论文摘要
鼠伤寒沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,随着抗菌药物在防治沙门氏病中的广泛使用,使鼠伤寒沙门菌对临床上常用药物产生了高耐药性和多重耐药性（MDR）。细菌中存在多种双组分信号转导系统（TCSs）与细菌耐药性及多重耐药（MDR）的形成密切相关。CpxAR系统是阴性菌中普遍存在的TCS之一,对沙门菌的耐药性及MDR有重要的调控作用。目前发现与鼠伤寒沙门菌黏菌素耐药相关的通路是由TCSs PhoPQ和PmrAB介导,其中MgrB为PhoPQ的负性调控蛋白。研究发现:肺炎克雷伯菌中IS5-like、IS1-like、ISKpn14的插入导致mgrB截短或失活在黏菌素耐药中起重要作用,目前还没有研究发现cpxR在acrB缺失背景下对鼠伤寒沙门菌mgrB的调控作用。本研究通过探索鼠伤寒沙门菌TCS CpxAR的应答调节子CpxR对黏菌素耐药通路中负性调控蛋白MgrB的调控作用,分析CpxR的调控通路,为进一步研究不同TCSs之间的相互作用提供新的理论思路和试验依据。运用Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌mgrB单基因缺失株（JSΔmgrB::kan简写为:JSΔ3::kan）,PCR扩增出mgrB完整的开放性阅读框;并将其克隆至原核表达载体pBAD/HisA上;电转化到本实验室前期构建的JSΔacrBΔcpxR（简写为:JSΔ1Δ2）中;获得回补菌株（JSΔ1A2/pmgrB）;利用Over-lapping PCR方法,构建cpxR和mgrB的联合表达菌株（JSΔ1 Δ2/pcpxR-mgrB）;利用噬菌体转导技术,以前期构建的JSΔ1Δ2为受体菌,JSΔ3::kan为供体菌,在噬菌体P22的作用下构建acrB、cpxR和mgrB三基因缺失株及相应基因回补株。用微量肉汤稀释法测定了各菌株对黏菌素的最小抑菌浓度（MICs）,同时测定了各菌株在LB肉汤和M9-0.2%葡萄糖中的生长曲线。结果表明:成功构建了鼠伤寒沙门菌mgrB单基因缺失株（JSA3::kan）,mgrB回补菌株（JSΔiΔ2/pmgrB和cpxR-mg）rB联合表达株（JSA1Δ2/pcpxR-mgrB）、三基因缺失株及其相应基因回补株（JSΔ1 Δ2A3::kan、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR）。MIC结果显示:JSΔ1 Δ2/pcpxR-mgrB 对黏菌素的 MIC 值较 JSΔ3::kan、JSΔ1Δ2A3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpR-mgrB 分别下降 16、8、8、4倍;JSΔ3::kan对黏菌素的 MIC 值较 JS 上升2倍;JSA1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ2Δ3::kan对黏菌素的 MIC 值未发生变化。杀菌曲线试验证明 JSΔ3::kan、JSA1Δ2/pmmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan、JSA1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ,::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB菌株在30 min-12 h内用不同浓度的黏菌素孵育后,细菌活性均受到不同程度的抑制,在12.8 mg/L的黏菌素孵育8 h后,这些菌株存活率下降至10%以下。进一步对各菌株的生长情况分析表明:在LB肉汤培养基中JS、JSΔ1Δ2::kan、JSΔ3::kan、JSΔ1Δ2、JSΔ1Δ2/pmgrB、JSΔ1Δ2::kar/pcpxR、JSΔ1Δ2Δ3::kan、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pmgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB、JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR、JSΔ2/pcpxR-mgrB 菌株在0-8 h时产生相似的生长曲线,但在14 h时显示不同的终点,JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB的生长活性最高（与 JS 相比,P<0.003）,JSΔ1Δ2Δ3::kan/pcpxR-mgrB 的生 长活性最低（与 JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB相比,P<0.0001）。在M9-0.2%葡萄糖培养基中24 h时则观察到不同的现象,JSΔ1Δ2/pcpxR-mgrB的生长活性较低（与JSΔ1Δ2Δ3::kan相比,p<0.00006）,JSΔ1Δ2Δ3::kan的生长活性最高（与JSΔ1Δ2::kan相比,p<0.01）。这些结果表明:cpxR通过调控黏菌素耐药通路中mgrB及下游的多个靶基因的表达,从而调控鼠伤寒沙门菌对黏菌素的敏感性。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 魏单单
导师: 胡功政
关键词: 鼠伤寒沙门菌,调控子,负性调控蛋白基因,基因缺失,黏菌素
来源: 河南农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 河南农业大学
基金: 国家自然科学基金项目(31772799),十三五国家重点研发计划畜禽病原菌耐药性数据库建设及预警技术研究(2016YFD0501304)
分类号: S852.61
DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000432
总页数: 49
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标签：鼠伤寒沙门菌论文; 调控子论文; 负性调控蛋白基因论文; 基因缺失论文; 黏菌素论文;