灰葡萄孢BcPDR1基因调控致病力的分子机制

论文摘要

本实验室前期获得了灰葡萄孢致病基因BcPDR1,明确了该基因正调控病菌的生长、发育和致病力。为明确BcPDR1调控病菌致病力的分子机制,本研究利用PCR和Western blot技术,检测BcPDR1的编码功能;利用Pull down和酵母双杂交技术,对BcPDR1蛋白的互作蛋白进行了筛选与鉴定;利用数字基因表达谱、qRT-PCR技术以及酶活检测试剂盒,对受BcPDR1影响的过氧化物酶家族基因和胞壁降解酶基因进行了筛选与鉴定;利用qRT-PCR及双基因突变技术,明确了BcPDR1与病菌cAMP和MAPK信号途径的关系。主要研究结果如下:1.灰葡萄孢BcPDR1基因的编码功能研究。利用BcPDR1基因的特异性引物,对灰葡萄孢野生型菌株的cDNA和基因组DNA进行PCR扩增,结果均获得了单一条带,初步确定了BcPDR1的转录功能;利用Western blot技术,用GST Tag antibody、GFP Tag antibody、BcPDR1 antibody分别对体外诱导表达的BcPDR1-GST蛋白、回复突变体CE的总蛋白以及野生型菌株BC22和回复突变体CE的总蛋白进行检测。结果所有检测样本均获得了单一的阳性条带,与目的蛋白大小一致,表明BcPDR1具有蛋白的编码功能。2.灰葡萄孢BcPDR1互作蛋白的筛选与鉴定。利用Pull down技术,初步筛选获得了216个BcPDR1蛋白的候选互作蛋白;进一步利用生物信息学分析,筛选出12个候选互作蛋白PPDK、MDAR1、MDAR2、IMD1、PDC2、NADP-ME2、EDA9、SHM2、AIP12、U88A1、2AB2B和RAD2C。利用酵母双杂交技术,对候选互作蛋白进行鉴定。结果发现,与阴性对照相比,转化AD-BcPDR1+BD-IMD1、AD-BcPDR1+BD-SHM2和AD-BcPDR1+BD-AIP12以及BD-BcPDR1+AD-IMD1、BD-BcPDR1+AD-SHM2、BD-BcPDR1+AD-AIP12的酵母细胞在二缺（-Leu/-Trp）、三缺（-Leu/-Trp/-His）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上均可以正常生长,表明BcPDR1与IMD1、SHM2和AIP12在酵母细胞中直接互作,而共转化了BcPDR1与其他候选互作蛋白组合的酵母细胞在二缺（-Leu/-Trp）上生长状态良好,而在三缺（-Leu/-Trp/-His）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基上均不能正常生长,表明它们不能在酵母细胞中直接互作。3.灰葡萄孢BcPDR1差异表达基因的筛选与鉴定。利用数字基因表达谱技术,筛选出933个受BcPDR1影响的差异表达基因,对差异表达基因的GO富集分析发现,差异表达基因主要集中在biological process的growth（GO:0040007）、signaling（GO:0023052）,molecular function的transporter（GO:0005215）、nucleic acid binding transcription factor（GO:0001071）、enzyme regulator（GO:0030234）、translation regulator（GO:0045182）等方面。利用表达谱数据,对差异表达的14个胞壁降解酶和29个过氧化物酶基因的表达水平进行分析,发现胞壁降解酶基因Bcpg5、Bcpgx1、Bcpg4、Bcams1、Bcmnl1在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcpme5、Bcpg3、Bcpme1、Bcpg6、Bcpg1在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE;过氧化物酶基因BccatA、Bcprd8、Bccat3、BcppoA90、Bcprd7、Bcprd11、Bcprx3、Bccat4、Bcprd2、Bcprd5、Bcprx7在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcprx9、Bcprd1、Bcprd4、Bcprx8、Bcprd9、Bcccp2、Bcprd10在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用Real-time PCR技术,对14个胞壁降解酶基因的表达水平进行分析。结果发现,胞壁降解酶基因Bcpg5、BccutA、Bcpgx1、Bcams1、Bcmnl1、BccutB在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,而基因Bcmns1、Bcrot2、Bcpme2、Bcpg1、Bcpg3、Bcpme1、Bcpg6、Bcpg4在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用酶活检测试剂盒,检测灰葡萄孢野生型BC22和BcPDR1三个突变体中胞内胞壁降解酶的酶活性。结果发现,野生型BC22和回复突变体CE中多聚半乳糖醛酸酶（PMG）、果胶酶（PG）、纤维素酶（CX）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果胶甲基反式消除酶（PMTE）的酶活性均显著高于突变体BCt89和ΔBcPDR1。表明BcPDR1正调控胞内胞壁降解酶的活性。利用Real-time PCR技术,对29个过氧化物酶基因的表达水平进行分析。结果发现,过氧化物酶基因Bcprx4、Bccat5、Bcgpx3、Bcprd3、Bcprx9、Bcprd1、Bcprx1、Bcccp1、Bcprd4、Bcprx8、Bcprd9、BcnoxA、Bcprd6、Bcccp2、Bccat2、Bccat6、BcppoA80、Bcprd10在突变体BCt89和ΔBcPDR1中的表达水平明显高于野生型BC22和回复突变体CE,而基因BccatA、Bcprd8、BcppoA90、Bcprd7、Bcprd11、Bccat4、Bcprd2、Bcprx7在野生型BC22和回复突变体CE中的表达水平明显高于突变体BCt89和ΔBcPDR1,与数字表达谱的分析结果基本一致。4.灰葡萄孢BcPDR1与cAMP、MAPK信号途径之间的关系研究。利用cAMP、MAPK信号途径抑制剂SQ22536、U0126,分析灰葡萄孢野生型BC22、突变体BCt89、ΔBcPDR1和CE对信号途径抑制剂的敏感性,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1对抑制剂SQ22536和U0126均不敏感,受抑制的程度均明显低于野生型BC22和回复突变体CE。利用HPLC方法,检测BcPDR1基因突变体中cAMP的含量,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1中cAMP含量均明显高于野生型BC22和回复突变体CE。利用Real-time PCR技术,检测BcPDR1突变体中cAMP和MAPK信号途径关键基因的表达水平,发现突变体BCt89和ΔBcPDR1中cAMP信号途径关键基因bcg1、bcg2、bcg3、BAC、BcpkaR、Bcpka1、Bcpka2和MAPK信号途径关键基因Btp1、BOS1、BcCDC4、BcRAC、bmp1、bmp3、BcSaK1、BAP1的表达水平均明显高于野生型BC22和回复突变体CE,而MAPK信号途径关键基因BcATF1的表达水平明显低于野生型BC22和回复突变体CE。表明灰葡萄孢BcPDR1负调控cAMP、MAPK信号途径关键基因bcg1、bcg2、bcg3、BAC、BcpkaR、Bcpka1、Bcpka2、Btp1、BOS1、BcCDC4、BcRAC、bmp1、bmp3、BcSaK1、BAP1的表达,正调控MAPK信号途径关键基因BcATF1的表达。利用Real-time PCR技术,检测cAMP和MAPK信号途径关键基因的RNAi突变体中BcPDR1基因的表达水平,发现cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平明显低于野生型,MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3的RNAi突变体中BcPDR1基因表达水平明显低于野生型。表明灰葡萄孢cAMP信号途径关键基因pka1、pka2、pkaR、bcg2、bcg3正调控BcPDR1基因的表达,MAPK信号途径关键基因bmp1和bmp3正调控BcPDR1基因的表达。利用双基因突变技术,获得了BcPDR1与cAMP途径关键基因Bcpka1、Bcpka2、BcpkaR、bcg2、bcg3和MAPK途径关键基因bmp1、bmp3的双基因突变体。对双基因突变体的表型和致病力进行分析,发现ΔBcPDR1/Bcpka1-OE、ΔBcPDR1/Bcpka2-OE、ΔBcPDR1/BcpkaR-OE、ΔBcPDR1/bcg2、ΔBcPDR1/bcg3、ΔBcPDR1/bmp1-OE、ΔBcPDR1/bmp3-OE的表型和致病力与突变体ΔBcPDR1相比均有不同程度的恢复。表明BcPDR1参与病菌的cAMP和MAPK信号途径。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 袁雪梅

导师: 邢继红,董金皋

关键词: 灰葡萄孢,致病力

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 河北农业大学

分类号: S432.44

DOI: 10.27109/d.cnki.ghbnu.2019.000169

总页数: 99

文件大小: 4780K

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