斑马鱼前肾突变基因的克隆及wt1a基因敲除

论文摘要

肾脏是人类重要的代谢器官,研究其发育和疾病模型具有重要意义。斑马鱼是研究器官发育重要的脊椎动物模型,具有世代周期短、繁殖数量大、胚胎透明、体外发育且易于养殖等优点。脊椎动物的肾脏在发育过程中经历三个阶段:前肾、中肾和后肾,成年哺乳动物的肾脏由后肾发育而来。人类的肾脏包含近百万个肾单位,小鼠的肾脏包含上万个肾单位,每个肾单位由肾小体和肾小管组成。脊椎动物的肾脏在调节生命活动和排除代谢废物中扮演着重要的角色,主要表现在代谢物再吸收,调节酸碱平衡和分泌激素。肾脏的基本功能单位是肾单元,它由肾小球和肾小管组成,连接到集合管。肾脏行使过滤和重吸收功能的方式是首先通过肾小球过滤血液中的代谢产物,然后通过肾小管、集合管等上皮细胞再回收离子和小分子物质。成年斑马鱼的肾脏由中肾发育而来,仅包含几百个肾单位,而前肾则只有两个肾单位组成,而斑马鱼前肾与哺乳动物的肾单位是十分相似的,分为肾小球和肾小管,并且细胞类型和分子调控机制也高度保守。因此,斑马鱼前肾是研究肾脏发育的理想模型。正向遗传筛选是发现影响组织器官正常发育新基因的有效手段。借助于化学诱导方法或物理诱变方法使雄性成鱼精原细胞产生突变,与野生型雌鱼杂交后对子代进行表型筛选,得到具有异常表型的突变家系,通过图位克隆或者全基因组测序的方法,找到突变基因,进一步进行分子机制的研究。本实验室借助于化学诱导剂ENU诱变方法使雄性成鱼精原细胞产生突变,与野生型雌鱼杂交后对子代进行表型筛选,得到具有异常表型的突变家系。通过图位克隆的方法,找到突变基因,进一步进行基因功能的研究。通过碱性磷酸酶染色和原位杂交实验观察到,V3-202-A突变体的表型为碱性磷酸酶染色肾管前段变粗,肾小球无法正常融合,但纤毛发育正常,从2dpf开始心包肿大,之后会全身水肿,耳石后透明囊泡,纯合突变体无法存活到成年,大约在7dpf开始死亡。通过Initial Mapping将突变基因定位在第3号染色体上,后续通过染色体步移（Chromosomal Walking）将突变位点缩小在约2.20mb范围内。基因敲除是斑马鱼获得突变体的一种重要的方式,可以直接通过敲除基因研究特定基因的功能。核酸内切酶是当前最常用的基因编辑工具,分别是锌指核酸酶ZFN、类转录因子效应物核酸酶TALENs和成簇规律间隔短回文重复技术CRISPR/Cas。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALENs之后,第三代基因编辑技术,更加简易高效,其工作原理是在目的基因片段上选择gRNA靶位点,Cas9 mRNA在gRNA的引导下,可实现对基因组特定位点的剪切,利用DNA自我修复时可能发生序列错配,引入插入缺失突变,导致基因阅读框改变,从而进行基因敲除。WT1（Wilms’tumor）编码锌指转录因子,是在脊椎动物和哺乳动物中高度保守的肾脏发育调控因子。人类WT1基因突变会导致性腺和肾脏发育异常,易发小儿恶性实体瘤。在小鼠中敲除Wt1基因会出现肾脏坏死、性腺和脾等器官发育缺陷。在斑马鱼中存在wt1的两个同源基因,wt1a和wt1b。斑马鱼前肾肾小球由第三体节处的中间中胚层发育而来,wt1a在肾小球发育中起重要作用,在肾脏早期发育中起到诱导足细胞分化的作用。在斑马鱼的发育过程中,wt1a和wt1b基因在心脏、肾脏、脾和性腺中均有表达,本文利用原位杂交的方法观察了wt1a、wt1b的时空表达模式,发现两个基因的表达部位有重叠但并非完全一致,wt1b的表达略晚于wt1a,两者起源于中间中胚层,随着胚胎发育会逐渐集中在肾小球区域。我们通过CRISPR/Cas9技术敲除wt1a、wt1b基因,观察到纯合的wt1a突变体在3.5dpf开始心包肿大,逐渐开始全身水肿,8dpf开始死亡。通过原位杂交实验,发现在纯合的突变体中wt1a几乎无表达,足细胞的标记分子podocin和nephrin也无表达,因此可知在斑马鱼中敲除wt1a基因可导致肾小球发育受损,足细胞发育缺失。同时我们做了各肾管节段化的原位杂交实验,分别有全肾管的marker,cdh17;肾管前段部分的marker,ae2;标记肾管DE区域的marker,slc12a1;肾管DL区域的marker,slc12a3,均表达正常,以上数据显示在wt1a-/-的斑马鱼胚胎中肾小球发育缺失而肾管发育正常。

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摘要

Abstract

第1章文献综述

1.1 斑马鱼

1.2 肾脏的结构与发育

1.2.1 肾脏的结构

1.2.2 斑马鱼肾脏的发育

1.2.3 wt1、pax2a、osr1 在肾脏发育过程中的功能

1.3 ENU筛选

1.4 MO基因敲降

1.5 斑马鱼常用的基因编辑手段

1.6 图位克隆

1.7 肾脏疾病

1.7.1 常染色体隐形多囊肾疾病

1.7.2 常染色体显形多囊肾疾病

1.7.3 慢性肾脏病

1.7.4 足细胞病

第2章引言

第3章材料与方法

3.1 实验动物与饲养

3.2 实验试剂、仪器及耗材

3.2.1 实验试剂及配制

3.2.2 实验仪器

3.2.3 实验耗材

3.3 试验方法

3.3.1 斑马鱼基因组DNA的提取

3.3.2 质粒重组

3.3.3 RNA探针的合成与提纯

3.3.4 斑马鱼全胚胎原位杂交WISH（Whole Mount in situ Hybridization）

3.3.5 碱性磷酸酶底物染色（AP staining）

3.3.6 免疫组织化学染色IHC（Immunohistochemistry）

3.3.7 斑马鱼total RNA的提取

3.3.8 利用CRISPR/Cas9 技术敲除斑马鱼wt1a、wt1b基因

3.3.9 Mapping家族的建立

第4章实验结果

4.1 实验结果

4.1.1 突变体图位克隆及表性分析

4.1.2 建立Mapping家族

4.1.3 图位克隆

4.2 利用CRISPR/Cas9 技术敲除wt1a、wt1b基因

4.2.1 wt1a、wt1b基因的表达模式

4.2.2 合成wt1a、wt1b gRNA和 cas9 mRNA

4.2.3 斑马鱼中wt1a和wt1b基因敲除靶位点有效性验证

4.2.4 构建斑马鱼wt1a、wt1b突变体

4.2.5 敲除wt1a基因对斑马鱼胚胎发育的影响

第5章结论

5.1 突变体的图位克隆

5.2 在斑马鱼中敲除wt1a、wt1b基因

第6章讨论

6.1 V3-202-A突变体突变位点未找到

6.2 wt1a、wt1b基因相关功能研究

6.3 实验方法的总结

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 柳怡楠

导师: 阮华

关键词: 斑马鱼,前肾,图位克隆,基因敲除

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q78

总页数: 70

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