埃博拉病毒VP35蛋白三磷酸核苷水解酶与类解旋酶活性研究

论文摘要

埃博拉病毒是丝状,有包膜的不分节负链RNA病毒（NNSVs）,属于单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales）,丝状病毒科（Filoviridae）,埃博拉病毒属（Ebolavirus）。埃博拉病毒是生物安全等级4级的病原体,对于人类有着高致病率和高致死率（25-90%）。对于包括NNSVs在内的RNA病毒来说,病毒RNA都有多个顺式作用元件在病毒RNA的复制、转录、翻译等过程起着至关重要的作用。与细胞内的RNA相似,这些高度结构化的RNA元件需要正确的折叠或重塑,才能行使正确的功能。因为RNA分子的生化特性,这一过程极具挑战性,需要多个病毒或细胞内的RNA重塑蛋白（如RNA解旋酶和RNA分子伴侣）参与。这些RNA重塑蛋白在病毒的生命周期里是必不可少的,病毒的有效复制需要它们的关键催化活性。然而,到目前为止,丝状病毒甚至是NNSVs都没有报道具有RNA解旋酶或分子伴侣活性的相关蛋白。因此,丝状病毒或NNSVs的生命周期是否需要这类蛋白的参与仍然未知,阻碍了我们对这一大群重要病原的了解,也阻碍了相关抗病毒药物的研发。丝状病毒编码的VP35蛋白与其他NNSVs的P蛋白功能类似,是一个多功能蛋白。VP35是丝状病毒的病毒聚合酶L蛋白的主要辅助因子,参与到病毒的基因组复制转录中;同时,VP35被报道具有促进病毒衣壳组装、拮抗干扰素通路及抑制RNA干扰（RNAi）的功能。在本论文中,我们通过昆虫杆状病毒表达系统真核表达了埃博拉病毒VP35重组蛋白,并发现其具有NTPase与类解旋酶（helicase-like）活性,能水解ATP、GTP、UTP与CTP,并能介导双链RNA底物的解旋。此外,我们也对VP35的NTPase及类解旋酶的生化特性与最优反应条件进行了进一步的解析,并确定VP35的解旋活性同时需要其NTPase活性与dsRNA结合活性。我们进一步的研究发现:一种在临床用于治疗Eaton-Lambert综合征的小分子药物盐酸胍（Guanidine HCl,GuHCl）可以在体外试验中有效抑制埃博拉病毒VP35的NTPase和解旋活性,并能在人源细胞中抑制埃博拉病毒微基因组复制子（minigenome）的复制和转录。本论文的研究在丝状病毒科（Filoviridae）以及NNSVs中首次揭示了具有NTPase与类解旋酶活性的病毒蛋白,并发现了对其具有抑制效果的小分子药物,拓展了我们对丝状病毒与NNSVs中RNA重塑蛋白的了解,为后续针对埃博拉病毒与丝状病毒的抗病毒药物研发提供了新的靶标与思路。

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论文创新点

中文摘要

Abstract

1 前言

1.1 不分节负链RNA病毒（NNSVs）

1.1.1 NNSVs的保守基因组和病毒颗粒的组成

1.1.2 NNSVs的病毒复制循环

1.1.3 NNSVs的 P（VP35）蛋白在复制中的作用

1.1.4 丝状病毒科

1.1.5 埃博拉病毒

1.1.6 丝状病毒VP35 蛋白的研究进展

1.1.7 埃博拉病毒的微基因组（minigenome）

1.2 RNA重塑蛋白

1.2.1 RNA解旋酶及其结构

1.2.2 体外研究 RNA 解旋酶的相关实验

1.2.3 病毒编码的RNA解旋酶

1.2.4 RNA分子伴侣

1.2.5 病毒编码的RNA分子伴侣

1.2.6 研究 RNA 分子伴侣的相关实验

2 埃博拉病毒VP35 蛋白的质粒构建与蛋白纯化

2.1 前言

2.2 实验材料与实验方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果

2.3.1 埃博拉病毒VP35 的质粒构建

2.3.2 埃博拉病毒VP35 蛋白的表达、纯化与鉴定

2.4 讨论

3 埃博拉病毒VP35的NTPase活性研究。

3.1 前言

3.2 实验材料与实验方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.3 实验结果

3.3.1 磷酸根标准曲线的绘制结果

3.3.2 埃博拉病毒VP35 蛋白具有NTPase活性

3.3.3 埃博拉病毒VP35 蛋白能结合ATP

3.3.4 埃博拉病毒VP35 蛋白NTPase活性的最佳反应条件

3.4 讨论

4 埃博拉病毒VP35 蛋白具有解旋活性

4.1 前言

4.2 实验材料与实验方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 实验结果

4.3.1 埃博拉病毒VP35 蛋白具有dsRNA结合活性

4.3.2 埃博拉病毒VP35 蛋白具有解旋活性

4.3.3 埃博拉病毒VP35 蛋白的解旋活性具有方向性

4.3.4 埃博拉病毒VP35 蛋白解旋的底物特异性

4.3.5 VP35 蛋白体外解旋反应的最佳生化条件

4.4 讨论

5 埃博拉病毒VP35 蛋白的NTPase活性区域和dsRNA结合位点对于解旋活性的影响

5.1 前言

5.2 实验材料与实验方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验方法

5.3 实验结果

5.3.1 NTPase活性对于VP35 的解旋活性是必需的

5.3.2 dsRNA结合活性对于VP35 的解旋活性是必需的

5.4 讨论

6 GuHCl对于埃博拉病毒VP35 蛋白的影响

6.1 前言

6.2 实验材料与实验方法

6.2.1 实验材料

6.2.2 实验方法

6.3 实验结果

6.3.1 GuHCl影响VP35的NTPase活性和解旋活性

6.3.2 GuHCl能抑制埃博拉病毒minigenome复制

6.3.3 GuHCl不影响VP35 其他功能

6.4 讨论

7 课题研究讨论

研究总结

参考文献

攻博期间发表和待发表的科研成果

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 舒婷

导师: 周溪

关键词: 埃博拉病毒,病毒蛋白,活性,解旋活性

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 武汉大学

分类号: R373

总页数: 93

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埃博拉病毒VP35蛋白三磷酸核苷水解酶与类解旋酶活性研究

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