代静澜[1]2004年在《小鼠骨髓干细胞在缺血再灌注损伤肾脏内分化的研究》文中认为成体干细胞是从胎儿和出生后个体的不同组织中分离到的具有自我更新、多向分化潜能和增殖特性的细胞,它不仅对所在组织器官有重建和修复功能,还具有分化为其他组织细胞的可塑性。研究较多的骨髓干细胞已证实除了可分化成造血细胞系列外,还可跨系统、跨胚层分化为肝细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元细胞、视网膜细胞等,目前动物实验及一些临床病例利用骨髓干细胞极强的分化能力用于心肌梗塞,缺血性心脏病的治疗,发现移植的骨髓干细胞可迁移到心肌梗死区分化为心肌细胞和血管内皮细胞,参与坏死心肌组织的再生和血管生成,改善心功能。提示骨髓干细胞移植在退行性和遗传性等难治性疾病中具有潜在的治疗前景。急性肾功能衰竭在临床的发病率较高,可由多种因素引起,其中缺血再灌注(I/R)损伤是最为常见原因,严重烧伤、心脏停跳、失血性休克、呼吸抑制、肾移植术、毒物中毒及严重感染等,均可导致急性肾缺血再灌注损伤,主要病理表现为肾小管的损害,肾功能的恢复依赖于肾小管上皮细胞的再生。已有的研究发现,在制备的肾小球肾炎模型中,骨髓干细胞可分化成肾小球系膜细胞,参与肾小球的修复,提示骨髓干细胞在损伤肾脏的局部微环境中可发挥多向分化的潜能。为此,本实验制备小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,观察骨髓干细胞在其中的分化情况。方法:制备雌性BALB/C小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,亚致死剂量60Co照射后通过尾静脉移植同系雄性小鼠骨髓单个核细胞,移植后不同时相点处死小鼠,PCR检测受体雌鼠骨髓中Y-染色体性别决定区Sry基因片段;免疫组织化学染色结合荧光原位杂交观察骨髓干细胞在肾脏内的分化情况;骨髓移植前后不同时相测定血清尿素氮值了解小鼠肾功能情况。主要结果:1.缺血再灌注模型的制备及鉴定:小鼠双肾缺血30min恢复灌注24h,HE染色可见肾小管上皮细胞呈空泡样变性,部分细胞坏死脱落入管腔,基底膜暴露,肾小管
冯国伟[2]2012年在《缺血性损伤肾脏中骨髓来源肾脏干细胞的分离、体外培养和鉴定》文中研究表明目的：本研究拟通过建立骨髓移植小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,利用流式细胞学技术研究骨髓来源的干细胞在迁移到受损肾脏之后能否转变为肾脏干细胞,并观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能否促进这种转变作用；观察从受损肾脏分离的骨髓来源肾脏干细胞能否在体外扩增,并对其表型进行鉴定,为骨髓来源细胞治疗肾脏损伤提供新的理论依据。方法：我们利用系统表达绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6J转基因小鼠作为供体提供骨髓,无荧光标记的受体小鼠经致死剂量137Cs照射去除骨髓后接受供体的骨髓移植。骨髓移植(BMT)模型构建成功后,我们对受体小鼠施加单侧肾脏缺血再灌注(I/R)损伤,通过流式细胞学技术研究肾脏I/R损伤后不同时间点骨髓来源细胞/干细胞向受损肾脏迁移情况,并检测受损肾脏中GFP+CD45+细胞的比例变化,提供骨髓来源干细胞转变为肾脏干细胞的证据。其中我们根据是否施加G-CSF动员骨髓来源细胞而对受体小鼠进行分组,即G-CSF组和盐水(Saline)组。此外,我们从双侧肾脏I/R损伤后2个月的小鼠体内离体、消化肾脏获取肾脏细胞,并进行体外培养。我们观察肾脏细胞中GFP+细胞的体外扩增能力,并对这些骨髓来源肾脏干细胞的表型进行鉴定。而且,我们还评价了体外培养体系中纤维粘连蛋白(Fn)对于这种细胞贴壁能力和增殖潜能的影响。结果：BMT后4周,受体小鼠外周血GFP+细胞的比例为81.83%-97.31%(90.93±3.19%)。G-CSF动员后,外周血干细胞表面标记物表达情况,G-CSF组CD90、CD133和FLK-1比例(11.38±0.81%、8.95±0.80%和2.20±0.29%)明显高于Saline组(2.11±0.60%、2.12±0.66%和1.38±0.30%),差异有统计学意义。I/R损伤后,迁移到肾脏的骨髓来源(GFP+)细胞逐渐增多,在早期(14天),GFP+细胞比例在Saline组对侧肾脏(SCK)为2.75±0.55%,Saline组缺血侧肾脏(SIK)为5.77±0.33%,G-CSF组对侧肾脏(GCK)为2.40±0.35%,G-CSF组缺血侧肾脏(GIK)为4.72±0.46%。SIK>SCK,GIK>GCK,差异有统计学意义；SIK>GIK,差异无统计学意义。损伤后28天,肾脏内GFP+细胞比例在SCK、SIK、GCK、GIK分别为3.35±0.35%、9.43±0.43%、6.15±0.37%、15.98±1.22%。SIK>SCK, GIK>GCK,GIK>SIK,差异均有统计学意义。损伤后56天,GFP+细胞向肾脏内迁移情况与损伤后28天相似。I/R损伤后,迁移到肾脏的骨髓来源干细胞(GFP+Sca-1+)逐渐增多,在损伤后的早期(14天以内),G-CSF组和Saline组,缺血侧肾脏GFP+Sca-1+细胞比例均高于对侧肾脏,差异无统计学意义。在肾脏缺血损伤后28天,SCK.SIK.GCK和GIK中GFP+Sca-1+细胞比例分别为1.75±0.30%、5.15±0.75%、2.60±0.60%和9.55±1.32%。SIK>SCK,GIK>GCK, GIK>SIK,差异均有统计学意义。损伤后56天,GFP+Sca-1+细胞向肾脏迁移情况与损伤后28天相似。此外,肾脏内GFP+CD133+和GFP+CD44+细胞的表达趋势与GFP+Sca-1+细胞相似。肾脏损伤后14天,G-CSF组和Saline组,缺血侧肾脏GFP+CD45+细胞均高于对侧肾脏,差别无统计学意义。损伤后28天,SCK、SIK、GCK和GIK中GFP+CD45+细胞比例分别为2.25±0.35%、7.50±0.31%、4.42±0.43%和13.00±1.03%。SIK>SCK,GIK>GCK,GIK>SIK,差异均有统计学意义。损伤后56天,SCK、SIK、GCK和GIK中GFP+CD45+细胞的表达比例分别为4.72±0.69%、2.20±0.39%、3.00±0.54%和1.70±0.26%。SCK>SIK,GCK>GIK,差异有统计学意义；SIK>GIK,差异无统计学意义。损伤后56天,GIK和SIK中GFP+CD45+细胞与28天时相比,表达水平均明显下降,差异均有统计学意义；GCK中这类细胞的表达水平下降,差异无统计学意义；而SCK中此类细胞表达水平上升,差异无统计学意义。体外培养过程中,骨髓来源肾脏干细胞为圆形或类圆形,可形成集落或聚集成团生长,体外扩增超过30天。P0-P6代,肾脏细胞中GFP+细胞比例逐渐增加,骨髓来源肾脏干细胞(GFP+Sca-1+)比例逐渐增加。体外培养中骨髓来源肾脏干细胞CD45的表达水平比成体新分离时降低,且不表达CD34和CD90。与未铺Fn的培养体系相比,Fn铺盘的培养条件下,每长满一代所需时间明显减少(5.40±0.46天vs.8.33±0.81天),GFP+细胞(主要为骨髓来源肾脏干细胞)比例显着增加(1.96±0.24%vs.0.92±0.17%),差异均有统计学意义。结论：1)G-CSF可有效动员骨髓来源干细胞释放入外周血,并可增加骨髓来源细胞/干细胞向损伤后肾脏归巢的程度；2)肾脏损伤后晚期,骨髓来源干细胞转变为肾脏干细胞,这一作用可以被G-CSF增强；3)在体外培养中,骨髓来源肾脏干细胞比其他肾脏固有干/祖细胞具有更强的增殖潜能；4)体外培养中,骨髓来源肾脏干细胞失去骨髓来源细胞/干细胞标记物,但仍然表达Sca-1；5)体外培养体系中,纤维粘连蛋白可增加骨髓来源肾脏干细胞的贴壁能力和增殖潜能。
刘真真[3]2009年在《骨髓间充质干细胞治疗急性肾缺血再灌注损伤的研究》文中研究表明背景及目的急性肾功能衰竭(Acute renal failure,ARF)是多种原因引起的肾功能骤然下降而出现的临床综合征,病死率很高,目前除了支持治疗和血液透析,尚没有有效的治疗方法,是临床治疗的难点。临床ARF的最常见病因是缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤,肾脏手术、肾移植及弥散内血管性出血均可引起肾脏缺血再灌注损伤,其最主要的病理损害为急性肾小管坏死(acute tubularnecrosis,ATN)。因此,如何减轻肾小管的坏死、恢复肾小管的结构和功能是治疗ARF的重要切入点。干细胞是一群未分化的细胞,具有自我更新和多向分化潜能。骨髓中有两种干细胞,即造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)和间充质干细胞(Mesenchymalstem cells,MSCs)。造血干细胞可分化成为不同类型的血细胞,骨髓MSCs存在于骨髓间质,为造血干细胞提供造血支持,并能分化成间质细胞,如软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等。另外,干细胞可塑性研究证明,骨髓MSCs不仅可以向中胚层细胞分化,还可以向内胚层和外胚层细胞分化。基于骨髓MSCs的这些特性,它已成为组织工程学的一种重要“种子”细胞。研究报道,骨髓MSCs能够归巢到组织受损区域,参与修复损伤的组织,并能改善其功能。在心脏疾病、神经系统疾病中,骨髓MSCs移植均起到了明显的治疗疗效。依据骨髓MSCs的生物学特性及其在多种损伤性疾病的治疗效果,我们认为骨髓MSCs移植治疗肾损伤疾病可能有效。本研究通过体外分离、培养和扩增获得骨髓MSCs,并对其生物学特性进行检测,确定所得细胞确为骨髓MSCs。同时建立了小鼠急性肾缺血再灌注损伤模型,经尾静脉注射移植入骨髓MSCs,于移植后的不同时间点检测肾功能指标(BUN,Scr)、肾脏病理及肾小管上皮细胞的增殖指数等指标,评价骨髓MSCs在小鼠急性肾缺血再灌注模型中的疗效,并初步从减轻炎症反应的角度探讨骨髓MSCs的治疗机制。材料与方法选择18-20g(6-8周龄)的BALB/c(H-2K~d)小鼠,雄性小鼠用来制备骨髓MSCs,雌性小鼠用来建立动物模型。采用全骨髓培养法分离、培养及扩增骨髓MSCs。90只雌性小鼠随机分为假手术组、I/R组和MSCs治疗组。MSCs治疗组和I/R组小鼠采用微血管夹夹闭双侧肾蒂40分钟,1小时后,经尾静脉注射1×10~6个骨髓MSCs(0.2ml)或等剂量的RPMI 1640。假手术组只对其进行手术操作,不夹闭肾蒂。再灌注后第1天、3天、10天和30天时收集血样,采用全自动生化分析仪测定血清肌酐和尿素氮。部分小鼠于再灌注后第3天和第30天时处死,取双侧肾脏进行HE染色,根据Paller标准对肾脏的病理改变进行评分。另一部分小鼠于再灌注后第1天和第10天时处死,取双侧肾脏进行PCNA(Proliferating Cell NuclearAntigen,增殖细胞核抗原)免疫组化染色,以PCNA阳性的肾小管细胞数反应肾小管上皮细胞的增殖指数。结果1.小鼠骨髓MSCs呈成纤维细胞样,免疫标记:CD29~+、CD44~+、CD105~+、Flk-1~+、CD13~-、CD31~-、CD34~-、CD45~-、CD106~-、HLA-DR~-。2.小鼠骨髓MSCs在特定的诱导培养基中可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞。3.成功建立小鼠急性肾缺血再灌注损伤模型,成功率95%。4.与假手术组对比,I/R组再灌注后第1、3天的血清BUN值、Scr值明显增高(P＜0.05),第10、30天的血清BUN值、Scr值无明显改变(P＞0.05);MSCs治疗组再灌注后第1天的血清BUN值、Scr值明显增高(P＜0.05),第3、10、30天的血清BUN值、Scr值无明显改变(P＞0.05)。与I/R组对比,MSCs治疗组再灌注后第1天和第3天血清BUN值、Scr值明显降低(P＜0.05)。小鼠MSCs治疗组的肾功能恢复较早。5.光镜下观察MSCs治疗组的肾脏病理改变较I/R组明显减轻。I/R组和MSCs治疗组再灌注后第3、30天时的肾脏HE评分显示,MSCs治疗组的评分均较I/R组明显减低(P＜0.05)。6.与假手术组对比,I/R组再灌注后第3天的PCNA阳性细胞数没有明显变化(P＞0.05),第10天的PCNA阳性细胞数明显增高(P＜0.05);MSCs治疗组再灌注后第3天PCNA阳性细胞数明显增高(P＜0.05),第10天的PCNA阳性细胞数没有明显变化(P＞0.05)。与I/R组对比,MSCs治疗组再灌注后第3天的PCNA阳性细胞数高于I/R组(P＜0.05),第10天的PCNA阳性细胞数低于I/R组(P＜0.05)。MSCs治疗组肾小管上皮细胞的分化增值较I/R组明显提前。结论1.小鼠骨髓MSCs具有多系分化潜能,体外诱导可分化为成骨细胞、脂肪细胞及内皮细胞。2.成功建立小鼠急性肾缺血再灌注损伤模型。3.小鼠骨髓MSCs移植可改善急性肾缺血再灌注损伤模型早期的肾功能,减轻肾小管上皮细胞的损伤,提高早期肾小管上皮细胞的增殖指数。4.小鼠骨髓MSCs移植治疗急性肾缺血再灌注损伤的机制可能是减轻急性期炎症反应,促进内源性肾小管上皮细胞的分化增殖。
谢晓强[4]2011年在《G-CSF动员骨髓干细胞向缺血再灌注损伤肾脏归巢并促进肾脏修复的研究》文中研究指明目的：本研究拟通过肾脏缺血再灌注损伤动物模型的研究,探讨骨髓来源的干细胞在急性肾脏损伤修复中的作用,观察骨髓来源的干细胞能否分化为肾脏实质细胞,深化对干细胞可塑性的认识；观察骨髓干细胞是否可以转化为肾祖细胞,明确肾祖细胞的来源；观察粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是否可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血再灌注损伤肾脏归巢,提高1肾脏修复的效能,为急性肾脏损伤的治疗探索新方法。方法：6周龄全身表达绿色荧光蛋白(GFP)的C57BL/6J转基因小鼠提供骨髓,6-8周龄同种无荧光标记的C57BL/6J小鼠20只作为骨髓受体。在接受骨髓移植前,所有受体小鼠接受致死剂量的γ放射线137Cs照射(放射剂量为8.5Gy)照射结束后2小时内静脉注射2×105骨髓单个核细胞。接受骨髓移植5周后,嵌合体小鼠骨髓重建情况经流式细胞仪检测确认。待骨髓重建完毕后(移植后第6周)所有小鼠均结扎左侧肾蒂30min后再开放,建立缺血再灌注动物模型。实验动物分为两组：(1)生理盐水对照组(n=10)：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射生理盐水,0.2ml/d。(2)G-CSF动员组(n=10)：缺血再灌注手术前3天至术后4天,皮下注射人重组粒细胞集落刺激因子200μg/kg/d。动员结束后第1天取外周血通过流式细胞仪检测Sca-1、c-Kit、CD34阳性的干细胞占外周血非红系细胞的比例。缺血损伤再灌注损伤1周后取肾脏标本行HE染色,采用Vyacheslav等的半定量方法评估肾小管损伤程度。观察动员组与对照组肾脏病理损伤程度的差异。用胶原酶将肾脏消化为单个细胞通过对Sca-1、c-Kit、CD34等不同干细胞抗原标志物进行荧光染色,流式细胞仪检测比较两组肾脏中干细胞含量的差异。缺血再灌注损伤4周后通过组织切片荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察骨髓来源的干细胞在肾脏内的分化情况,通过统计肾脏血管内皮细胞数量以及骨髓来源的肾祖细胞数量来验证G-CSF动员组与对照组在肾脏损伤修复方面的差异。结果：G-CSF动员后,外周血流式细胞仪检测显示,分别为Sca-1、c-Kit、CD34阳性的叁群干细胞占外周血非红系细胞的比例(3.16%±0.11%、3.78%±0.08%、6.09%±0.13%)均高于对照组(1.67%±0.10%、2.19%±0.06%、2.85%±0.14%),差异有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注损伤1周后,肾脏细胞流式细胞仪检测发现,G-CSF动员组的缺血侧肾脏中,骨髓来源并且分别表达Sca-1、c-Kit、CD34的干细胞(GFP和干细胞抗原表达双阳性)的比例(0.86%±0.05%、0.78%±0.11%、0.90%±0.08%)均高于对照组(0.51%±0.06%、0.47%±0.08%、0.43%±0.03%),差异有统计学意义(P<0.05)；同时动员组的缺血侧肾脏中骨髓来源GFP阳性细胞的百分比(13.05%±1.14%)也明显高于对照组(7.75%±0.58%),差异有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注损伤4周后的肾脏组织切片经CD31、SMA、Sca-1免疫荧光染色,可见骨髓来源的干细胞出现在肾小管间隙和肾小球血管簇,并分化为CD31或SMA阳性的肾脏血管内皮细胞,参与损伤后血管新生。在损伤区域的肾小管中出现骨髓来源表达GFP绿色荧光的细胞,骨髓来源的细胞可以分化为肾小管上皮细胞,参与了肾小管损伤的修复。在肾脏间质中还可以观察到GFP和Sca-1双阳性的骨髓来源的肾祖细胞。通过对比G-CSF动员组和对照组的肾脏,发现动员组在缺血缺血再灌注损伤1周后肾小管损伤程度评分分值(1.46±0.05)明显低于对照组(2.32±0.16)差异有统计学意义(P<0.05)。损伤4周后G-CSF动员组的肾脏中表达血管内皮标志CD31的细胞数目(31.30±0.42)高于生理盐水对照组(20.05±0.58)差异有统计学意义(P<0.05)。通过对骨髓来源的肾祖细胞的计数发现G-CSF动员组中GFP与Sca-1双阳性的细胞数(6.00±0.82)多于对照组(3.50±0.58),差异有统计学意义(P<0.05)结论：(1)骨髓来源的干细胞可以参与损伤后肾脏的血管新生、肾小管细胞再生以及肾脏修复；(2)G-CSF可以有效动员骨髓干细胞进入外周血并向缺血肾脏归巢；(3)G-CSF动员可以减轻小鼠缺血肾脏的组织病理学损伤程度；(4)G-CSF动员可以通过促进缺血肾脏内血管新生及骨髓来源的细胞分化为肾祖细胞,提高肾脏修复的效能；(5)骨髓来源的细胞可以分化为肾脏干细胞,即肾祖细胞,证实了部分肾祖细胞可能来源于肾脏以外的推测。
洪志华[5]2007年在《淮山药预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究》文中研究指明目的:通过制作SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,探讨淮山药灌胃预处理在预防和减轻肾脏缺血再灌注损伤和促进肾脏再生修复方面的作用。方法:1.选用60只3～4周龄雄性SD大鼠进行动物实验。实验动物造模前2周,所有SD大鼠腹腔内注射BrdU 100mg/kg体重,连续3天,然后随机分4组。正常对照组(N,n=6)大鼠常规麻醉后行剖腹手术,下腔静脉采血和收获肾脏标本;假手术组(SO,n=6)大鼠常规麻醉后行剖腹手术,游离双侧肾蒂血管后不作结扎,45min后采血和收获肾脏标本;缺血再灌注淮山药灌胃预处理组(I/R淮山药组,n=24)和缺血再灌注无菌生理盐水灌胃对照组(I/R生理盐水组,n=24)大鼠在常规麻醉后行剖腹手术,游离双侧肾蒂血管后用无损伤动脉夹阻断双肾血流45min后,恢复血流、关闭腹腔。分别于再灌注2h、12h、24h、48h四个时间点随机选I/R淮山药组和I/R生理盐水组各6只大鼠进行下腔静脉采血和收获肾脏标本。动物造模前5天:I/R淮山药组SD大鼠,用淮山药10g/kg体重灌胃,连续5天;I/R生理盐水组SD大鼠,用无菌生理盐水作为安慰剂灌胃,连续5天。2.各组实验动物血清标本应用全自动生化分析仪测定BUN、Scr,了解肾功能;MDA试剂盒TBA法检测血清MDA值;肾脏标本常规病理切片,H-E染色观察肾组织损伤程度;TUNEL法检测细胞凋亡,免疫组织化学S-P法检测细胞增殖情况,并在激光共聚焦显微镜下观察肾内BrdU阳性细胞和Pax-2阳性细胞分布情况;RT-PCR检测HGF、C-met、BMP-7、Pax-2基因表达情况。主要结果:1.肾组织损伤情况:I/R淮山药组大鼠肾脏缺血45min再灌注12h、24h、48h,组织学评分值分别为7.50±0.55、6.17±0.75、4.17±0.75,较I/R生理盐水组(分别为:8.50±0.55、7.00±0.89、5.17±0.98)明显减低,有显着性统计学差异(P﹤0.05)。在再灌注12h和24h时,两组大鼠肾小管损伤最为明显,其组织学评分较SO组(0.67±0.52)明显增高,有显着性统计学差异(P﹤0.01)。2.肾功能情况:N组Scr、BUN水平分别为23.95±3.20μmol/L、5.79±0.54mmol/L,与SO组(分别为:25.12±3.95μmol/L、6.15±0.40mmol/L)比较,均无明显差异(P﹥0.05);肾脏缺血再灌注损伤后各组Scr、BUN水平均有上升,于再灌注后12h和24h最为明显;再灌注后2h、12h、24h、48h,I/R淮山药组Scr值分别为34.23±5.08μmol/L、56.38±8.70μmol/L、81.53±10.17μmol/L、55.01±9.71μmol/L,与同时间点I/R生理盐水组(46.8±3.69μmol/L、98.70±12.37μmol/L、128.5±17.30μmol/L、80.72±11.13μmol/L)比较,有明显降低(P﹤0.05);12h、24h、48h,I/R淮山药组的BUN值分别为15.3±2.60mmol/L、19.56±3.89mmol/L、14.72±2.99mmol/L,与同时间点I/R生理盐水组(22.07±4.57mmol/L、34.75±6.32mmol/L、20.16±2.40mmol/L)比较,有明显降低(P﹤0.05)。3.组织氧化损伤和细胞凋亡情况:SO组大鼠血清MDA水平为3.65±0.98nmol/ml与N组(3.70±0.70nmol/ml)比较,无显着性统计学差别(P﹥0.05)。再灌注2h、12h、24h,I/R淮山药组大鼠血清MDA值分别为4.74±0.50nmol/ml、6.19±0.68nmol/ml、5.16±0.58nmol/ml ,与I/R理盐水组( 7.45±1.03nmol/ml、10.52±1.57nmol/ml、6.93±1.32nmol/ml)比较,峰值明显降低(P﹤0.05)。再灌注48h,I/R淮山药组的血清MDA值为5.05±0.70nmol/ml,与I/R理盐水组(5.89±1.21nmol/ml)比较,无显着性统计学差异(P﹥0.05)。肾脏再灌注2h就有凋亡细胞出现,12h时可见大量凋亡细胞脱落到肾小管腔中。再灌注12h时, I/R淮山药组凋亡细胞数为10.17±2.14/HP,较I/R生理盐水组(13.67±2.94/HP)明显减少,有显着性统计学差异(P﹤0.05)。4.细胞增殖和BrdU阳性细胞分布情况:肾缺血再灌注损伤后可见PCNA阳性细胞,且主要位于肾小管。在再灌注后2h、12h、24h、48h,I/R淮山药组PCNA阳性细胞数分别为2.67±1.21/HP、9.50±1.87/HP、14.83±2.71/HP、10.83±2.04/HP,较I/R生理盐水组(1.83±0.75/HP、7.00±1.41/HP、11.33±1.75/HP、8.50±1.05/HP)明显增多,有显着性统计学差异(P﹤0.05)。SO组大鼠肾乳头区有大量BrdU阳性细胞,很少位于肾小管壁,在再灌注后48h I/R淮山药组大鼠肾乳头区BrdU阳性细胞有较明显的减少,而肾小管壁可见较多的BrdU阳性细胞;在再灌注后24h,I/R淮山药组BrdU阳性细胞数为13.17±3.19/HP,较I/R生理盐水组(8.33±2.16/HP)和SO组(1.17±0.75/HP)均有明显增加(P﹤0.05)。5.相关基因表达情况:(1)缺血再灌注损伤后12h、24h, I/R淮山药组大鼠肾脏HGF mRNA相对表达量分别为0.51±0.10、0.46±0.09,与I/R生理盐水组(0.36±0.02、0.31±0.15)和SO组(0.28±0.05)相比有上调(P﹤0.05);缺血再灌注损伤后12h、24h I/R淮山药组大鼠肾脏C-met mRNA相对表达量分别为1.22±0.28、0.46±0.09,与I/R生理盐水组(0.86±0.08、0.31±0.15)相比有上调(P﹤0.05)。(2)BMP-7 mRNA在肾缺血再灌注损伤后开始的表达是下调的,于12h时开始上调,在再灌注损伤24h最为显着。再灌注后12h,I/R淮山药组大鼠肾脏BMP-7 mRNA相对表达量为0.6±0.09,与I/R生理盐水组(0.39±0.08)和SO组(0.42±0.07)相比有明显上调(P﹤0.05)。(3)Pax-2 mRNA在N组、SO组肾脏组织中均未见明显表达,肾缺血再灌注损伤12h后,I/R淮山药组和I/R生理盐水组大鼠肾脏Pax-2 mRNA开始有表达。同样在激光共聚焦显微镜下观察,N组、SO组大鼠肾小管壁中均未见Pax-2阳性细胞;肾缺血再灌注损伤12h时I/R淮山药组肾小管出现Pax-2阳性细胞,于再灌注后24h时I/R淮山药组可见Pax-2、BrdU双阳性标记细胞位于肾小管壁。主要结论:1.缺血再灌注可引起明显的肾脏组织结构损伤和功能损害,淮山药灌胃预处可以减轻氧化损伤和减少细胞凋亡的发生,降低了血清Scr、BUN和MDA水平,从而有效地保护了肾功能。2.淮山药灌胃预处理,提高了肾组织HGF、C-met和BMP-7基因的表达水平,调节和改善了肾脏局部微环境,从而促进了受损的肾小管细胞的再生修复和肾小管的重建。3.肾缺血再灌注损伤后,肾内BrdU持续标记的细胞参与了肾脏损伤后的再生修复过程,且一部分BrdU阳性细胞同时表达了正常情况下成体肾脏不表达的Pax-2基因。Pax-2和BrdU双阳性标记细胞可能是肾内固有的祖细胞,肾乳头区可能是肾内干细胞存在的微生态环境,即壁龛。
张中华[6]2005年在《骨髓间充质干细胞对缺血再灌注肾脏损伤的保护作用》文中研究表明目的:探讨移植的外源性骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对缺血再灌注肾损伤的保护作用。方法:取SD 雄性大鼠胫、股骨骨髓,密度梯度离心法分离MSCs , 采用4,6-联脒-2-苯基吲哚( 4 ,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI 标记。32 只雌性SD 大鼠复制缺血再灌注肾损伤模型后随机分为移植组和对照组,移植组于缺血45min 后经下腔静脉注入DAPI 标记的MSCs,对照组注入等量的生理盐水。术后每天经腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(bromodeoxyuridine, BrdU),分别于术后1 天、2 天、3 天、4天处死大鼠,留取血标本,观察血清肌苷(Cr)和尿素氮(BUN)水平。留取肾组织,荧光显微镜及免疫组化染色方法观察移植的MSCs 在肾组织中的分布及肾组织细胞的增殖状况,并采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素(Ricinus communis agglurinin,RCA)对迁移入肾脏的MSCs 分化状况进行鉴定。结果:(1)血清BUN 及Cr 水平的变化:术后第1、2 天,移植组大鼠血清BUN 水平明显低于对照组(P<0.05);第3、4 天两组间BUN 水平无显着差异(P>0.05);第1、2、3 天移植组大鼠血清Cr 水平均显着低于对照组(P<0.05)。(2)肾组织中细胞增殖状况:术后第1 天偶见BrdU 阳性细胞,第2 天移植组和对照组大鼠肾组织中均可见较多BrdU 阳性细胞,并随时
张建[7]2008年在《骨髓间充质干细胞移植及淮山药预处理对大鼠肾脏微血管损伤保护作用的实验研究》文中提出目的:应用SD大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型,探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植及淮山药灌胃预处理在对肾脏缺血再灌注损伤后微血管方面的保护作用。方法:体外实验:采用梯度离心和贴壁筛选法分离纯化MSCs,取第叁代的MSCs进行诱导。在MSCs的培养液中加入VEGF、bFGF对MSCs进行诱导,分别于0d、3d、7d、14d、21d时对诱导的MSCs细胞进行大体形态学观察、细胞组织化学染色、超微结构观察。体内试验:1.选用60只雌性SD大鼠(4～6周龄)随机分4组进行动物实验。正常对照组(N,n=6)常规麻醉后行剖腹手术下腔静脉采血和收获肾脏标本;缺血再灌注损伤组(I/R,n=18)常规麻醉后行剖腹手术,游离左侧肾蒂血管后无损伤动脉夹阻断左肾血流60min后恢复血流,关闭腹腔,再灌注后60min股静脉穿刺,输注生理盐水,再分别于再灌注6h,48h,2w后采血和收获肾脏标本;缺血再灌注损伤干细胞移植组( MSCs,n=18)游离左侧肾蒂血管后无损伤动脉夹阻断左肾血流60min后恢复血流,关闭腹腔,再灌注后60min股静脉穿刺,输注BrdU标记的MSCs细胞悬液1ml(1×106/ml)再分别于再灌注6h,48h,2w后采血和收获肾脏标本;缺血再灌注淮山药灌胃预处理联合干细胞移植组(淮山药MSCs组,n=18)动物造模前五天,用淮山药10g/kg体重灌胃,连续五天,游离左侧肾蒂血管后无损伤动脉夹阻断左肾血流60min后恢复血流,关闭腹腔,再灌注后60min股静脉穿刺,输注BrdU标记的MSCs细胞悬液1m(l1×10~6/ml)再分别于再灌注6h,48h,2w后采血和收获肾脏标本。2.应用全自动生化分析仪测定血清BUN、Scr,了解肾功能;内皮素放免药盒体外放射免疫分析法检测肾脏组织匀浆内皮素水平(ET);肾脏标本常规病理切片,H-E染色观察肾组织损伤情况;免疫组化S-P法检测细胞增殖情况, BrdU、FⅧ-RAg阳性细胞分布情况。主要结果:体外实验:MSCs细胞为纺锤形,梭形的成纤维细胞形态;加入VEGF、bFGF后可见到部分扁平宽大的长梭形细胞胞质向核收缩,变成不规则形,多角形或圆形,有些区域呈“铺路石”样征象。诱导后的MSCs做透射电镜检测,部分细胞胞浆内可观察到Weibel-Palade小体。体内实验:1﹒肾组织损伤情况:再灌注6h、48h、2w后,MSCs组、淮山药MSCs组的组织学评分(MSCs组分别为:6.63±0.54、6.20±0.28、5.48±0.49)(淮山药MSCs组分别为:5.10±0.47、5.06±0.37、4.93±0.53)较同时间点I/R组(I/R组分别为:7.35±0.56、7.50±0.93、6.23±0.33)明显减低,有显着性统计学差异(P﹤0.05);淮山药MSCs组的组织学评分于再灌注后6h、48h较同时间点MSCs组明显减低,有显着性统计学差异(P﹤0.05) ,缺血再灌注损伤2w后,两组的组织学评分比较相近,无显着性统计学差异(P>0.05)。2.肾功能情况:N组血清Scr、BUN水平(分别为43.24±2.58μmol/L、6.48±0.64mmol/L);肾脏缺血再灌注损伤6h后各组Scr、BUN水平均有上升,MSCs组(61.93±5.05μmol/L、11.05±1.32 mmol/L)、淮山药MSCs组(50.40±3.38μmol/L、8.82±0.49 mmol/L)与I/R组(75.38±4.53μmol/L、18.72±0.59 mmol/L)相较明显降低,有显着性统计学差异(P﹤0.05),且淮山药MSCs组与MSCs组比较也有显着性统计学差异(P﹤0.05);缺血再灌注损伤48h后仅I/R组(79.09±3.32μmol/L、15.37±1.69 mmol/L)较N组有明显上升(P﹤0.05),MSCs组(46.76±2.64μmol/L、5.63±0.82 mmol/L)、淮山药MSCs组(44.33±5.51μmol/L、5.70±1.06 mmol/L)较N组无显着性统计学差异(P>0.05);缺血再灌注损伤2w后I/R组(45.63±2.09μmol/L、6.10±0.53 mmol/L)、MSCs组(42.55±1.70μmol/L、5.88±0.52 mmol/L)、淮山药MSCs组(47.23±1.95μmol/L、5.80±0.59 mmol/L)较N组均无显着性统计学差异(P>0.05)。3.肾血管内皮功能情况:N组肾组织匀浆ET水平为158.25±15.13 pg/ml;缺血再灌注损伤6h后I/R组、MSCs组、淮山药MSCs组ET水平分别为258.30±25.04 pg/ml、203.40±6.01pg/ml、168.56±12.12pg/ml,I/R组、MSCs组肾组织匀浆ET值较N组显着增高(P﹤0.01),但淮山药MSCs组肾组织匀浆ET值却较N组无显着性统计学差异(P>0.05);缺血再灌注损伤48h后:I/R组、MSCs组、淮山药MSCs组ET水平分别为154.61±16.12 pg/ml、144.48±21.34pg/ml、158.25±22.91pg/ml较N组肾组织匀浆ET的水平无显着性统计学差异(P>0.05)。4.细胞增殖和BrdU、FⅧ-RAg阳性细胞分布情况:再灌注6h、48h、2w后,MSCs组、淮山药MSCs组的PCNA阳性细胞数分别为(MSCs组:22.42±0.68/HP、24.60±0.84/HP、22.36±0.85/HP)(淮山药MSCs组:30.17±0.63/HP、36.52±1.17/HP、32.01±0.42/HP)较同时间点I/R组(I/R组:7.06±0.28/HP、17.64±0.72/HP、19.03±0.41/HP)明显增多,有显着性统计学差异(P﹤0.05);淮山药MSCs组的PCNA阳性细胞数于再灌注后6h、48h、2w较同时间点MSCs组明显增多,有显着性统计学差异(P﹤0.05)。再灌注后6h、48h于肾间质可见散在BrdU阳性的细胞,再灌注后2w可见少量BrdU染色阳性细胞位于肾小球,肾间质微血管。再灌注6h、48h、2w后,MSCs组、淮山药MSCs组的FⅧ-RAg阳性细胞数分别为(MSCs组:23.98±0.44/HP、22.94±1.50/HP、22.10±0.78/HP)(淮山药MSCs组:34.96±0.56/HP、30.19±0.54/HP、27.42±0.77/HP)较同时间点I/R组(I/R组:17.82±0.58/HP、18.23±0.49/HP、20.40±0.66/HP)明显增多,有统计学差异(P﹤0.05);淮山药MSCs组的FⅧ-RAg阳性细胞数于再灌注后6h、48h、2w较同时间点MSCs组明显增多,有显着性统计学差异(P﹤0.05)。主要结论:在体外MSCs的培养液中加入VEGF、bFGF对MSCs进行诱导,可以使MSCs诱导为血管内皮细胞。体内实验结果表明MSCs移植对急性肾缺血再灌注损伤具有治疗作用;淮山药灌胃预处理合并MSCs移植对急性肾缺血再灌注损伤具有协同治疗作用。部分MSCs在体内可分化形成肾血管内皮细胞。
刘先锋[8]2004年在《骨髓干细胞在小鼠急性肾小管坏死修复中的作用》文中进行了进一步梳理背景:传统的急性肾小管坏死修复理论认为,肾小管的重建依赖于坏死区周围存活的肾小管上皮细胞,这些细胞经过去分化、增殖和分化成熟等过程修复坏死的肾小管,重建其组织结构和功能。近年来随着对干细胞研究的深入,发现成体组织内存在着一些被称为成体干细胞的多能干细胞,这些干细胞具有多向分化的能力,甚至可以跨越谱系界限分化成其它组织细胞,在损伤修复中具有重要意义。骨髓中含有丰富的成体干细胞,最近有数项研究认为骨髓来源的干细胞可以分化成肾小管上皮细胞,参与急性肾小管坏死的修复,但目前对这一结论尚有争议。目的:本研究拟通过动物模型的研究,观察骨髓来源的干细胞能否分化成肾小管上皮细胞,深化对骨髓干细胞可塑性的认识,探讨骨髓干细胞在急性肾小管坏死修复中的作用,丰富急性肾小管坏死修复的理论。方法:绿色荧光蛋白标记的C57BL/6转基因小鼠提供骨髓,同种无荧光标记的C57BL/6小鼠分为七组:(1)正常对照组:观察正常小鼠血液学指标和肾组织结构。(2)甘油注射组:以50%甘油肌肉注射的方法建立急性肾小管坏死模型,建模后第3d、7d、14d、28d分别取肾脏标本,观察甘油诱导小鼠急性肾小管坏死的病程演变。(3)缺血再灌注组:手术夹闭小鼠单侧肾蒂30min再开放建立单侧肾脏缺血再灌注损伤模型,建模后第3d、7d、14d、28d分别取肾脏标本,观察双侧肾脏病理变化。(4)全身照射组:经致死剂量γ射线全身均匀照射后不接受骨髓移植,一周内处死,观察γ射线照射对小鼠肾脏组织结构和功能的影响。(5)骨髓移植组:照射后接受骨髓移植,分别在移植后第56d、84d处死,观察骨髓干细胞在无损伤的小鼠肾脏中的分化。(6)骨髓移植+甘油注射组:骨髓移植后第56d甘油肌肉注射建立急性肾小管坏死模型,观察骨髓来源干细胞在急性肾小管坏死修复中的作用。(7)骨髓移植+缺血再灌注组:骨髓移植后第56d建立单侧缺血再灌注损伤模型,对照观察供体骨髓干细胞在双侧肾脏的分化情况。骨髓移植受体小鼠的骨髓重建经血液常规检查和流式细胞仪检测确认。并采用荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察绿色荧光在骨髓移植小鼠肾脏的分布及数量。
张婷[9]2006年在《骨髓间充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究》文中研究表明目的:急性肾功能衰竭(Acute renal failure, ARF)是临床常见之危重症,死亡率较高,目前治疗方面仍缺乏有效的手段。缺血再灌注损伤引起的急性肾小管坏死是ARF的常见病因,其病理特征为肾小管梗阻、肾小管滤过液回漏和滤过功能障碍。因此促进肾小管上皮的再生和肾小管结构的重建是治疗ARF的关键。本实验应用缺血再灌注肾脏匀浆和全反式维甲酸对大鼠的骨髓间充质干细胞(mesenchyml stem cells, MSCs)进行诱导,探讨体外诱导MSCs向肾小管上皮样细胞分化的可能性;同时对缺血再灌注肾脏损伤的大鼠行MSCs静脉移植治疗,观察MSCs在大鼠体内的分布情况以及对肾脏修复的促进作用。方法: 1.体外实验:采用梯度离心和贴壁筛选法分离纯化MSCs,取第叁代的MSCs进行诱导。在MSCs的培养液中加入全反式维甲酸,终浓度为5μM;同时将装有缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆的插入式嵌合培养皿置于MSCs的培养板中,以此对MSCs进行诱导,分别于0d、3d、5d、7d时对诱导的MSCs细胞进行大体形态学观察、超微结构观察、细胞组织化学染色、胞浆内第18型角蛋白(CK18)流式细胞仪测定。
代静澜, 叶本兰[10]2005年在《小鼠骨髓源性干细胞迁移到缺血再灌注损伤肾脏内表达CK18和RCA的观察》文中认为目的 观察小鼠骨髓源性干细胞 (bonemarrowderivedstemcells ,BMSCs)在缺血再灌注 (I/R)损伤肾脏内表达细胞角蛋白 18(Cytokeratin 18,CK18)和蓖麻凝集素 (Ricinuscommunis ,RCA)的情况。方法 制备BALB/c雌鼠肾脏缺血再灌注损伤模型 ,亚致死剂量 60 Co照射后通过尾静脉移植同系雄鼠骨髓细胞 ,于移植后不同时相点采用PCR检测受体鼠骨髓中Sry基因表达 ,免疫组化染色结合Y染色体荧光原位杂交 (Y FISH)观察受体肾脏中骨髓源性干细胞的分化情况。结果 骨髓移植 15d后 ,PCR检测到受体鼠骨髓中有Sry基因表达 ;骨髓移植 3 0d后 ,连续切片免疫组化染色结合Y FISH观察到受体鼠肾脏中存在Y+ /CK18+ 和Y+ /RCA+ 细胞。结论 静脉移植的骨髓源性干细胞可迁移到I/R损伤肾脏 ,并在局部微环境诱导下表达肾小管上皮细胞的表型特征CK18和RCA。
参考文献：
[1]. 小鼠骨髓干细胞在缺血再灌注损伤肾脏内分化的研究[D]. 代静澜. 第叁军医大学. 2004
[2]. 缺血性损伤肾脏中骨髓来源肾脏干细胞的分离、体外培养和鉴定[D]. 冯国伟. 天津医科大学. 2012
[3]. 骨髓间充质干细胞治疗急性肾缺血再灌注损伤的研究[D]. 刘真真. 郑州大学. 2009
[4]. G-CSF动员骨髓干细胞向缺血再灌注损伤肾脏归巢并促进肾脏修复的研究[D]. 谢晓强. 天津医科大学. 2011
[5]. 淮山药预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D]. 洪志华. 苏州大学. 2007
[6]. 骨髓间充质干细胞对缺血再灌注肾脏损伤的保护作用[D]. 张中华. 江西医学院. 2005
[7]. 骨髓间充质干细胞移植及淮山药预处理对大鼠肾脏微血管损伤保护作用的实验研究[D]. 张建. 苏州大学. 2008
[8]. 骨髓干细胞在小鼠急性肾小管坏死修复中的作用[D]. 刘先锋. 第二军医大学. 2004
[9]. 骨髓间充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究[D]. 张婷. 苏州大学. 2006
[10]. 小鼠骨髓源性干细胞迁移到缺血再灌注损伤肾脏内表达CK18和RCA的观察[J]. 代静澜, 叶本兰. 第叁军医大学学报. 2005
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