血前有升高10.2士0.svs8.8士0.8(X 10垅P<0.05)，但在再灌注期保持较低水平，Rep60min和Rep 1 Zomin时分别为1 0.9士0.5 vs 1 1 .9士0.9、10.4士1.0 vs12.1士0.7(x 10泥P均<0.05)。HE染色病理切片显示IPc组实验动物心肌组织间隙基本上没有白细胞滞留和浸润。 结论:心肌缺血预处理可以有效抑止再灌注期血小板活化、限制血管内血栓形成，对病变区域能够保护血管内皮细胞功能和减轻白细胞的滞留与浸润。
李荣[2]2007年在《延胡索碱及延胡索复方抗冠心病室性心律失常的实验与临床研究》文中研究说明研究背景当今，冠心病已成为人类叁大死亡原因之一，我国冠心病的发病率正逐年上升。冠心病的基本病理生理就是心肌缺血，要挽救缺血心肌就必须及时、有效地恢复缺血心肌的再灌注。但是缺血心肌在恢复血流灌注后，往往引起缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion iniury，IRI)。如何防治心肌缺血再灌注损伤已成为心脏病学基础应用研究中的一个重要领域。1986年Murry等发现缺血预处理可减轻IRI，但由于缺血预处理本身是一种损伤性因素，很难在临床推广应用，因此寻找安全有效的药物作为药物预处理手段防治IRI具有重要的现实意义。1988年，美国着名的CAST试验结果表明：抗心律失常药物有潜在致心律失常作用的危险性。这种危险性给发展中药预处理防治IRI，特别是抗再灌注心律失常带来了机遇和挑战。近来在心血管疾病的防治研究中，特别是在治疗缺血性心脏病和抗心律失常方面，许多复方都选用了延胡索。延胡索是一种活血化瘀中药，现代药理研究表明，其具有增加冠脉流量、扩张血管、改善心肌营养性血流量及抗心律失常等作用。但是应用延胡索碱预处理抗心肌缺血再灌注损伤的实验研究及运用延胡索复方桃仁红花煎治疗冠心病室性心律失常的临床研究却未见报道。本课题即打算在此领域作些有益的探索。实验研究【目的】通过动物实验，比较药物预处理与缺血预处理对心肌缺血再灌注损伤的作用效果，评价延胡索碱预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其药理作用机制。【方法与内容】采用SD大鼠，随机分为6组：假手术组、模型组、缺血预处理组、延胡索碱低、中、高剂量组。建立大鼠心肌缺血再灌注模型，运用膜片钳技术、流式细胞仪技术、免疫组化、电镜酶细胞化学和分子生物学等方法，从整体、细胞乃至分子基因水平探讨延胡索碱预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其药理作用机制。实验共分为六个部分。实验一：观察延胡索碱预处理对大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影响。实验二：观察延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响。实验叁：观察延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌Ca~(2+)-ATPase及Na~+-K~+-ATPase活性的影响。实验四：观察延胡索碱预处理对单个心肌细胞膜上L-型钙通道动力学的影响。实验五：观察延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌细胞内游离Ca~(2+)浓度的影响。实验六：观察延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌梗死范围的影响。【结果】1．室性心律失常发生率比较：延胡索碱中、高剂量组的室速(VT)和室颤(VF)的发生率显着降低，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，延胡索碱低剂量组上述指标变化无统计学意义(P＞0.05)；与缺血预处理组比较，延胡索碱中、高剂量组的VT和VF的发生率变化无统计学意义(P＞0.05)。各组对室性早博(VPB)发生率的影响，差异无统计学意义(P＞0.05)。2．心律失常发生时间比较：延胡索碱低、中、高剂量组的心律失常出现时间明显推迟、持续时间明显缩短，与模型组比较差异有显着性(P＜0.01)。与缺血预处理组比较，延胡索碱预处理虽也能推迟心律失常出现时间、缩短心律失常持续时间，但作用较之减弱(P＜0.01)。3．ST段抬高程度比较：在心肌缺血30min，再灌注20min和60min时间点时，假手术组ST段抬高程度无明显改变，模型组ST段则明显抬高；与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱预处理各剂量组ST段抬高幅度虽有所降低，但差异无显着性(P＞0.05)。心率变化比较：与模型组比较，延胡索碱低、中、高剂量组，以及缺血预处理组均能明显减慢心率，差异有显着性(P＜0.01)；与缺血预处理组比较，延胡索低、中剂量组减慢心率的作用较之减弱(P＜0.01)，延胡索碱高剂量组则较之增强(P＜0.05)。4．原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠心肌细胞凋亡结果：假手术组心肌仅偶见细胞凋亡发生，模型组可见大量胞核呈深浅不一棕褐色的凋亡心肌细胞，心肌细胞凋亡指数明显高于假手术组(P＜0.01)；缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组凋亡心肌细胞和心肌细胞凋亡指数均较模型组明显减少(P＜0.01)；而缺血预处理组和延胡索碱高剂量组间差异无显着性(P＞0.05)。5．心肌细胞bcl-2基因蛋白表达变化：与假手术组比较，抑凋亡基因bcl-2在缺血再灌注后表达明显减少，心肌细胞bcl-2蛋白阳性表达指数(PEI)明显低于假手术组(P＜0.01)；缺血预处理及用药后bcl-2表达增高，缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组bcl-2蛋白阳性表达指数(PEI)均较模型组组明显增高(P＜0.05)。而缺血预处理组和延胡索碱高剂量组比较，差异无显着性(P＞0.05)。6．心肌细胞Fas基因蛋白表达变化：假手术组极少数心肌细胞Fas基因蛋白表达阳性；与假手术组比较，缺血再灌注后Fas基因蛋白表达明显加强，心肌细胞Fas蛋白阳性表达指数(PEI)明显高于假手术组(P＜0.01)；缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组Fas蛋白阳性表达指数(PEI)均较模型组明显减少(P＜0.05)；而缺血预处理组和延胡索碱高剂量组比较，差异无显着性(P＞0.05)。7．心肌细胞Na~+，K~+-ATP酶活力分析：与假手术组比较，心肌缺血再灌注损伤后，心肌细胞Na~+，K~+-ATP酶活力显着下降(P＜0.01)。与模型组比较，除低剂量组(P＞0.05)外，缺血预处理组和延胡索碱中、高剂量组的心肌细胞Na~+-K~+-ATP酶活力都明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；与缺血预处理组比较，延胡索碱中、高剂量组心肌细胞Na~+-K~+-ATP酶活力差异无显着性(P＞0.05)。8．心肌细胞Ca~(2+)-ATP酶活力分析：与假手术组比较，心肌缺血再灌注损伤后，心肌细胞Ca~(2+)-ATP酶活力显着下降(P＜0.01)。与模型组比较，除低、中剂量组(P＞0.05)外，缺血预处理组和延胡索碱高剂量组的心肌细胞Ca~(2+)-ATP酶活力都明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与缺血预处理组比较，延胡索碱高剂量组心肌细胞Ca~(2+)-ATP酶活力差异无显着性(P＞0.05)。9．单个心肌细胞膜上L-型钙通道动力学变化(1)L-型钙离子通道平均开放概率比较：与假手术组比较，模型组L-型钙离子通道平均开放概率明显提高(P＜0.01)；与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组心肌细胞的L-型钙离子通道平均开放概率明显降低(P＜0.01)；而且缺血预处理组与延胡索碱高、中、低剂量组比较，无统计学差异(P＜0.05)。(2)L-型钙离子通道平均开放时间比较：与假手术组比较，模型组心肌细胞L-型钙离子通道平均开放时间明显缩短(P＜0.05)；与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组平均开放时间无显着性差异(P＞0.05)。(3)L-型钙离子通道平均电流幅值比较：与假手术组比较，模型组平均电流幅值明显增高(P＜0.05)；与模型组比较，延胡索碱低、中剂量组可减弱L-型钙通道平均电流幅度值(P＜0.05)，但缺血预处理组和延胡索碱高剂量组反而增强L-型钙通道电流幅度值(P＜0.05)。10．心肌细胞内钙离子浓度比较：与假手术组比较，模型组心肌细胞内平均钙离子荧光强度明显增强(P＜0.01)；与模型组比较，缺血预处理组与延胡索碱高、中、低剂量组平均钙离子荧光强度减弱，差异有统计学意义(P＜0.01)；缺血预处理与延胡索碱高剂量组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。11．心肌缺血、梗死面积比较(1)心肌缺血面积比较：与模型组比较，除低剂量组(P＞0.05)外，其余各组心肌缺血面积均有减少(P＜0.01或P＜0.05)；与缺血预处理组比较，除低剂量组(P＜0.05)外，延胡索碱高、中剂量组心肌缺血面积与其相当，差异无显着性(P＞0.05)。(2)心肌梗死面积比较：与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱高、中、低剂量组梗死面积均缩小(P＜0.05)；与缺血预处理组比较，除低剂量组(P＜0.01)外，延胡索碱高、中剂量组心肌梗死面积与其相当，差异无显着性(P＞0.05)。【结论】1．对大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常而言，延胡索碱预处理不仅可推迟其出现时间，缩短其持续时间，而且还可降低室速(VT)和室颤(VF)的发生率，减慢大鼠心肌缺血再灌注损伤后心率的增快。说明延胡索碱预处理具有抗大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的作用。2．延胡索碱预处理可通过上调缺血再灌注心肌抑凋亡基因bcl-2的蛋白表达和下调促凋亡基因Fas的蛋白表达，从而抑制心肌细胞凋亡的发生，保护心肌细胞免受缺血及缺血再灌注的损伤，从而保护心脏功能，具有类似于缺血预处理的内源性抗凋亡保护机制。3．延胡索碱预处理能显着提高心肌细胞Na~+-K~+-ATPase、Ca~(2+)-ATPase活性，通过肌浆网Ca~(2+)-ATP酶(肌浆网钙泵)、Na~+-Ca~(2+)交换体系、肌膜Ca~(2+)-ATPas等途径将细胞内Ca~(2+)运出细胞外，从而减轻心肌细胞内钙离子浓度和钙超载，起到保护心肌细胞的作用。4．延胡索碱预处理可降低心肌细胞膜上L-型钙通道平均开放概率，并显着减弱心肌细胞膜上L-型钙通道平均电流幅度值，从而阻断心肌细胞膜L-型钙通道开放，减少“外钙内流”、“内钙释放”，降低心肌细胞内游离钙离子的浓度，避免了细胞内钙离子超载，发挥保护心肌细胞的作用。5．延胡索碱预处理与经典缺血预处理一样，可显着缩小大鼠心肌缺血再灌注的心肌梗死面积，对缺血再灌注心肌损伤有保护作用。临床研究【目的】观察延胡索复方桃仁红花煎对冠心病频发室性早博患者的临床疗效。【方法与内容】采用前瞻性试验性设计方案。遵循随机、对照、单盲原则进行研究。将60例冠心病频发室性早博患者按为1∶1随机分为试验组与对照组。试验组采用冠心病西医基础治疗加上延胡索复方桃仁红花煎治疗，对照组仅采用单纯西医基础治疗，不用中医中药治疗。通过观察治疗前后室性早博次数的变化以及中医证候、症状的改变，比较试验组与对照组二者间的临床疗效。【结果】1．治疗后两组患者室性早搏疗效比较：试验组总有效率85％，对照组75％，P＞0.05，差异无统计学意义，说明两组患者的疗效相当。2．两组患者治疗前后24h室性早博次数的比较：试验组和对照组治疗前后自身比较，P＜0.01，差异有显着统计学意义。两组患者治疗前后24h室性早博次数差值比较，P＞0.05，差异无统计学意义。3．两组患者中医证候疗效比较：试验组总有效率90％，对照组70％，经X~2检验P＜0.05，差异有统计学意义。4．两组患者中医症状积分比较：治疗前后自身比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。试验组患者治疗前后症状积分差值明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。5．两组患者中医症状疗效比较：试验组心悸中医症状总有效率为89.7％，对照组为66.7％，两组差异有统计学意义(P＜0.05)；试验组胸闷中医症状总有效率为76.9％％，对照组为45.8％，两组差异有统计学意义(P＜0.05)；余各中医症状疗效差异无统计学意义(P＞0.05)。【结论】通过临床小样本观察，我们发现西医基础治疗结合中药延胡索复方(桃仁红花煎)治疗，在减少冠心病频发室性早搏次数方面与单纯西药治疗疗效相当；但是在改善冠心病频发室性早搏的中医证候及中医症状特别是心悸、胸闷等方面疗效优于单纯西药治疗，而且副作用少，没发现有任何致心律失常作用，值得在临床上推广应用。结语1．延胡索碱预处理不仅可推迟大鼠心肌缺血再灌注室性心律失出现时间，缩短其持续时间，而且还可降低室速(VT)和室颤(VF)的发生率，减慢大鼠再灌注损伤后心率的增快。说明延胡索碱预处理有抗大鼠心肌缺血再灌注室性心律失常的作用。2．延胡索碱预处理可通过上调缺血再灌注心肌抑凋亡基因bcl-2的蛋白表达和下调促凋亡基因Fas的蛋白表达，从而抑制心肌细胞凋亡的发生，保护心肌细胞免受缺血及缺血再灌注的损伤，具有类似于缺血预处理的内源性抗凋亡保护机制。3．延胡索碱预处理能显着提高心肌细胞Na~+-K~(+-)ATPase、Ca~(2+)-ATPase活性，通过肌浆网Ca~(2+)-ATP酶(肌浆网钙泵)、Na~+-Ca~(2+)交换体系、肌膜Ca~(2+)-ATPas等途径将细胞内Ca~(2+)运出细胞外，从而减轻心肌细胞内钙浓度和钙超载，起到保护心肌细胞的作用。4．延胡索碱预处理可降低心肌细胞膜上L-型钙通道平均开放概率和平均电流幅值，从而阻断心肌细胞膜L-型钙通道，减少“外钙内流”、“内钙释放”，降低心肌细胞内钙离子的浓度，避免了细胞内钙离子超载，起到保护心肌细胞的作用。5．延胡索碱预处理与经典缺血预处理一样，可显着缩小心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌梗死面积，对缺血再灌注损伤心肌有保护作用。6．通过临床观察，我们发现西医基础治疗结合延胡索复方(桃仁红花煎)治疗，在减少冠心病频发室性早搏次数、抗冠心病心律失常方面与单纯西药治疗疗效相当；但是在改善冠心病频发室性早搏的中医证候及中医症状特别是心悸、胸闷等方面疗效优于单纯西药治疗，而且副作用少，没发现有任何致心律失常作用，值得在临床上推广应用。
吴灵振[3]2014年在《Adropin通过RISK通路减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤及其与临床冠状动脉粥样硬化的相关性研究》文中认为目的：心肌再灌注损伤严重削弱再灌注治疗效果，缺血后处理以及模拟缺血后处理的药物后处理通过激活再灌注损伤挽救激酶(RISK)通路以及生存活化因子增强(SAFE)通路减轻心肌再灌注损伤。Adropin是新发现的内源性生物活性物质，具有激活RISK通路保护血管内皮的作用，尚不清楚Adropin是否具有心脏保护作用。本研究探讨Adropin后处理能否减轻心肌再灌注损伤，以及是否通过激活RISK或SAFE通路发挥心肌保护作用。方法：使用20周龄C57BL/6J野生型小鼠，建立心肌缺血/再灌注损伤模型，分为8组：除Sham组外，其余各组通过结扎左冠状动脉诱导心肌缺血(I)45min，随后松开结扎进行再灌注(R)4h：1)Sham组：只穿线不结扎，心肌无缺血，持续灌注；2)I/R组：I45min/R4h；3)Adropin低剂量组(Adropin-L组)：给予Adropin0.1mg/kg；4) Adropin中剂量组(Adropin-M组）：给予Adropin0.2mg/kg；5) Adropin高剂量组(Adropin-H组)：给予Adropin0.4mg/kg；6)缺血后处理组（I-PostC组）：持续再灌注前给予3次短暂的10s R/10s I处理；7)Adropin+LY294002组：给予Adropin0.2mg/kg，且于缺血前15min腹腔注射PI3K特异性抑制剂LY294002(40mg/kg)；8) Adropin+PD98059组：给予Adropin0.2mg/kg，且于缺血前15min腹腔注射ERK1/2特异性抑制剂PD98059(1mg/kg)。各组Adropin均于再灌注前5min经颈静脉给药。另外，使用Akt1+/-小鼠及同窝对照Akt1+/+小鼠，分为叁组（n=4–6）：I/R组（Akt1+/+小鼠I45min/R4h）、Akt1+/+组（Akt1+/+小鼠给予Adropin0.2mg/kg），及Akt1+/-组（Akt1+/-小鼠给予Adropin0.2mg/kg）。以上各组部分小鼠（n=3–6）R4h后，取心脏组织TTC染色法测心肌梗死面积，免疫组化检测心肌活化Caspase-3蛋白水平；各组其余小鼠（n=3–6）I45min/R7min后，Western blot检测Akt、ERK1/2及GSK3β蛋白表达水平，Real-time PCR检测Bcl-2、Bax基因表达水平。结果：与I/R组相比（45.8±5.1%），小剂量Adropin（Adropin-L组）未能缩小心肌梗死面积（40.2±5.8%），中等剂量Adropin（Adropin-M组）显着缩小梗死面积（30.5±5.2%），并与缺血后处理组梗死面积相当（29.5±13%），进一步增加剂量（Adropin-H组）梗死面积进一步缩小（29.9±6.3%），但与中等剂量组比较无差异。与I/R组对比，Adropin-M组磷酸化Akt/总Akt比值（1.02±0.08vs.2.03±0.28，P<0.05）、磷酸化ERK1/2/总ERK1/2比值（1.24±0.26vs.2.27±0.37， P<0.05）、磷酸化GSK3β/总GSK3β比值(0.51±0.11vs.1.40±0.21, P<0.05)以及Bcl-2/Bax比值（0.35±0.05vs.1.66±0.20， P<0.001）水平均显着升高。与I/R组对比，只有I-PostC组磷酸化STAT3水平升高(1.08±0.16vs.2.24±0.23, P<0.05)，Adropin-M等组磷酸STAT3水平不升高。LY294002或者PD98059抑制上述信号蛋白的磷酸化及抗凋亡蛋白的表达，同时，抑制了Adropin缩小心梗面积(41.1±5.2%，42.3±4.2%vs. Adropin30.5±5.2%，P<0.001)及减轻心肌细胞凋亡的作用。与同窝对照Akt1+/+小鼠I/R组对比，Adropin后处理使心梗面积显着下降（46.63±4.84%vs.31.23±4.65%，P<0.05），同时p-Akt表达增强，而Akt基因部分敲除（Akt1+/-组）p-Akt表达减弱且消除了Adropin缩小心梗面积作用（44.83±3.92%）。结论：Adropin可以减轻心肌缺血/再灌注损伤，且具有剂量依赖效应，其通过RISK信号通路而非SAFE通路发挥保护心脏的作用。目的：再灌注治疗是急性心肌梗死的主要治疗手段，然而再灌注损伤严重影响心梗治疗效果。药物后处理可以模拟缺血后处理，具有减轻心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）的作用。Adropin是新发现的分泌型生物多肽，具有激活再灌注损伤挽救激酶（RISK）通路起到保护血管内皮的作用，目前尚不清楚Adropin对缺血再灌注诱导的心肌细胞损伤的影响。本研究旨在探讨Adropin对心肌细胞模拟心肌缺血/再灌注损伤（SI/R）的影响及信号调节机制。方法：建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，分为11组，除Control组外，其余各组缺氧24h，复氧12h：(1)Control组：心肌细胞在正常条件下培养；(2) SI/R组：除缺氧/复氧外，无其他处理；(3) Adropin低剂量组(Adropin-L组)：给予Adropin10ng/ml；(4) Adropin中剂量组(Adropin-M组）：给予Adropin25ng/ml；(5) Adropin高剂量组(Adropin-H组)：给予Adropin50ng/ml；(6)LY294002组：缺氧前培养基内加入PI3K特异性抑制剂LY294002(40μmmol/L)；(7)Adropin+LY294002组： Adropin25ng/ml，且缺氧前加入LY294002(40μmmol/L)；(8)PD98059组：缺氧前培养基内加入ERK1/2特异性抑制剂PD98059(25μmmol/L)；(9)Adropin+PD98059组：Adropin25ng/ml，且缺氧前加入PD98059(25μmmol/L)；(10)AG490组：缺氧前培养基内加入JAK2抑制剂AG490(100μmol/L)；(11)Adropin+AG490组：Adropin25ng/ml，且缺氧前加入AG490(100μmol/L)。各组Adropin均于复氧即刻加入培养基中，给药浓度为培养基终浓度。 MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞早期凋亡，比色法检测细胞Caspase-3水平，ELISA法检测细胞CK-MB、TNFα、IL-10、MDA及SOD水平，Western blot检测Akt、ERK1/2、GSK3β以及Bcl-2/Bax蛋白表达水平。结果：与SI/R组（55.91±4.74%）相比，Adropin-L组未能提高细胞存活率（57.04±4.15%），Adropin-M组显着提高细胞存活率（71.10±3.45%），进一步增加剂量（Adropin-H组）细胞存活率进一步增加（74.38±3.94%），但与中等剂量组比较无显着差异。与SI/R组对比，Adropin-M组减少了心肌细胞早期凋亡（35.96±2.52%vs.21.88±2.43%，P<0.001），降低了细胞凋亡关键酶Caspase-3活性水平（150.26±4.45%vs.118.25±2.66%，P<0.001），促进了抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制了促凋亡蛋白Bax的表达，表现为Bcl-2/Bax比值增加（0.71±0.20vs.2.34±0.19，P<0.001）。机制研究结果显示：与SI/R组对比，Adropin组磷酸化Akt/总Akt（1.03±0.12vs.2.12±0.22，P<0.05）、磷酸化ERK1/2/总ERK1/2（0.71±0.16vs.1.23±0.19，P<0.05）以及磷酸化GSK3β/总GSK3β (1.03±0.16vs.2.23±0.19，P<0.05)水平显着升高；而LY294002或者PD98059均可抑制上述蛋白的磷酸化，同时减弱了Adropin提高细胞存活率、减轻心肌细胞早期凋亡及降低Caspase-3活性的保护作用。与Control组对比，JAK2激酶抑制剂AG490组显着抑制了STAT3的磷酸化（1.00±0.13vs.0.43±0.18，P<0.05），然而Adropin组与Control组之间磷酸化STAT3/总STAT3水平无明显差异（P>0.05），AG490未能显着抑制Adropin提高细胞存活率、减少细胞早期凋亡的心肌保护作用。结论：Adropin通过RISK信号通路（PI3K/Akt以及ERK1/2）而非SAFE通路（JAK2-STAT3）抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤，表明Adropin可能是一种具有潜在抗MIRI的保护药物。目的：糖尿病增加动脉粥样硬化的发生风险及严重程度。Adropin是新发现的内源性生物活性物质，参与调节能量稳态并具有保护血管内皮的作用。本研究探讨2型糖尿病及非糖尿病患者中，血清Adropin水平与冠脉造影动脉粥样硬化病变严重程度的关系。方法:入选392例胸痛疑诊冠心病并于我院进行冠脉造影的患者，患者分成两组：2型糖尿病组（n=241）与非糖尿病组（n=151），并根据Adropin浓度的四分位分为四组(第一四分位组：<3.89ng/ml；第二四分位组：3.89-4.85ng/ml；第叁四分位组：4.85-6.10ng/ml；第四四分位组：>6.10ng/ml；n=98)。抽取患者空腹血样采用自动生化分析仪、酶联免疫吸附法检测相关指标。采用Gensini、Friesinger以及SYNTAX评分评估冠脉造影动脉粥样硬化的病变程度。结果:与非糖尿病患者相比，糖尿病患者血清Adropin水平更低，Gensini、Friesinger及SYNTAX冠脉造影病变评分更高（P<0.001）。所有患者中，血清Adropin水平分别与Gensini、Friesinger及SYNTAX评分成负相关(rs值分别为-0.389，-0.390，-0.386，所有P<0.001)。无论是糖尿病组（OR0.66，95%CI0.53–0.83； P<0.001），还是非糖尿病组（OR0.51，95%CI0.35–0.74；P <0.001），低血清水平Adropin均是临床显着冠状动脉粥样硬化病变（SYNTAX评分>11)的独立危险因素。结论:2型糖尿病患者血清Adropin水平显着低于非糖尿病患者，血清Adropin水平与冠状动脉粥样硬化严重程度显着负相关。Adropin有望成为一种新型冠状动脉粥样硬化的预测因子或为预防动脉粥样硬化心血管疾病的防治靶点。
贾俊海[4]2008年在《预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响》文中指出目的:本实验旨在探讨糖尿病心肌缺血再灌注损伤的发生机理,观察药物预处理和缺血预处理对糖尿病性心脏的保护作用并探讨临床价值。方法:(1)制作糖尿病模型和在体心肌缺血再灌注模型。将大鼠随机分为四组:非糖尿病假手术(C_(sham))组,非糖尿病心肌缺血再灌注(C_(IR))组,糖尿病假手术(D_(sham))组和糖尿病心肌缺血再灌注(D_(IR))组。进行血糖、血脂、血流动力学、心肌梗死范围和心室/体重指数测定,HE染色观察各组形态学变化。(2)检测C_(sham)组、C_(IR)组、D_(sham)组和D_(IR)组血清、心肌丙二醛(MDA)含量、超氧化物酶(SOD)和谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-P_X)活性;检测血清、心肌一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性;检测心肌线粒体Na~+,K~+-ATP酶、Mg~(2+)-ATP酶、Ca~(2+)-ATP酶活性;放射免疫法检测血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)和血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平;免疫组织化学法检测心肌细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达;Western blot检测心肌RhoA和ROCK蛋白表达。(3)用维生素E预处理,检测C_(IR)组、D_(IR)组、非糖尿病维生素E(C_(VE))组、糖尿病维生素E(D_(VE))组血清、心肌MDA含量、SOD和GSH-P_X活性;检测心肌线粒体ATP酶活性;检测心肌ICAM-1蛋白表达;测定心肌梗死范围。(4)用灯盏花素预处理,检测C_(IR)组、D_(IR)组、非糖尿病灯盏花素(C_(Bre))组、糖尿病灯盏花素(D_(Bre))组血浆AngⅡ、ALD和血清IGF-1水平;检测血清、心肌MDA含量、SOD和GSH-P_X活性;检测心肌线粒体ATP酶活性;检测心肌ICAM-1蛋白表达;测定心肌梗死范围。(5)在缺血再灌注前进行缺血预处理,检测C_(IR)组、D_(IR)组、非糖尿病缺血预处理(C_(IP))组、糖尿病缺血预处理(D_(IP))组血清、心肌MDA含量、SOD和GSH-P_X活性;检测血清、心肌NO含量及血清、心肌NOS活性;检测心肌线粒体ATP酶活性;检测心肌MMP-2、RhoA和ROCK蛋白表达;进行心肌梗死范围测定;HE染色观察各组形态学变化。结果:(1)糖尿病大鼠血糖水平显着高于非糖尿病对应组(p<0.001);而体重显着轻于非糖尿病对应组(p<0.01);缺血期和再灌注期,各组间的心率、左心室收缩压、左心室舒张末压不存在显着差异;C_(IR)组较C_(sham)组心肌梗死面积增加(P<0.01);D_(IR)组较D_(sham)组心肌梗死面积增加(P<0.05);与C_(IR)组比较,D_(IR)组心肌梗死面积和心室重/体重比增加(P<0.001);与C_(sham)组比较,D_(sham)组心肌梗死面积和心室重/体重比增加(P<0.001),HE染色显示:糖尿病经历心肌缺血再灌注后,心肌损害加重。(2)与C_(IR)组相比,D_(IR)组血清和心肌MDA含量明显升高(P<0.05);血清IGF-1含量明显降低(P<0.05);心肌线粒体Na~+,K~+-ATP酶活性明显降低(P<0.05);血清NO明显升高(P<0.01),心肌NO明显升高(P<0.05);心肌NOS明显升高(P<0.01);心肌ICAM-1表达明显升高(P<0.001);心肌MMP-2、RhoA和ROCK蛋白表达明显升高(P<0.05)。(3)糖尿病大鼠用维生素E预处理后,与D_(IR)组相比,D_(VE)组血清、心肌MDA含量明显降低(P<0.05),血清SOD活性明显升高(P<0.01),心肌SOD活性明显升高(P<0.05),血清和心肌GSH-P_X活性明显升高(P<0.05);心肌线粒体Na~+,K~+-ATP酶、Mg~(2+)-ATP酶、Ca~(2+)-ATP酶活性明显升高(P<0.05);心肌ICAM-1蛋白表达显着降低(P<0.05);心肌梗死面积有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。(4)糖尿病大鼠用灯盏花素预处理后,与D_(IR)组相比,D_(Bre)组血浆AngⅡ浓度明显降低(P<0.05),血浆ALD浓度明显降低(P<0.01),血清IGF-1含量明显升高(P<0.05);血清、心肌MDA含量明显降低(P<0.05),血清SOD活性明显升高(P<0.001),心肌SOD活性明显升高(P<0.05),血清和心肌GSH-PX活性明显升高(P<0.05);心肌线粒体Na~+,K~+-ATP酶、Ca~(2+)-ATP酶活性明显升高(P<0.05),Mg~(2+)-ATP酶活性明显升高(P<0.01);心肌ICAM-1蛋白表达显着降低(P<0.05);心肌梗死面积有所降低,但无统计学意义(P>0.05)。(5)对糖尿病大鼠进行心肌缺血预处理后,与D_(IR)组相比,D_(IP)组血清、心肌MDA含量明显降低(P<0.05),血清SOD活性明显升高(P<0.001),心肌SOD活性明显升高(P<0.05),血清、心肌GSH-P_X活性明显升高(P<0.05);心肌线粒体Na~+,K~+-ATP酶活性明显升高(P<0.05),Mg~(2+)-ATP酶活性明显升高(P<0.01);血清和心肌NO含量明显降低(P<0.05),血清NOS活性明显降低(P<0.01),心肌NOS活性明显降低(P<0.05);心肌MMP-2、RhoA和ROCK蛋白表达显着降低(P<0.05);心肌梗死范围降低(P<0.05)。结论(1)早期糖尿病可加重心肌缺血再灌注损伤。(2)糖尿病参与心肌缺血再灌注损伤可能与增加MDA和NO含量、增加NOS活性、增加心肌ICAM-1、MMP-2、RhoA和ROCK蛋白表达、降低Na~+,K~+-ATP酶活性、下调IGF-1浓度有关。(3)维生素可通过减轻脂质过氧化和自由基损伤,下调ICAM-1蛋白表达,拮抗糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤。(4)灯盏花素可通过减轻脂质过氧化和自由基损伤,减低血浆AngⅡ、ALD浓度,增加血清IGF-1浓度,下调ICAM-1蛋白表达,减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤。(5)缺血预处理可减轻早期糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤,可能与减轻脂质过氧化和自由基损伤,增加Na~+,K~+-ATP酶、Mg~(2+)-ATP酶活性、下调MMP-2、RhoA和ROCK蛋白表达、降低心肌梗死范围等有关。
任丽洁[5]2018年在《Humanin衍生物HNG抗血小板抗血栓作用及机制的研究》文中研究说明研究背景:心脑血管疾病是人类致死和致残的主要原因之一。尽管人们在心血管疾病的诊断和治疗方面已做了坚持不懈的努力,但由于对发病机制认识的局限性,对心脑血管疾病的早期诊断、有效治疗和预防控制尚不满意。血栓在心血管疾病的发病机制中十分重要,是导致心肌梗塞和缺血性卒中的主要因素。血小板活化在血栓形成中发挥至关重要的作用。因此,研究抗血小板药物及其作用机制,有助于防治心脑血管疾病、降低发病率和死亡率、改善人民健康和生活质量。Humanin是一种具有抗凋亡作用的神经肽,其高效突变衍生物S14G humanin(HNG)的抗凋亡活性比HN高1000倍,不仅能阻断致阿尔茨海默病(FAD)因子-β淀粉样肽(Aβ)引起的细胞死亡,而且对缺血性卒中、心肌缺血再灌注损伤、动脉粥样硬化均有保护作用。血小板参与上述疾病的发病过程,提示HNG也可能通过影响血小板参与这些疾病。因此,本课题探讨HNG对血小板活化,动脉血栓形成和器官损伤后血栓炎症的作用及机制。研究目的:探究HNG是否影响血小板活化及其作用靶点,是否影响血栓形成和器官损伤导致的血栓性炎症。研究方法:1、研究HNG对血小板活化的影响。(1)血小板聚集实验:用HNG或对照溶剂预处理胶过滤分离的人血小板10分钟,然后在血小板聚集仪中,用血小板激动剂(包括胶原,CRP,凝血酶,AYPGQV或ADP)刺激5分钟,分别得到血小板聚集曲线。(2)血小板颗粒释放:取人胶过滤血小板,用HNG或对照溶剂预处理10分钟后,用血小板聚集仪检测ATP释放(致密颗粒释放);用流式细胞仪检测血小板表面P-selectin的表达(α颗粒释放)。(3)血小板内向外和外向内信号通路:取人胶过滤血小板,用HNG或对照溶剂预处理10分钟后,分别检测:内向外信号通路,利用流式细胞仪检测血小板表面整合素αIIbβ3的活化。外向内信号通路,活化的血小板整合素αIIbβ3触发血小板外部信号传导,包括血栓稳定所必需的激酶级联反应和细胞骨架重组。为了评估HNG是否影响血小板外向内信号,将预处理的血小板在固定的纤维蛋白原上铺展和粘附,一定时间后用细胞骨架染料鬼笔环肽染色,计算血小板铺展后的面积。(4)血小板信号分子磷酸化:利用免疫印迹Western blot方法检测了HNG预处理后血小板内信号分子的磷酸化水平的变化。2、研究HNG对血栓形成的影响以及出血倾向。为了探索HNG对血栓形成和稳定的影响,我们将从体外和体内两方面入手,体外通过流体小室(flow chamber),体内通过颈动脉损伤血栓模型来检测HNG在血栓形成中的作用。(1)流体小室实验(Flow chamber):本实验使用的仪器是BioFlux200系统。BioFlux孔板通道先用200μg/ml的Ⅰ型胶原蛋白包被1小时。取柠檬酸钠抗凝的人全血,并用荧光剂Calcein-AM标记,在10dyn/cm~2的剪切应力下使血小板在胶原包被的表面上流动,用倒置荧光显微镜记录血小板在孔板通道中的聚集反应。(2)氯化铁诱导颈动脉损伤模型:本研究将利用氯化铁诱导颈动脉损伤模型观察HNG预处理后大动脉的血栓形成。方法:钝性剥离小鼠的左颈动脉,7.5%FeCl3浸泡2分钟。用Visual Sonics View 2100超声仪的多普勒模式探测器记录动脉血流30分钟,观察损伤30分钟内血管有无阻塞和初次阻塞所需时间。本实验的动脉损伤模型比较简单,但是每只小鼠的个体差异都是一个陷阱。所以,要使用相对大量的小鼠,每组至少10只小鼠。(3)对生理止血的影响:剪尾出血实验:麻醉小鼠后,剪掉5mm尾巴,立即放入37℃生理盐水中,观察其尾部出血时间,记录第一次出血时间以及再次出血时间及其间隔。HNG给药组和对照组小鼠每组至少10只。3、检测HNG在心肌缺血再灌注(I/R)诱导的血栓炎症中的作用:越来越多的实验证据表明,血小板是免疫细胞库的一部分,特别是血小板和白细胞之间的相互结合影响着炎症组织的损伤程度,成为免疫反应的共同特征。本课题研究了HNG对心肌缺血再灌注后血栓炎症的影响。(1)小鼠心肌缺血再灌注损伤模型:手术前1小时腹腔注射HNG(0.2mg/kg)或生理盐水对照,然后进行心肌缺血手术以及假手术(sham)对照组,缺血45分钟后再灌注10分钟或2小时,取全血和心脏,进行后续试验检测,其中,使用伊万斯蓝Evans Blue和TTC染色确定心脏梗死面积。心肌未染蓝色区域(危险区域,AAR),心肌Evans Blue染蓝色区域(非危险区域,ANAR),TTC染色区域(红色)以及TTC未染色区域(梗死区域IA,白色)均使用Image J软件进行分析处理。心肌梗死面积用梗死区域与危险区域(AAR)的百分比(IA/AAR)来表示,而AAR面积则通过AAR与左心室总面积(AAR/AAR+ANAR)之间的比例来表示。(2)HNG对心肌缺血再灌注诱导的血栓炎症的影响:本课题利用流式细胞仪分别检测心肌缺血再灌注后,HNG对小鼠体循环血液中血小板P-selectin表达,活性氧ROS的产生以及血小板-白细胞聚集体的影响。4、评估HNG在血小板上的作用靶点:(1)筛选HNG在血小板上的靶点:本课题使用亲和素-抗亲和素纯化的方法将血小板上可能与HNG结合的蛋白筛选出来,然后进行质谱分析鉴定HNG的潜在靶点,并对质谱结果进行KEGG通路富集分析、GO功能分析和蛋白相互作用(PPI分析)等生物信息学分析。(2)分子对接:HNG(2GD3)的蛋白质结构模型由RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)下载。人β1微管蛋白结构由ModBase server人β2微管蛋白晶体结构(RCSB PDB:4I4T)同源重构得到。HNG-tubulinβ1结合用ZDOCK(http://zdock.umassmed.edu/)软件完成,并通过FiberDock评分(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FiberDock/)。(3)免疫沉淀和免疫荧光实验评估HNG能否通过靶向微管蛋白β1-tubulin发挥稳定血小板微管的作用:亲和纯化和免疫印迹实验:将生物素标记的HNG与血小板裂解液孵育后,用抗生物素的琼脂糖纯化与HNG结合的蛋白,做免疫印迹实验,用微管蛋白β-tubulin杂交。免疫荧光实验:胶过滤的血小板与HNG孵育后,然后用β1-tubulin抗体进行染色,并使用激光共聚焦拍照,观察HNG与β1-tubulin的共定位。微管解聚测定:将HNG预处理的血小板与微管解聚药,诺考达唑,在37℃下孵育。或者,在固定之前使血小板粘附于纤维蛋白原包被的载玻片。使用抗β1-微管蛋白和抗乙酰化微管蛋白的抗体染色,观察微管解聚情况。研究结果:1、HNG抑制血小板活化。(1)HNG抑制血小板聚集:为了确定HNG对血小板功能的影响,将分离的人血小板与HNG或对照溶剂预孵育,并用胶原,convulxin,凝血酶和AYPGQV等激动剂刺激血小板。结果显示:HNG剂量依赖性地抑制胶原引起的血小板聚集,在10μM时聚集减少58%(P<0.01,每组n=8)。HNG也抑制由convulxin(P<0.01),ADPAYPGQV(P<0.05)和凝血酶(P<0.05)引起的血小板聚集。(2)HNG抑制血小板P-选择素表达和ATP分泌:血小板激活导致以表面P-选择蛋白表达为特征的α-颗粒的胞吐作用。流式实验结果显示,HNG显着抑制了convulxin诱导的P-选择素表达增加(P<0.01)。此外,我们还评估了血小板致密颗粒中ATP的释放,与对照组相比,HNG处理血小板后能显着降低胶原和convulxin诱导的ATP释放(分别是P<0.05和P<0.01)(3)HNG抑制血小板整合素αIIbβ3活化以及在纤维蛋白原上的铺展:流式细胞术实验结果显示与scramble-HNG组及溶剂对照组相比,HNG显着降低了蛇毒convulxin和CRP诱导的血小板表面纤维蛋白原水平,即整合素αIIbβ3的活化(P<0.05)。血小板铺展实验结果显示与HNG孵育后也能显着降低血小板的铺展面积(P<0.05)。(4)HNG抑制血小板中Akt/Erk1/2信号传导:由于HNG能够抑制由不同激动剂诱导的血小板聚集,因此我们探讨了其抗血小板的细胞内激酶信号传导。免疫印迹实验结果显示,HNG能显着降低由胶原诱导的Akt和Erk1/2的磷酸化水平。同时HNG能轻度降低p38MAPK的磷酸化,但是没有统计学意义。2、HNG发挥抗血栓作用且在有效作用剂量是不增加出血风险的。(1)HNG抑制在流动条件下胶原蛋白上的血小板粘附:流动小室实验显示HNG显着降低胶原表面的血小板粘附(P<0.01)。(2)HNG抑制体内血栓形成:我们检测了HNG在小鼠颈动脉损伤模型中的抗血栓作用。颈动脉血流的超声观察显示小鼠腹腔注射HNG(25μg/kg,n=13)后,能够延长初始血栓的闭塞时间(P<0.05)。(3)HNG不增加出血风险:为了确定HNG对止血的作用,我们进行了小鼠尾部出血和颈静脉出血测定。与对照组相比,HNG处理组小鼠的出血时间并没有明显延长。3、HNG能降低心肌缺血再灌注小鼠的血栓性炎症损伤。(1)TTC染色发现HNG降低了小鼠I/R后心脏的梗塞面积(P<0.05)。(2)利用流式细胞术实验发现,HNG减弱了I/R损伤后的血栓炎症。HNG能降低心肌I/R后引起的循环血小板P-选择素表达(P<0.01),活性氧ROS产生(P<0.01)和血小板-白细胞聚集物增加(P<0.05)。4、HNG可能与血小板β1-微管蛋白结合并稳定血小板微管。(1)质谱:我们使用生物素-抗生物素蛋白亲和纯化实验从人血小板中提取出HNG潜在的结合蛋白,并进行银染、切胶、质谱分析,发现了几种与HNG结合可能性较大的蛋白,包括在血小板功能和AZD中都发挥重要作用的β1-微管蛋白。(2)分子对接揭示HNG与β1-微管蛋白结合,并且结合位点与现有的微管稳定剂紫杉酚结合位点不同。(3)使用生物素-抗生物素蛋白亲和纯化从人血小板中取出HNG结合蛋白,并且使用免疫共沉淀western印迹发现HNG与β1-微管蛋白结合。(4)通过共聚焦免疫荧光染色观察到在血小板中β1微管蛋白与HNG存在共定位。(5)HNG抑制血纤维蛋白原刺激的血小板微管解聚或微管去稳定剂诺考达唑处理引起的微管解聚。研究结论:1、HNG抑制血小板活化和血栓形成,且无明显出血倾向。2、HNG的作用机制可能是稳定微管,其抑制血小板活化的其中一个靶点可能是β1-微管蛋白。3、HNG可能通过抑制血小板活化来抑制血栓炎症发挥心肌缺血的保护作用。4、这些发现提示了HNG在心脑血管疾病防治中的潜在应用前景。为未来HNG作为抗血小板抗血栓药物的转化开发提供了新的实验依据。
闫琰[6]2012年在《银杏内酯B抑制血小板CD40Ligand表达的分子机制研究》文中研究指明目的：探讨银杏内酯B(Ginkgolide B)对活化血小板CD40Ligand(CD40L)的影响以及相关的分子机制。材料与方法：首先取正常人血,1100rpm离心15min,分离富血小板血浆,加入TYRODE/HEPES Buffer, ACD(1:9),2mmol·L-1EDTA,再次离心,弃上清,悬浮细胞,重复两次,以去除血浆蛋白和其他血细胞,获得血小板悬浮液。接下来用比浊法测定血小板聚集率,用Chrono-Log血小板聚集分析仪测定血小板聚集。将血小板悬浮液分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B孵育细胞5min,然后用10g·L-1胶原(collagen)、1U·ml-1凝血酶(thrombin)刺激血小板10min,分析血小板聚集率。将血小板活化后的悬浮液加入SDS终止反应,应用Western Blot方法检测蛋白。将样本电泳,转膜,用5%牛血清白蛋白封闭,室温2小时,洗膜3次。分别加入特异性抗体(PI3K、β-Actin、 Akt、P-Akt、CD40L、GAPDH、P-p38、p38、G10、Syk),4℃孵育过夜。洗膜3次后,加入二抗,室温孵育1小时,洗膜5次。使用ECL化学发光,用凝胶成像仪成像。结果：1.银杏内酯B对血小板聚集的影响确认了10mg·L-1胶原诱导血小板发生较强的聚集,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,血小板聚集率明显降低,聚集率分别为77.07±13.82%、60.65±18.08%和48.39±14.28%。与单纯胶原刺激组比较,差异具有统计学意义,n=6,P<0.05。确认了1U·m1-1凝血酶诱导血小板发生较强的聚集,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,血小板聚集率明显降低,聚集率分别为88.20±7.75%,72.28±6.36%和57.82±6.15%。与单纯凝血酶刺激组比较,差异具有统计学意义,n=4,P<0.05。2.银杏内酯B对CD40L释放的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板CD40L释放为100.47±31.10,胶原刺激血小板活化后CD40L释放明显增加至130.7±24.14,分别用0.2g·L-0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,CD40L的释放以剂量依赖性方式被抑制,释放分别为117.73±18.83,104.94±26.38,82.16±25.03。与单纯胶原刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板CD40L释放为103.12±38.12,凝血酶刺激血小板活化后CD40L释放明显增加至142.0l±39.23,分别用0.2g·L,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,CD40L释放以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为123.70±35.42,108.71±38.12,87.65±32.00。与单纯凝血酶刺激组比较,差异均有统计学意义,n=8,P<0.05。3.银杏内酯B对PI3K表达的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板PI3K表达为112.37±28.22,胶原刺激血小板活化后PI3K表达轻微增加至115.72±26.04,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,PI3K表达无明显变化,表达分别为114.83±22.34,115.08±24.27,114.16±27.03。与单纯胶原刺激组比较,差异没有统计学意义,n=9,P>0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板PI3K表达为111.78±18.22,凝血酶刺激血小板活化后PI3K表达轻微增加至114.72±20.04,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,PI3K表达无明显变化,表达分别为110.64±22.34,115.08±20.74,111.46±19.33。与单纯凝血酶刺激组比较,差异没有统计学意义,n=10,P>0.05。4.银杏内酯B对Akt磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板P-Akt表达为41.30±19.38,胶原刺激血小板活化后P-Akt表达明显增加至88.14±7.85,分别用0.2g·L,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-Akt表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为79.84±30.53,39.67±15.73,14.11±7.08。与单纯胶原刺激组比较,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=3,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板P-Akt表达为37.21±12.93,凝血酶刺激血小板活化后P-Akt表达明显增加至84.77±10.43,分别用0.2g·L-10.4g·-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-Akt表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.21±11.03,58.14±7.83,38.59±9.69。与单纯凝血酶刺激组比较,0.4g·L-和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=4,P<0.05。5.银杏内酯B对p38磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板P-p38表达为51.43±11.74,胶原刺激血小板活化后P-p38表达明显增加至90.24±8.05,分别用0.2g·L-0.4g·-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-p38表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.36±19.51,68.92±12.63,51.22±7.85。与单纯胶原刺激组比较,0.4g·L和0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板P-p38表达为32.18±11.92,凝血酶刺激血小板活化后P-p38表达明显增加至89.68±10.23,分别用0.2g·L-10.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,P-p38表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为76.19±18.34,75.82±12.97,39.75±9.81。与单纯凝血酶刺激组比较,0.6g·L-1银杏内酯B处理组差异有统计学意义,n=5,P<0.05。6.银杏内酯B对Syk酪氨酸磷酸化的影响Western Blot结果显示,以胶原刺激血小板时,静态血小板4G10表达为38.55±10.48,胶原刺激血小板活化后4610表达明显增加至88.47±8.24,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,4G10表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为74.32±13.35,60.91±14.04,48.81±6.76。与单纯胶原刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。Western Blot结果显示,以凝血酶刺激血小板时,静态血小板4G10表达为50.95±11.98,凝血酶刺激血小板活化后4G10表达明显增加至85.45±8.76,分别用0.2g·L-1,0.4g·L-1和0.6g·L-1银杏内酯B预处理细胞后,4G10表达以剂量依赖性方式被抑制,表达分别为77.24±14.68,70.42±15.12,53.49±8.19。与单纯凝血酶刺激组比较,差异均有统计学意义,n=6,P<0.05。结论：1.银杏内酯B能够有效抑制胶原、凝血酶诱导的血小板聚集。2.银杏内酯B能够有效抑制CD40L的表达。3.银杏内酯B明显抑制了Akt磷酸化。4.银杏内酯B能够有效抑制了p38磷酸化。5.银杏内酯B能够有效抑制了Syk络氨酸磷酸化。本研究结果表明,银杏内酯B能有效抑制胶原、凝血酶诱导的血小板聚集,并能通过抑制PI3K/Akt、p38MAPK、Syk通路的活化从而减少血小板释放CD40L,能够有效地减轻AS的炎症反应,对AS的发生和发展有明显的抑制作用。抗血小板药物的干预治疗,对动脉粥样硬化的防治研究提供了新的研究思路以及科学依据。
佚名[7]2016年在《冠心病合理用药指南》文中提出1冠心病概述1.1定义冠状动脉粥样硬化性心脏病是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄、痉挛或阻塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病,统称为冠状动脉性心脏病或冠状动脉疾病,简称冠心病,归属为缺血性心脏病,是动脉粥样硬化导致器官病变的最常见类型。1.2解剖及病理生理机制冠状动脉分为左、右两支,分别位于主动脉窦的左、右开口。左冠状动
王智昊[8]2015年在《25-羟基—原人参叁醇对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制的研究》文中提出冠心病是危害人类健康的严重疾病，心肌梗死更是“第一危险杀手”，尽早对缺血心肌再灌注是治疗心梗的根本措施，但是心肌缺血再灌注往往造成“二次损伤”，可导致缺血区心肌损伤进行性加重。所以如何减轻心肌缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion injury，MI/RI）已成为医学工作者研究的热点，寻找一种安全、有效的药物更是迫在眉睫。人参是我国传统的中药，具有保护缺血心肌、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等诸多方面的作用。25-羟基-原人参叁醇[25hydroxyl-Protopanaxatriol，25-OH-PPT，代号T19，下文以T19出现，化学名：20（R）-达玛烷-3β，6α，12β，20，25-五醇，分子式：C30H54O5，分子量：494]，是从人参茎叶中提取出的单体，属于原人参叁醇类，是一种人参皂苷元。据文献报道，人参总皂苷及人参二醇组皂苷具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，但关于25-羟基-原人参叁醇对于心肌缺血再灌注损伤的影响尚未见报道。那么此种人参单体能否成为保护心肌缺血再灌注损伤的安全有效的药物呢？将是本课题研究的重点。本研究首先采用在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型，研究T19对大鼠MI/RI的保护作用及其机制；其次应用H2O2诱导的H9c2心肌细胞模型，研究T19对H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激性损伤的保护作用及其机制。第一部分25-羟基-原人参叁醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用目的：观察25-羟基-原人参叁醇预处理对Wistar大鼠心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤的保护作用及与药物剂量的相关性，观察PI3K抑制剂LY294002对心肌缺血再灌注损伤的影响。方法：（1）将实验动物Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，分为7组（每组20只）：假手术Sham组，I/R组，T19a组（I/R+T19低剂量），T19b组（I/R+T19中剂量），T19c组（I/R+T19高剂量），抑制剂组（I/R+T19高剂量+LY294002），阳性药曲匹地尔Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19低、中、高剂量分别为5、10、20mg/kg/d，灌胃7d。抑制剂组：20mg/kg/d T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil剂量为：15mg/kg/d，灌胃7d。（2）大鼠麻醉后，结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h，制备缺血再灌注损伤模型，观察缺血再灌注24h的心电图、超声心动图，取心脏用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色法检测心梗面积，在光镜和电镜下观察心脏左室前壁的超微结构。用TUNEL法评估心肌细胞凋亡指数（AI）。检测再灌注24h心肌酶CK-MB、LDH和AST的含量。测量再灌注24h血清中SOD的活性，MDA的含量，CAT及GSH-Px的活性。结果：（1）缺血30min再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组心电图ST段比I/R组有下移，但无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显下移（P<0.01，P<0.01），下移程度与T19剂量呈正相关。（2）与I/R组比较，T19低、中、高剂量组心肌梗死面积减少，低剂量组无统计学意义（P>0.05），中、高剂量组与I/R组相比有明显减少（P<0.05，P<0.05），减少程度与剂量呈正相关。（3）缺血前30min各组大鼠基线心脏超声测量结果无显着性差异。再灌注24h后，与I/R组比较T19低剂量组有增加左室射血分数（LVEF）和减少左室舒张末期容积（LVEDV）及左室收缩末期容积（LVESV）的趋势，但无显着差异（P>0.05）。T19中、高剂量组明显增加了LVEF值（P<0.01），降低了LVEDV和LVESV（中、高剂量组均为P <0.01），改变程度与T19剂量呈正相关。（4）再灌注24h后，与I/R组比较，T19低剂量组CK-MB、LDH、AST有减少趋势，但是无显着差异（P>0.05）；T19中、高剂量组可明显减少血清中CK-MB、LDH、AST值，有显着差异（P<0.05，P<0.05，P<0.05），且改变趋势与T19剂量呈正相关。（5）T19高剂量组明显增高了SOD、CAT、GSH-Px含量（P<0.05，P<0.05，P<0.01），降低了MDA含量（P<0.05），T19低、中剂量组对SOD、CAT、MDA没有明显改变（P>0.05），但两组可明显增高GSH-Px的含量（P<0.05，P<0.01）。（6）心肌病理学改变：在光镜、电镜下观察及用TUNEL检测：与I/R组相比，T19中、高剂量组能明显减少心肌坏死细胞，减少炎症细胞浸润，减少凋亡指数（P<0.01）。减少程度与剂量呈正相关。T19低剂量组则也有上述表现，但没有统计学差异（P>0.05）。与阳性药Trapidil组相比较，T19中剂量组对缺血再灌注损伤心肌的保护作用，与Trapidil组作用相当，而PI3K通路抑制剂LY294002组对心肌的保护作用均被阻断。结论：25-羟基-原人参叁醇对大鼠实验性心肌缺血再灌注损伤有保护作用，低剂量无明显保护作用，中、高剂量组有明显保护作用，且作用效果与剂量高低呈正相关。PI3K/Akt通路参与了T19对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分25-羟基-原人参叁醇通过PI3K/Akt信号通路介导对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制研究目的：探讨PI3K/Akt信号通路在25-羟基-原人参叁醇预处理对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损作用的机制。方法：（1）选用Wistar大鼠，雌雄各半，体重180-250g，随机分为5组（每组10只）：假手术Sham组，I/R组，T19组（I/R+T19），抑制剂组（I/R+T19+LY294002），Trapidil组（I/R+Trapidil）。T19组剂量为20mg/kg/d，灌胃7d，抑制剂组：20mg/kg/d的T19灌胃7d，末次灌胃前30min腹腔注射LY2940020.3mg/kg。Trapidil组剂量为15mg/kg/d，灌胃7d。结扎大鼠左冠状动脉前降支制成心肌缺血模型，使心肌缺血30min，再灌注24h后留取心脏和血清。（2）用Western blot法及免疫组化法检测各组心肌组织中Akt、p-Akt(Ser-473)、eNOS、p-eNOS（Ser-1177）、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。用硝化还原法检测各组血清中NO的含量。结果：（1）Western blot法及免疫组化法检测发现：各组心肌细胞中Akt和eNOS蛋白含量相当，没有显着差别（P>0.05）。T19组与I/R组比较明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），给予LY2940002后与T19组比较，明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01）。（2）硝化还原法检测发现：T19组比I/R组NO含量明显增加（P<0.01），给予LY294002后，NO含量比T19组明显减少（P<0.01）。（3）Western blot法及免疫组化法检测发现：与Sham组比较，I/R组心肌组织中Caspase-3表达明显上调（P<0.01），Bcl-2表达明显下调（P<0.01），Bax表达明显上调（P<0.01）。与I/R组比较，T19组明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。抑制剂LY294002组则与I/R组相当，比T19组明显上调Bax和Caspase-3的表达（P<0.01，P<0.01），明显下调Bcl-2的表达（P<0.01）。Trapidil组比I/R组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS蛋白含量（P<0.01），明显增加NO含量（P<0.05），明显上调Bcl-2表达（P<0.01），明显下调Bax和Caspase-3表达（P<0.01，P<0.01）。结论：（1）25-羟基-原人参叁醇减少大鼠心肌缺血再灌注的损伤可能与磷酸化Akt、磷酸化eNOS及NO有关。（2）25-羟基-原人参叁醇抗心肌细胞凋亡可能是通过上调Bcl-2、下调Bax和Caspase-3蛋白表达实现的。（3）PI3K/Akt信号通路在缺血再灌注损伤后心肌保护中起了重要作用。其机制可能与PI3K/Akt通路介导凋亡蛋白的表达有关。（4）25-羟基-原人参叁醇通过激活PI3K/Akt信号通路，保护心脏细胞内皮功能，减少凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤。第叁部分25-羟基-原人参叁醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞的保护作用及机制的研究目的：探讨25-羟基-原人参叁醇对H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤模型的保护作用及机制。方法：（1）将H9c2心肌细胞分为七组：Control组、H2O2组、H2O2+T19低、中、高剂量组，H2O2+T19大剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19低、中、高剂量为31.25、62.5、125μg/ml，T19剂量预处理H9c2心肌细胞4h，然后即加入250μM H2O2作用6h；H2O2+T19高剂量+LY294002组的给药方法为先用25μM LY294002处理H9c2心肌细胞1h,之后再加入125μg/ml人参皂甙单体T19作用4h，最后加入250μM H2O2作用6h；阳性药Trapidil组剂量为30μg/ml。（2）用MTT法检测细胞活力，在显微镜下观察细胞形态，用Annexin-FITC/PI流式细胞仪荧光双染及Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡，评价T19对心肌细胞H2O2损伤是否具有保护作用及PI3K/Akt通路的参与作用。（3）再将H9c2心肌细胞分为五组：Control组，H2O2组，H2O2+T19组，H2O2+T19高剂量+LY294002组，阳性药Trapidil组。T19组剂量为125μg/ml，给药方法同前。（4）用Western blot法测上述五组Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达。结果：（1）用不同浓度的T19预处理H9c2心肌细胞，可减少H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤，减少细胞凋亡，并在一定范围内与T19剂量成正比。加入PI3K/Akt抑制剂LY294002后阻断了T19的保护作用。Trapidil组结果与T19高剂量组相当。（2）T19组比H2O2组明显上调磷酸化Akt及磷酸化eNOS表达(P<0.01)，LY组比T19组明显下调磷酸化Akt及磷酸化eNOS的蛋白表达(P<0.01)，T19组比H2O2组明显上调Bcl-2表达(P<0.01)，明显下调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)，LY组比T19组明显下调Bcl-2表达(P<0.01)，上调Bax和Caspase-3表达(P<0.01, P<0.01)。Trapidil组表达与T19组相当。结论：25-羟基-原人参叁醇对H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤模型有保护作用。其机制可能与激活PI3K/Akt通路来调节凋亡相关蛋白，进而减轻H9c2细胞凋亡有关。
陈松[9]2017年在《电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠p38MAPK信号通路的影响及机制研究》文中研究表明目的利用电针的低创伤、易操作和可控性强的优势,结合针灸经典理论“心胸内关谋”,并借助已有的关于内关-心脏相关性的研究基础,观察电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠早期心功能参数、心室重构、心肌梗死情况,血清及心肌相关因子、线粒体呼吸功能的影响,并借用p38MAPK通路阻滞剂SB203580从p38MAPK信号通路的角度分析其作用机制,为临床各型I/R的防治方法提供新的理论探讨和实验基础。方法选用SPF级雄性Wistar大鼠200只,取材前体重180g-220g,采用随机数字表法,将大鼠随机分为五组:假手术组(Shame operation group,S组)、模型组(Model group,M组)、电针预处理组(electroacupuncture pretreatment group,EA组)、抑制剂预处理组(SB203580 group,SB组)和电针+抑制剂预处理组(electroacupuncture pretreatment+SB203580 group,EA+SB组)。假手术组:常规饲养,捆绑1次/天,共7天,第8天手术过程中,只开胸穿线,不结扎左冠状动脉前降支;模型组:捆绑1次/天,共7天,第8天通过采用推管法行左冠状动脉缺血再灌注术,制备在体心肌缺血再灌注模型;抑制剂预处理组:捆绑1次/天,共7天,第8天将p38MAPK抑制剂SB203580溶于二甲基亚砜成20%溶液,在造模前给予0.3mg/kg皮下注射,后造模过程同模型组;电针预处理组:捆绑1次/天。电针双侧内关穴操作,直刺深度约5mm,采用HANS-200型电针治疗仪,选用连续波,频率2Hz,强度1mA,电针预处理1次/天,通电治疗20min。共7天,后造模过程同模型组;电针+SB203580预处理组:捆绑1次/天,共7天,电针预处理过程同电针预处理组,第8天造模前给予抑制剂SB203580皮下注射,过程同抑制剂预处理组,后造模过程同模型组。复灌即刻,利用生物信号及压力测试系统(BL-Newcentury 410)测定大鼠左心室心功能指标(舒张末期压力、左室收缩期平均压、短轴缩短率和射血分数),后处死大鼠,取血清待检,剪取心脏,称取梗死区重量和全心重量,分别计算心肌梗死区重量和全心重量的比值。ttc染色法分析心肌梗死面积,采用全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(ck)、乳酸脱氢酶(ldh)、肌钙蛋白i(ctni),采用比色法检测ros含量,采用黄嘌呤氧化法检测心肌超氧化物歧化酶(sod)活性,硫代巴比妥酸法检测心肌丙二醛(mda)含量,高效液相色谱法计算心肌组织中atp的含量。利用激光共聚焦显微镜、he染色和透射电镜观察大鼠心肌细胞尤其是线粒体的形态变化。结果(1)m组的梗死面积和梗死程度的比值,与s组相比较,均显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的梗死面积和梗死程度的比值均较m组有降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显着性差异(p>0.05)。(2)m组的lvedp与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的lvedp均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显着性差异(p>0.05)。m组的lvsp、fs、ef值与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的lvsp、fs、ef值均较m组显着升高,差异有统计学意义(p<0.05),ea组、ea+sb组和sb组之间无显着性差异(p>0.05)。(3)m组的ldh、ck及ctni与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的ldh、ck及ctni均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ldh、ck与ea+sb组和sb组之间无显着性差异(p>0.05)。ea组和ea+sb组的ctni与sb组比较,有显着降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)m组的tnf-α、il-1β和il-6与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的tnf-α、il-1β和il-6均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的tnf-α、il-1β和il-6与ea+sb组和sb组比较,显着降低,差异有统计学意义(p<0.05)。m组的il-4和il-10与s组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。sb组、ea组和ea+sb组的il-4和il-10与m组比较,有显着性差异(p<0.05)。各治疗组之间差异性无统计学意义(p>0.05)。(5)m组的icam-1和vcam-1与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的icam-1和vcam-1均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的icam-1和vcam-1明显低于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。(6)m组的ros和mda与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的ros和mda均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ros和mda明显低于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。m组的sod和atp与s组相比较,显着降低(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的sod和atp均较m组显着升高,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的ros和mda明显高于ea+sb组和sb组,差异有统计学意义(p<0.05)。(7)与s组比较,m组、ea组、sb组及ea+sb组大鼠心肌细胞na+-k+-atpase和ca2+-atpase的活性明显下降(p<0.05),ea组、sb组及ea+sb组大鼠心肌细胞na+-k+-atpase和ca2+-atpase的活性较m组明显提高(p<0.05),ea组中na+-k+-atpase和ca2+-atpase的改善明显优于sb组及ea+sb组,差异具有统计学意义(p<0.05)。(8)m组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达与s组相比较,显着升高(p<0.05),sb组、ea组和ea+sb组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达均较m组显着降低,差异有统计学意义(p<0.05),ea组的mkk3/6、p38及p-p38蛋白表达数值低于ea+sb组和sb组,但差异无统计学意义(p>0.05)。(9)s组正常心肌纤维排列规则,细胞结构完整,细胞核及线粒体形态和数量正常,线粒体嵴清晰,心肌间未见异常。m组心肌肌纤维出现溶解断裂甚至坏死,间质增大,肿胀明显。部分线粒体固缩变小,部分线粒体肿胀、或外膜破损。线粒体嵴不规则、断裂成絮状或缺失。EA组、SB组及EA+SB组肌纤维间隙轻度增宽,坏死灶减轻,心肌细胞轻微肿胀,细胞核及线粒体结构基本完整,小部分线粒体仍存在空泡样病变。结论1.电针“内关”预处理可使I/R模型大鼠心肌梗死面积和梗死程度明显下降,可减轻线粒体肿胀和坏死程度,减轻心肌细胞间炎症因子浸润,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针“内关”预处理可使I/R模型大鼠LVEDP降低,LVSP、FS和EF升高,可降低血清中LDH、CK及cTnI的含量,保护大鼠心肌组织,改善大鼠心功能。3.电针“内关”预处理可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6等炎性因子的表达,增加IL-4和IL-10等抗炎因子的表达,可以下调心肌粘附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达,通过调控炎症反应相关因子保护受损心肌组织。4.电针“内关”预处理可以减少I/R模型大鼠心肌细胞ROS及MDA的含量,提高的ATP含量,激活SOD和ATP酶的活性,改善RCR,通过保护线粒体结构和功能的完整性来减轻I/R中心肌损伤。5.MKK3/6/p38MAPK信号传导通路参与在体I/R模型大鼠的病理过程,I/R中大鼠MKK3/6和p38MAPK表达上调,电针“内关”预处理可以明显抑制I/R中MKK3/6、p38MAPK的蛋白表达,抑制p38MAPK的磷酸化,对心肌细胞p38信号转导通路的调节可能只是电针“内关”预处理保护I/R,发挥其抗心肌缺血的作用机制之一。6.电针组与p38抑制剂组和电针+p38抑制剂组相比较,对I/R大鼠模型相关指标结果的调控上可见明显差异,但p38抑制剂组和电针+p38抑制剂组之间并未出现明显迭加效应,说明电针内关预处理对I/R的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
孙畅[10]2012年在《尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺单独及联合使用抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用》文中研究说明目的：研究尼可地尔(Nicorandil, Nic)、谷氨酰胺(glutamine, Glu)、美托洛尔(metoprolol, Met)叁药联用对大鼠在体心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)的保护作用及其机制。方法：将雄性Wistar大鼠随机分为7组,即(1)假手术(sham)组；(2)缺血再灌注损伤(IR)组；(3)尼可地尔(Nic)组；(4)谷氨酰胺(Glu)组；(5)美托洛尔(Met)组；(6)尼可地尔、谷氨酰胺、美托洛尔联合用药高剂量(NGM)组；(7)尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺联合用药低剂量(NGML)组。sham组只开胸,行冠状动脉左前降支(left anterior descending, LAD)穿线；IR组行心脏LAD30min缺血/120min再灌注程序(ischemia/reperfusion, I/R);药物预处理组则在I/R程序前30min腹腔注射相应药物,Nic、Glu、Met的初始给药剂量为1mg/kg,134.6mg/kg,1mg/kg。监测各组心肌缺血再灌注损伤期间的心脏生理学情况；损伤后心肌梗死面积和形态学改变；于120min再灌注末取血测定肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB).髓过氧化物酶(nyeloperoxidase,MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性和丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量；TUNEL(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)法检测心肌细胞凋亡率,Western印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和保护性蛋白热休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)的表达情况。结果：1.药物预处理对大鼠I/R损伤后心脏生理学的影响与IR组比较,Met、NGM和NGML组可显着推迟室性早搏(ventricular premature contractions, VPC)出现时间(P<0.05),缩短累计时间(P<0.01),Glu组虽未推迟VPC出现时间,但明显缩短累计时间(P<0.01)；各实验组室速(ventricular tachycardia, VT)出现时间无统计学差别,除Nic组外其余预处理组VT累计时间均小于IR组(P<0.01)。与药物单用组比较,NGM和NGML组,VT累计时间缩短(P<0.05)；与IR组VPC100%的发生率相比,Glu组、NGM组和NGML组的VPC发生率较IR组降低(P<0.05)。与IR组相比,除Nic组外,其余组VT发生率低于IR组(P<0.01)。室颤(ventricular fibrillation, VF)仅发生在IR组和Nic组,且后者略高于前者。2.药物预处理对大鼠I/R损伤后心肌梗死面积和形态学的影响IR组心肌梗死面积(infarction size,IS)大(93.5±24.1mg),梗死区与危险区(area at risk,AAR)比值(IS/AAR)高(53.4±13.6%),苏木精-伊红(Haematoxylin-Eosine,HE)染色见病变明显。与IR组比较,各药物预处理组梗死面积均显着减小(P<0.01),IS/AAR值明显降低(P<0.01),HE染色见病变减轻。与药物单用组比较,NGM组可进一步降低IS/AAR,改善形态变化。3.药物预处理对大鼠I/R损伤后的血液酶学的影响IR组血浆CK-MB活性明显升高,为sham组的2.11倍(P<0.01)。药物预处理组CK-MB活性降低(P<0.01vs IR)。与Glu、Met和NGML组相比,NGM组的CK-MB活性更低(P<0.05)。IR组血浆MPO活性明显升高,为sham组的1.67倍(P<0.01)。药物预处理组MPO活性降低(P<0.01vs IR)。与药物单用组相比,NGM组的MPO活性更低(P<0.05)。IR组血浆SOD活性较低(207.8±32.4U/m1),为sham组的0.94倍,药物预处理组SOD活性升高(P<0.01vs IR)。与药物单用组相比,NGM组的SOD活性更高(P<0.05)。IR组血浆MDA含量较高(8.15±1.32nmol/ml),为sham组的1.72倍,药物预处理组MDA含量均降低(P<0.01vs IR)。4.药物预处理对大鼠I/R损伤后的抗凋亡能力的影响IR组在缺血区有较高的细胞凋亡率(36.9±10.3%),凋亡相关蛋白表达Bcl-2/Bax值较低(0.14±0.08)；和I/R组比较,药物预处理组的细胞凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2/Bax值升高(P<0.01)。5.药物预处理对大鼠I/R损伤后HSP70表达的影响与sham组比较,IR组的HSP70表达明显增多(P<0.01)；与IR组相比,药物预处理组的HSP70表达明显升高(P<0.01)；与药物单用组相比,NGM组的HSP70表达更高(P<0.01)。结论：尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺联合用药组与药物单用组相比能进一步改善在体心肌缺血／再灌注损伤模型大鼠心脏生理功能；降低I/R损伤所致心肌梗死面积,改善损伤的心肌细胞形态学改变；减少CK-MB的漏出和MPO分泌,增加心肌细胞抗氧化能力,提高SOD活性,减少MDA含量；增加抗凋亡能力,降低细胞凋亡率,改善Bcl-2、Bax的异常表达；增加保护性蛋白HSP70的表达。叁药联用对IR损伤具有协同保护作用。
参考文献：
[1]. 心肌缺血预处理的抗血小板活化和内皮保护作用[D]. 肖滨. 苏州大学. 2004
[2]. 延胡索碱及延胡索复方抗冠心病室性心律失常的实验与临床研究[D]. 李荣. 广州中医药大学. 2007
[3]. Adropin通过RISK通路减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤及其与临床冠状动脉粥样硬化的相关性研究[D]. 吴灵振. 福建医科大学. 2014
[4]. 预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响[D]. 贾俊海. 江苏大学. 2008
[5]. Humanin衍生物HNG抗血小板抗血栓作用及机制的研究[D]. 任丽洁. 苏州大学. 2018
[6]. 银杏内酯B抑制血小板CD40Ligand表达的分子机制研究[D]. 闫琰. 北京中医药大学. 2012
[7]. 冠心病合理用药指南[J]. 佚名. 中国医学前沿杂志(电子版). 2016
[8]. 25-羟基—原人参叁醇对大鼠实验性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及机制的研究[D]. 王智昊. 吉林大学. 2015
[9]. 电针“内关”预处理对心肌缺血再灌注大鼠p38MAPK信号通路的影响及机制研究[D]. 陈松. 湖北中医药大学. 2017
[10]. 尼可地尔、美托洛尔、谷氨酰胺单独及联合使用抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[D]. 孙畅. 天津医科大学. 2012
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