一、端粒酶反义RNA转染促进膀胱癌T24细胞凋亡的研究（论文文献综述）
杨宇[1]（2020）在《长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究》文中研究表明研究背景膀胱癌（Bladder cancer）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,属于全球发病率第9大癌症。据报统计每年全世界约有40万患者被诊断出患有膀胱癌,导致15万人死亡。膀胱癌的主要治疗方法包括外科手术结合放疗或化学疗法等。由于其高复发率和转移率,该病的5年生存率仍然很低。因此,明确膀胱癌进展的分子机制并开发新的治疗策略具有重要的社会价值。长链非编码RNA属于非编码RNA家族中的一员,其长度200个以上核苷酸。随着RNA-seq的广泛应用,在各种癌症中发现了成千上万的LncRNA的异常表达或突变。许多研究已经证实有些lncRNA的异常表达与肿瘤的进展有着密切的关系。在膀胱癌中已经发现了多种lncRNA发挥作用。长链非编码RNA SLC04A1-AS1（SLC04A1 antisense RNA1）属于溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员4A1（solute carrier organic anion transporter family member 4A1,SLC04A1）的反义RNA。膀胱癌中对SLC04A1-AS1的功能的研究却鲜有报道。本研究中,我们旨在研究SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能,并且寻找其可能靶向的miRNA以及可能介导的信号通路,探索其作为潜在的膀胱癌生物标志物和癌症治疗靶点的可能性,明确其在膀胱癌中的作用,为后期针对临床膀胱癌的诊断、防治提供新的思路及解决途径。研究目的1、探索其称为潜在的膀胱癌预后生物标志物的潜力。2、明确SLC04A1-AS1在膀胱癌中的生物学功能。3、探索SLC04A1-AS1在LncRNA-miRNA-mRNA网络中的分子作用机制。研究方法第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究1、将58例临床病人的膀胱癌组织和癌旁正常组织,分别提取RNA,运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织中SLC04A1-AS1的表达水平。另外运用RT-qPCR分别检测人膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4,以及SV-HUC-1人膀胱上皮永生化细胞中SLC04A1-AS1的表达水平。2、收集膀胱癌病人的临床信息,随访时间等生存资料。将病人根据SLC04A1-AS1的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析,检验两组终点（生存期或生存率）的差异有无显着性。3、设计并合成SLC04A1-AS1的shRNA,利用慢病毒介导的RNA干扰技术在膀胱癌细胞EJ、T24中沉默（敲低）SLC04A1-AS1后观察膀胱癌细胞的表型的变化。进行CCK-8细胞活力检测,克隆形成实验和Transwell迁移和侵袭能力检测。4、利用裸鼠成瘤实验,观察沉默（敲低）SLC04A1-AS1后裸鼠体内膀胱癌生长的变化。第二部分SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系1、利用生物信息学分析 miRDB 数据库（http://mirdb.org/miRDB/index.html）预测 SLC04A1-AS1 的 miRNA。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、人膀肮癌细胞系中miR-335-5p的表达水平。3、将病人根据miR-335-5p的表达水平分为高表达组和低表达组,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平,进行了相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中SLC04A1-AS1的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默（敲低）SLC04A1-AS1后miR-335-5p的表达水平的变化。6、进行荧光素酶报告基因实验,验证SLC04A1-AS1和miR-335-5p是否互作。第三部分:SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达1、利用生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因。2、运用RT-qPCR分别检测膀胱癌组织和癌旁正常组织、膀胱癌细胞系OCT4的表达水平。3、将病人根据OCT4的表达水平分为高表达组和低表达组,两组平行对照设计,运用Kaplan-Meier test进行生存分析。4、根据临床样品中SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平,miR-335-5p与OCT4的表达水平,进行相关性分析,分析两者的线性关系。5、利用人工合成的miR-335-5p mimics观察对EJ和T24细胞中OCT4的表达的影响;另外RT-qPCR检测沉默（敲低）SLC04A1-AS1后OCT4的表达水平的变化。6、荧光素酶报告基因实验检测包含OCT4 WT报告质粒或Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性以验证OCT4和miR-335-5p是否互作。7、在沉默SLC04A1-AS1的膀胱癌细胞EJ、T24中转染过表达OCT4质粒,观察并利用相关实验技术检测膀胱癌细胞的表型的变化包括细胞增殖、克隆形成、细胞的克隆形成能力。8、裸鼠成瘤实验,观察过表达OCT4和沉默SLC04A1-AS1同时处理的膀胱癌细胞在裸鼠体内形成肿瘤的生长变化。研究结果第一部分SLC04A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究RT-qPCR检测显示SLC04A1-AS1在膀胱癌组织中的表达水平异常升高,是癌旁正常组织的2.7倍,统计学分析显示具有显着性差异（P<0.05）。SLC04A1-AS1在三种膀胱癌细胞系EJ、T24和RT4中表达也显着升高,分别是正常SV-HUC-1细胞中表达水平的3.84倍、4.37倍、2.05倍（P<0.05）。生存分析结果显示SLC04A1-AS1表达水平较高的患者,其总生存时间（Overall survival,OS）相对于SLC04A1-AS1表达水平较低者短;SLC04A1-AS1高表达组中位生存期（Median Survival Time）为40.3个月。表示膀胱癌者的总生存时间与SLC04A1-AS1表达有显着的负相关性。SLC04A1-AS1的表达水平和病人的年龄、性别等临床参数无关,和膀胱癌的病理T分期以及淋巴结转移呈现正相关。沉默SLC04A1-AS1（siSLC04A1-AS1）的EJ和T24的细胞活力显着降低,只有对照组的54.5%、52.2%（P<0.05）。在EJ和T24中沉默SLC04A1-AS1,细胞的克隆形成率显着降低,为对照组的37.07%、51.43%（P<0.05）。沉默SLC04A1-AS1后的胱癌细胞EJ和T24的迁移和侵袭数量也明显减少:沉默处理后的EJ的细胞迁移率为（55.33±10.26）%,为对照组的58.24%。沉默处理后的T24的细胞率迁移为（57.33±11.24）%,为对照组的54.08%（P<0.05）。在EJ细胞中SLC04A1-AS1沉默处理后的侵袭细胞数为（50.67±16.70）%,为对照组的52.23%。SLC04A1-AS1沉默处理后的T24的侵袭细胞数为（55±8.54）%,为对照组的59.35%（P<0.05）。裸鼠成瘤实验显示沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积在14天、21天、28天时比对照组裸鼠的膀胱癌体积更小;在28天时,对照组肿瘤体积是（672.67±97.90）mm3,沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是（306±66.78）mm3。在28天时沉默SLC04A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是（329.33±130.70）mg,沉默组的肿瘤质量显着减小,为对照组的46.60%。第二部分:SLC04A1-AS1与靶标miR-335-5p的关系生物信息学分析miRDB预测SLC04A1-AS1的靶向miRNA是miR-335-5p。miR-335-5p在膀胱癌组织和细胞系中低表达。miR-335-5p高表达组的总生存期比miR-335-5p低表达组的总生存期要长。miR-335-5p低表达组中位生存期为37.4个月。膀胱癌者的总生存时间与miR-335-5p表达有显着的正相关性。SLC04A1-AS1与miR-335-5p的表达水平之间呈负相关（Pearson r为-0.6522,95%C1 为-0.7793,-0.4737）。miR-335-5p mimics 转染后 EJ 细胞中的SLC04A1-AS1的表达水平显着下调,只有对照组的40.91%（P<0.05）。在T24细胞中也是同样的结果（P<0.05）。敲低SLC04A1-AS1后,EJ和T24细胞中miR-335-5p的表达水平升高,分别为对照组的4.07倍、2.95倍（P<0.05）。荧光素酶报告基因显示只有包含了 SLC04A1-AS1的WT报告质粒,细胞的荧光素酶活性才能被miR-335-5p mimics抑制。而miR-335-5p mimics转染对SLC04A1-AS1 Mut报告质粒的细胞的荧光素酶活性没有影响。第三部分SLC04A1-AS1通过靶向miR-335-5p上调OCT4表达生物信息学分析TargetScan7软件预测miR-335-5p的靶基因是OCT4。OCT4在膀胱癌组织和细胞系中高表达:膀胱癌组织中OCT4的表达水平更高,为对癌旁正常组织的2.43倍（P<0.05）OCT4在EJ、T24和RT4细胞系中表达也显着升高（P<0.05）。OCT4高表达组的总生存期（Overall survival,OS）比OCT4高表达组的总生存期要短（图20）。OCT4高表达组中位生存期（Median Survival Time）为41.3个月。膀胱癌者的总生存时间与OCT4表达有显着的负相关性（P<0.01）。SLC04A1-AS1与OCT4表达水平之间,表明SLC04A1-AS1与OCT4的表达水平呈正相关（P<0.0001）。miR-335-5p与OCT4的表达水平呈显着负相关（P<0.0001）。上调miR-335-5p抑制OCT4的表达miR-335-5p mimics转染后EJ、T24细胞中的OCT4的mRNA表达水平显着下调（P<0.05）。在EJ和T24细胞中miR-335-5p mimics处理组的OCT4蛋白表达水平比对照组都显着降低。荧光素酶报告基因实验表明miR-335-5p直接与OCT4相互作用。沉默SLC04A1-AS1抑制OCT4的表达。过表达OCT4逆转SLC04A1-AS1沉默对膀胱癌细胞的影响:沉默SLC04A1-AS1（siSLC04A1）和 过 表 达 OCT4 同 时 处 理（siSLCO4A1-AS+oeOCT4）的细胞增殖则不受抑制;沉默SLCO4A1-AS1抑制了 EJ和T24细胞的克隆形成,而siSLCO4A1-AS+oeOCT4组细胞的克隆形成能力则被恢复。在T24细胞中siSLCO4A1组的细胞迁移率为（57.33±11.24）%,siSLCO4A1-AS+oeOCT4 组的 T24 的迁移细胞率为（107±5.29）%（P<0.05）;siSLCO4A1-AS+oeOCT4组接近对照组的细胞迁移率（106±11.36）%。在T24细胞中siSLCO、siSLCO4A1-AS+oeOCT4组的细胞侵袭率为（55±8.54）%、（102±8.89）%,对照组的细胞侵袭率为（92±8.96）%。在EJ细胞中也是同样的结果。裸鼠动物实验显示si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4组的裸鼠膀胱癌生长速度比转染siSLC04A1-AS1组裸鼠的膀胱生长速度更快;在28天时,对照组肿瘤体积是（672.67±97.90）mm3,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤体积是（306±66.78）mm3,si-SLC04A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是（597±106.38）mm3,为siSLCO4A1-AS1组的1.95倍,统计学分析显示两组有显着差异（P<0.05）。在28天时对照组裸鼠的肿瘤质量（706.67± 120.02）mg,沉默SLCO4A1-AS1的裸鼠肿瘤质量是（329.33± 130.70）mg,si-SLCO4A1-AS1+oeOCT4 组的肿瘤体积是（682.67±144.74）mg,为 siSLC04A1-AS1 组的 2.07 倍（P<0.05）。结论SLCO4A1-AS1在膀胱癌组织和细胞系中高表达,SLCO4A1-AS1表达水平和膀胱癌患者OS、T分期相关;沉默SLCO-AS1显着抑制膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,并且抑制体内肿瘤的生长。SLCO4A1-AS1靶向mi355-5p,并与其互作。SLCO4A1-AS1与miR-335-5p之间呈负相关。上调 miR-335-5p 抑制 SLCO4A1-AS1 的表达,敲低 SLCO4A1-AS1 上调miR-335-5p 的表达。OCT4 是miR-335-5p 的靶基因。上调 miR-335-5p 抑制 OCT4的表达。沉默SLCO4A1-AS1抑制OCT4的表达,也能被miR-335-5p逆转。过表达OCT4能逆转SLCO4A1-AS1沉默对膀胱癌细胞和肿瘤的抑制影响。总之,我们的研究是揭示了 SLCO4A1-AS1作为膀胱预后生物标志物的潜力,并且阐述了膀胱癌中SLC04A1-AS1通过miR-335-5p/OCT4发挥功能的作用,为今后针对SLCO4A1-AS1作为治疗靶点提供了新的证据和理论支持。
缪立英[2]（2019）在《LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究》文中认为膀胱癌（bladder cancer,BC）是一种泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率居高不下,严重威胁人体健康。近年来,随着科学技术的发展,我们对BC的认识愈加深入,对其致病机制及发生发展有了更深的理解,在治疗方面也取得了较大的进展,但是BC的预后仍不理想,尤其是晚期患者,无法显着改善其生存情况,因此,深入研究BC发生和发展的分子机制,筛选特异性标志物具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是非编码RNA,长度超过200个核苷酸,可影响调节基因的表达。LncRNA缺乏完整的开放阅读框,没有蛋白编码功能。哺乳动物基因组序列中多达4-9%的序列可以产生LncRNA。LncRNA最初被认为是基因组转录的“暗物质”或“噪音”,没有生物学功能。后来的研究表明,LncRNA参与了许多重要的细胞功能,如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等,可以促进相关信号通路的分子功能改变,改变细胞的生命活动。上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮来源的恶性细胞由于迁移和侵袭能力增强,向间充质细胞转化的生物学过程。EMT的特征性改变包括上皮细胞极性的丧失、细胞间连接的降解、细胞骨架结构重组引起的细胞形态学改变、上皮基因表达下调伴间充质基因表达上调。这些变化使细胞具有更强的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）是 LncRNA 的一种重要的调控机制。LncRNA通过吸收多种微小RNA（microRNA,miRNA）,调节靶基因的表达水平。目前LncRNA在BC中已有一些研究,但作为ceRNA在BC的发生发展以及与上皮-间充质转化相关的转移侵袭中的作用仍不明确,有待进一步研究。本研究分为三个部分,第一部分通过LncRNA芯片筛选BC和癌旁组织中差异性表达的LncRNA,检测其在BC组织和细胞中的表达水平,并通过体外实验和体内实验明确其在BC中的生物学功能;第二部分通过体外实验及体内实验明确LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络对BC发生发展的调控作用;第三部分通过体外实验阐明LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的影响。第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响[目的]明确BC组织与癌旁组织中LncRNA的表达谱,筛选表达差异最显着的LncRNA,并研究其在BC中的生物学功能。[方法]通过LncRNA微阵列分析,分析13个BC组织与8个癌旁非肿瘤组织中LncRNA的表达差异,选取表达差异最显着的LncRNA,并在BC组织及BC细胞株中应用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（quantitative reverse transcript-ion-polymerase chain reaction,qRT-PCR）及原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）实验进行验证。核质分离实验及荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization,FISH）确定其亚细胞定位。CCK8、集落形成及Transwell实验明确体外LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。裸鼠成瘤实验及生物荧光体外成像技术验证体内LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。[结果]选择前60个在BC组织与癌旁组织中差异表达显着的LncRNA（Fold Change>1.5,P<0.01）,其中LINC00612差异表达最显着。BC组织中LINC00612的表达水平明显高于癌旁组织,BC细胞中LINC00612的表达水平明显高于膀胱上皮永生细胞。LINC00612主要定位于细胞质中。体外实验显示:在BC细胞中过表达LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力增强;下调LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力下降。上述结果在体内实验中得到了证实。[结论]LINC00612在BC组织和细胞中表达异常上调,并且在BC中作为促癌基因发挥增强细胞增殖与侵袭能力的作用。第二部分 LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究[目的]鉴定LINC00612调控的下游miRNA及靶基因,阐明LINC00612构成ceRNA网络调控BC发生发展的机制。[方法]通过生物信息学方法筛选LINC00612可能结合的miRNA,RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）、RNA pull down及双荧光素酶报告基因实验验证LINC00612与目标miRNA的结合关系。调节BC细胞中LINC00612的表达,观察目标miRNA水平的变化。应用生物信息学方法筛选目标miRNA可能调控的下游靶基因,qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证目标miRNA与靶基因的结合关系。调节BC细胞中目标miRNA的表达,qRT-PCR和western blotting检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。细胞功能回复实验（挽救实验）和体内实验验证上述结果。[结果]生物信息学方法筛选miR-590是LINC00612下游的目标miRNA,RIP、RNA pull down和双荧光素酶报告实验证明,LINC00612和miR-590可以直接结合。BC细胞中调节LINC00612的表达,miR-590的表达变化呈负性相关。生物信息学方法筛选miR-590下游靶基因,经qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证,PHF-14是miR-590下游的靶基因。BC细胞中调节miR-590的表达,PHF-14的表达变化呈负性相关。细胞功能回复实验显示LINC00612/miR-590/PHF-14轴可调控BC细胞的增殖及侵袭,该结果在体内实验中也获得了进一步证实。[结论]LINC00612通过海绵样吸附miR-590进一步调控下游靶基因PHF-14的表达,并由此影响BC细胞的增殖及侵袭能力,LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控BC的发生发展。第三部分 LINC00612/miR-590/PHF-14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究[目的]研究LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的调控作用。[方法]通过western blotting及FISH实验检测LINC00612/miR-590/PHF-14轴对E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。[结果]LINC00612 下调增强了 E-cadherin 的表达,削弱了 N-cadherin 和 vimentin 的表达,LINC00612过表达抑制了E-cadherin的表达,而N-cadherin和vimentin表达增加,PHF14可以取消LINC00612对E-cadherin和vimentin表达的调控作用。[结论]LINC00612/miR-590/PHF-14轴通过ceRNA机制调控BC细胞上皮-间充质转化。
刘利芬[3]（2019）在《IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究》文中指出背景:子宫内膜癌是严重威胁我国女性健康的生殖道恶性疾病,其死亡率和发病率呈逐年上升趋势,其确切的发病原因及侵袭转移机制尚未明确。研究发现lncRNA分子在调控子宫内膜癌进展过程中不仅可以直接影响肿瘤细胞的生存能力,而且该调节过程也受到上游分子及通路的复杂调控。研究表明lncRNA TUG1通过调控mirRNA及其靶细胞基因参与多种癌症的发生和进展,但是在子宫内膜癌的研究中尚未见报道。目的:研究lncRNATUGl在子宫内膜癌瘤组织及对应正常组织中的转录情况,在细胞、动物水平验证lncRNA TUG1对子宫内膜癌细胞增殖作用的影响,最后对lncRNA TUG1影响子宫内膜癌的作用机制进行深入探讨。方法:通过qPCR方法,检测104例子宫内膜癌组织和其相对应的邻近正常组织lncRNA-TUGl的表达情况并进行分析;通过qPCR方法,检测30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织检测lncRNA-TUG1和VEGFA的表达情况,并对其相关性进行分析;通过qPCR方法,检测30例子宫内膜癌患者肿瘤组织VEGFA和miR-299、miR-34a-5p的表达情况,并对其相关性进行分析;通过qPCR实验,检测子宫内膜癌细胞（HEC-l-A细胞和ishikawa细胞）和HEK293细胞系lncRNA-TUGl的表达情况;构建lncRNA TUGl和VEGFA的荧光素酶报告基因系统,在HEC-l-A细胞和ishikawa细胞中,敲低miR-299、miR-34a-5p的表达,然后通过荧光素酶报告基因系统评价miR-299、miR-34a-5p 对 lncRNA TUG1 和 VEGFA 的表达影响;在 HECM-A 细胞和 ishikawa 细胞中,敲低miR-299、miR-34a-5p的表达,然后通过qPCR方法检测lncRNA TUG1和VEGFA的含量;构建lncRNATUG1的敲低质粒和VEGFA基因表达的荧光素酶报告基因系统,共同转染HEC-l-A细胞和ishikawa细胞,检测lncRNATUGl敲低后对VEGFA基因表达的影响;在HEC-l-A细胞和ishikawa细胞中,通过shRNA方法转染细胞降低lncRNA TUG1的含量,然后检测转染的对照细胞和lncRNA TUG1敲低后的细胞增殖能力;将HEC-l-A细胞、ishikawa细胞、lncRNA-TUGl敲低的HEC-l-A细胞、lncRNA-TUG1敲低的ishikawa细胞在免疫缺陷的裸鼠体内进行皮下异种移植,然后检测各组细胞在皮下异种移植后的肿瘤生长情况。结果:在104例子宫内膜癌患者中,有71例子宫内膜癌患者肿瘤组织中的lncRNA-TUG1表达相比于其对应的邻近正常组织出现明显的增高（71/104,68.27%,P<0.05）;在30例子宫内膜癌患者肿瘤组织中,lncRNA-TUG1表达量增高,其VEGFA的表达量同样出现明显的上调,两者呈现正相关性（相关系数R2=0.33,P<0.05）;在30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织中,miR-299表达越高,其VEGFA的表达则越低,miR-299与VEGFA之间呈现负相关性,具有统计学意义（R2=0.43,P<0.05）;同样在30例子宫内膜癌患者肿瘤组织中,miR-34a-5p表达越高,其VEGFA的表达越低,miR-34a-5p与VEGFA呈现负相关性,具有统计学意义（R2=0.48,P<0.05）;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,lncRNA-TUG1表达水平比对照组HEK-293细胞出现显着性的增加（P<0.05）;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,miR-299与miR-34a-5p能够分别作用于其靶基因VEGFA的3’UTR区域和lncRNA-TUG1的3’UTR区域,干扰VEGFA和lncRNA-TUG1的mRNA表达水平;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中,敲低lncRNA-TUG1能够明显的抑制VEFGA的表达;lncRNA-TUG1与miR-299、miR-34a-5p能够特异性结合,从而起到竞争性抑制的作用;在HEC-1-A细胞和ishikawa细胞中敲低lncRNA-TUG1后,与正常子宫内膜癌细胞系相比,其活力值于第4天出现明显的降低（P<0.05）;最后,在动物水平,敲低lncRNA-TUG1后的子宫内膜癌细胞的肿瘤增殖,明显小于对照组的子宫内膜癌细胞的肿瘤增殖（lncRNA-TUG1敲低的HEC-1-A细胞/正常的HEC-1-A细胞:330±21.6 mm3/466.7±38.6 mm3/,P<0.05;lncRNA-TUG1 敲低的 ishikawa 细胞/正常的 ishikawa细胞:326.7±24.9 mm3/453.3±44.9 mm3,P<0.05）。结论:lncRNA-TUG1可以竞争性结合miR-299、miR-34a-5p,从而减弱miR-299、miR-34a-5p对其靶基因VEGFA的抑制作用,导致VEGFA基因过表达,加速子宫内膜癌细胞的增殖和转移,促进子宫内膜癌的发生、发展。
曹文娟[4]（2017）在《一种嵌合型不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒构建及其抗膀胱癌作用研究》文中进行了进一步梳理目的:膀胱癌是泌尿系统疾病中最常见的恶性肿瘤之一,且随着空气污染的加重和吸烟人数的增加膀胱癌的发病率逐年增高。膀胱癌的治疗多采用手术、放疗、化疗和灌注疗法,但这些方法尚存在远期治愈率低、复发率高的缺点。近些年膀胱癌的基因治疗成为了一个新兴的治疗手段,其中通过构建携带目的基因的溶瘤腺病毒靶向杀伤膀胱癌细胞是一个新的研究方向。大部分关于膀胱癌溶瘤腺病毒生物治疗的研究中,应用的载体多为5型腺病毒,该病毒主要通过识别膀胱癌细胞表面的柯萨奇-腺病毒受体（coxsackie adenovirus receptor,CAR）进入肿瘤细胞发挥溶瘤作用。但是对于一些分化程度低的肿瘤细胞,其表面CAR的表达量低,从而阻碍了5型腺病毒发挥抗膀胱癌作用。因此,本课题致力于构建一种不依赖于CAR的嵌合型膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,该病毒可以通过膀胱癌广谱表达的CD46分子进入肿瘤细胞发挥溶瘤作用。顺铂是膀胱癌的治疗中较为常用的一种化疗药物,我们通过一系列体外实验研究Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂是否具有协同抗肿瘤作用。不依赖于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒的构建及其与顺铂的联合应用为膀胱癌的基因治疗提供了一个新的思路,拓展了膀胱癌治疗领域。方法:将嵌合5型腺病毒纤毛尾区和11型腺病毒纤毛轴区及旋钮区的骨架质粒Ad5/F11p,与我们实验室前期构建的穿梭质粒Rp-PSCAE-UPII-E1A在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组形成重组质粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,并通过限制性内切酶和聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）这两种方法对重组质粒进行鉴定。根据pAdEasy-1系统,重组质粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在HEK293细胞内包装出不依赖于CAR的嵌合型膀胱组织特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,通过PCR的方法对其进行鉴定,对鉴定正确的病毒进行纯化、扩增和滴度测定。将新构建的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A作用于5637、EJ和T24三种膀胱癌细胞,通过CCK-8、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、RNA干扰技术及流失细胞术等方法测定Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对不同CAR表达情况的膀胱癌细胞的抗肿瘤作用,以及探讨Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对膀胱癌细胞周期的影响。最后通过体外实验研究Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对5637、EJ和T24三种膀胱癌细胞的抗肿瘤作用,并通过对相关凋亡基因Fas、Bax、Bcl-2及cleaved Caspase 3的检测初步探讨Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂抗膀胱癌的作用机制。结果:（1）我们将嵌合5型腺病毒纤毛尾区和11型腺病毒纤毛轴区及旋钮区的骨架质粒Ad5/F11p,和穿梭质粒Rp-PSCAE-UPII-E1A进行同源重组,经鉴定形成了正确的重组质粒pAd5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,并根据pAdEasy-1包装系统,包装出了不依赖于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,通过纯化、扩增及病毒滴度测定,我们得到的病毒滴度为1×1010PFU/ml。（2）实时荧光定量PCR结果显示在5637、EJ及T24细胞中,T24细胞CAR的表达量低,而5637、EJ及T24这三种细胞均高表达CD46分子。（3）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A可以进入CAR高表达5637、EJ细胞和CAR低表达的T24进行复制,并发挥抗肿瘤作用,且杀伤作用均优于Ad5-PSCAE-UPII-E1A,而对人正常尿路上皮细胞株SV-HUC-1均无杀伤作用。（4）嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A进入膀胱癌细胞进行复制发挥抗肿瘤作用和细胞表面CAR的表达量无关:该病毒分别感染未经CAR-SiRNA处理的膀胱癌细胞（EJ、5637、T24）和CAR-SiRNA干扰的膀胱癌细胞（EJ-CAR-SiRNA、5637-CAR-Si RNA、T24-CAR-SiRNA）后,E1A蛋白的表达和体外抗增殖作用在在EJ和EJ-CAR-SiRNA、5637和5637-CAR-SiRNA、T24和T24-CAR-Si RNA之间无差异。（5）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染5637、EJ及T24这三种膀胱癌细胞后可以阻滞大部分膀胱癌细胞周期于G1期。（6）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂作用于5637、EJ及T24这三种膀胱癌细胞后具有协同抗膀胱癌作用。（7）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂可以诱导膀胱癌细胞发生早期凋亡,且发生早期凋亡的细胞数目多于顺铂单用组和Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A单用组。（8）Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂作用于5637、EJ及T24这三种膀胱癌细胞后可以上调Fas、Bax和cleaved Caspase3基因的表达,下调Bcl-2基因的表达。结论:我们构建出了一种不依赖于CAR的嵌合型膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A,经纯化、鉴定和滴度测定,该病毒纯度好滴度高可用于后续研究;这种嵌合型病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A可进入5637、EJ及T24这三种膀胱癌细胞发挥抗肿瘤作用,且效果优于Ad5-PSCAE-UPII-E1A;Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A可以阻滞膀胱癌细胞周期于G1期;Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂作用于5637、EJ及T24这三种膀胱癌细胞后具有协同抗肿瘤作用;Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂可以通过增强内源性和外源性凋亡通路诱导膀胱癌细胞发生凋亡。嵌合型溶瘤腺病毒的构建及其与顺铂的联合应用为膀胱癌的基因治疗提供了一个新的思路,拓展了膀胱癌治疗领域,为下一步的研究提供理论基础。
高晓东,陈一戎[5]（2014）在《端粒酶hTERT基因反义核酸对肿瘤坏死因子-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响》文中指出目的探讨人类端粒酶反转录酶催化亚单位（hTERT）基因的全硫代修饰反义寡核苷酸抑制膀胱癌T24细胞端粒酶活性后,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对膀胱癌T24细胞凋亡的增敏作用。方法采用端粒重复序列扩增-多聚酶链反应-酶联免疫吸附测定法检测膀胱癌细胞的端粒酶活性;采用噻唑蓝比色试验观察hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸与TNF-α共同作用对膀胱癌T24细胞生长活力的影响;通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率。结果hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞48 h,其端粒酶活性下降;作用72 h,其端粒酶活性受到抑制,与反义核酸组、空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞后,加入TNF-α作用48 h,T24细胞的抑制率为39%,与对照组、正义核酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、TNF-α组及正义核酸+TNF-α组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸作用于膀胱癌T24细胞后加入4μg/mL TNF-α作用48 h,凋亡细胞的百分率为35.18%;与对照组、正义核酸组、全硫代修饰反义寡核苷酸组、TNF-α组及正义核酸+TNF-α组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论通过hTER工基因的全硫代修饰反义寡核苷酸能降低膀胱癌T24细胞端粒酶活性;对TNF-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡有增敏作用。
于立春[6]（2013）在《PTEN基因转染对膀胱癌T24细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的通过研究抑癌基因PTEN在膀胱肿瘤细胞中的表达，研究PTEN在膀胱癌中的表达情况与凋亡的关系。观察PTEN基因对膀胱癌T24细胞的抑制作用，并初步探讨其对肿瘤抑制作用的机制。方法将重组质粒转染入膀胱癌T24细胞中，实验分：A组（实验组含pEGFP-PTEN质粒）、B组（空载体转染组含pEGFP-N1空质粒）和C组（空白对照组只有等量脂质体）；观察PTEN基因在体外对膀胱癌T24细胞的抑制作用。目的基因的表达采用RT-PCR法检测；Western blotting法检测目的PTEN蛋白和Phospho-Akt蛋白表达；细胞的生长抑制作用通过细胞集落形成实验进行测定；AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测PTEN基因对T24凋亡的影响；结果荧光显微镜下观察到PTEN基因在T24细胞系中成功表达；扩增培养后RT-PCR结果显示，1200bp处三组细胞均有条带出现，与B组或C组相比，A组相对OD值明显增强（P<0.05）。Western blotting法检测实验组PTEN蛋白表达水平明显高于B组或C对照组（P<0.05），Phospho-Akt蛋白（实验组）表达低于B组或C组（P<0.05）；T24细胞的集落数量及大小均有不同程度的降低，A组降低最为明显（P<0.05）；实验组凋亡率明显高于B组或C组（P<0.05）。结论将目的基因通过脂质体介导法转染入T24细胞，并在T24细胞中稳定表达，这种稳定表达在体外环境下可以抑制肿瘤细胞的增殖。通过Westernblot检测显示在控制凋亡方面可能是野生型PTEN基因下调了PhospholatedAkt的表达水平，通过观察这种凋亡的机制，提示PTEN基因对膀胱癌T24细胞株的抑制作用的机制之一是PTEN能够阻断PI3K/AKT途径。它为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据，也为基因治疗的临床应用奠定基础。
杨凯[7]（2010）在《dsRNAs上调若干肿瘤抑制基因及其对膀胱癌治疗作用的研究》文中研究指明近年来研究发现序列特异性靶向某些靶基因启动子区的双链小RNAs（dsRNAs）能引起人肿瘤细胞内靶基因转录水平的表达上调,并将此现象命名为RNA诱导的基因激活（RNAa）,称这样的dsRNAs为小激活RNAs （saRNAs）.随后关于RNAa发生机制方面的研究显示表观遗传学修饰和反义转录产物与RNAa的发生密切相关。然而,目前对RNAa的普遍性、作用机制以及设计原则的了解仍较肤浅,且在RNAa的发生机制方面存在一些争议。本研究旨在探讨RNAa现象的普遍性、明确其具体发生机制、完善saRNAs的设计规律以及评估其治疗应用的可行性,主要研究内容及成果如下：1)本文针对肿瘤抑制基因p21、par-4、KAI1和NKX3-1基因启动子区设计了若干对双链小RNAs,利用RT-PCR反应和蛋白印迹验证及挑选了能有效上调靶基因表达的功能性saRNAs:dsP21-306和dsPar4-435;并发现功能性saRNAs的有效性是由dsRNAs的设计位点和细胞本身的遗传背景及特征共同决定的。2)比较功能性saRNAs邻近位点的dsRNAs与功能性saRNAs在调节靶基因表达方面的异同,发现功能性saRNAs的靶点沿基因启动子区序列向上游或下游位移1～2个碱基能获得1～2对新的功能性saRNAs。同时,结合以往发现的功能性saRNAs,分析总结它们的序列特征,发现其正义链3’端碱基具有一定的规律,可能与其功能有关。3)利用染色质免疫共沉淀探讨功能性saRNAs对par-4启动子区表观遗传学修饰的影响,发现dsPar4-435作用靶点附近的染色质H3K9二甲基化减少和H3K4二甲基化增加,而H3K9的乙酰化状态无明显改变,提示表观遗传学修饰的变化趋势虽与RNAa现象一致,但是其具体改变可能因基因的不同而存在一定的差异。利用PCR检测提示各种细胞中par-4基因启动子区均存在转录产物,以反义RNA为主,它在dsPar4-435作用后表达略有上升,但确切的作用机制仍需进一步研究探索。4)利用MTT法、流式细胞术以及蛋白印迹等评估功能性saRNAs对膀胱癌细胞的体外治疗作用和效果,发现dsP21-306和dsPar-435上调靶基因表达后均能有效诱导T24细胞的凋亡,dsP21-306还能诱导G1期细胞周期阻滞,从而抑制膀胱癌细胞的生长,说明saRNAs上调基因表达对膀胱癌具有一定的治疗效果和应用前景。总之,RNAa现象具有一定的普遍性,其作用机制与表观遗传学修饰和反义转录产物有一定的联系；同时,saRNAs对膀胱癌细胞的体外治疗效果明显,为将来恶性肿瘤及其他疾病的临床治疗应用提供了理论依据。但是,RNAa现象的确切机制、设计规律以及治疗应用的体内实验等工作还需进一步研究完善。
高明[8]（2010）在《淫羊藿苷对人膀胱癌T24细胞抑制作用的体外研究》文中研究指明目的:研究淫羊藿苷（icariin, ICA）对人膀胱癌T24细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨淫羊藿苷抗肿瘤作用机理,为淫羊藿苷应用于肿瘤化学预防提供理论依据。方法:1采用MTT比色法观察不同浓度淫羊藿苷（0,5,10,20,40,80,160和320μg/ml）作用不同时间（24,48和72h）后,人膀胱癌T24细胞的增殖变化;光镜及瑞氏-姬姆萨染色法观察淫羊藿苷对T24细胞形态学的改变。2用流式细胞技术分析不同浓度淫羊藿苷（0,5,10,20和40μg/ml）作用24h后,对人膀胱癌T24细胞周期和凋亡的影响。3采用Western blot方法分析不同浓度淫羊藿苷（0,5,10,20和40μg/ml）作用24h后,人膀胱癌T24细胞PCNA、Bcl-2和Bax蛋白质表达的影响。4统计学方法:所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。实验结果均以x±S表示,组内比较采用单因素方差分析,多个实验组均数与一个对照组均数比较用Dunnett-t检验,回归方程间比较用t检验与方差分析,以α=0.05或α=0.01为检验水准。结果:1淫羊藿苷抑制人膀胱癌T24细胞增殖: MTT检测结果显示,5,10,20,40,80,160和320μg/ml的淫羊藿苷对T24细胞增殖有明显的抑制作用,与对照组比较有显着性差异（P<0.01）,高浓度淫羊藿苷组与低浓度组比较也具有显着差异（P<0.05）,抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性（r=0.99,P=0.00）,IC50为63.22μg/ml。40μg/ml淫羊藿苷作用24h后,光镜下观察到细胞体积缩小,胞质浓缩,胞核凝聚,位于核周膜,呈新月状。2淫羊藿苷可诱导T24细胞周期阻滞和细胞凋亡:流式细胞术检测结果显示,0,5,10,20和40μg/ml的淫羊藿苷作用T24细胞24h后,G0/G1期细胞显着增多,S期和G2/M期细胞减少（P<0.01）。淫羊藿苷呈剂量依赖性地诱导T24细胞凋亡,40μg/ml的淫羊藿苷作用24 h后,细胞凋亡率（7.07%±0.62%）明显升高,与对照组（1.94%±0.44%）相比有显着性差异（P<0.01）。细胞增殖活性的增殖指数PI值显着降低（P <0.01）。3淫羊藿苷可明显抑制PCNA蛋白质的表达,Bcl-2蛋白质表达下调,Bax蛋白质表达上调:经淫羊藿苷作用24 h后,T24细胞PCNA蛋白质表达水平明显下降（P<0.05）,抑制作用呈剂量依赖性（r=0.999,P=0.001）。淫羊藿苷作用于T24细胞后,Bcl-2蛋白质表达下调,Bax蛋白质表达上调,增加Bax/Bcl-2的比值,诱导T24细胞凋亡。结论:淫羊藿苷可明显抑制T24细胞增殖,诱导细胞凋亡,将T24细胞周期阻滞于G0/G1期。淫羊藿苷可明显抑制PCNA蛋白的表达,Bcl-2蛋白表达下调,Bax蛋白表达上调,诱导T24细胞凋亡。
何围[9]（2010）在《靶向AR基因的RNA干扰诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究》文中指出研究背景和目的多年来关于膀胱癌的一个问题一直存在——为什么男性患者大约是女性患者的3倍之多?长期以来认为这要归因于男性的高吸烟率和高风险的工作,但是随着各行各业女性工作者和女性烟民数量的大量增加,这一差距并没有改变。性激素在致癌过程中的作用日益引起人们的关注。最初对性激素的研究均注重于性激素的靶器官,如乳腺、卵巢、前列腺等。1984年Ahmed证实在肾癌组织中存在雄激素受体（Androgen Receptor, AR）、雌激素受体（Estrogen Receptor, ER）和孕激素受体（Progesterone Receptor, PR）,泌尿系肿瘤与性激素间的关系令人瞩目。膀胱癌是泌尿系最常见的肿瘤,也是性别差异较大的肿瘤之一。随着在膀胱癌组织中相继发现了AR, ER和PR,有人认为性激素通过其受体在膀胱癌的发生、发展过程中有一定作用。AR在人体组织分布很广泛,除了在前列腺、精囊等生殖器官外,在中枢神经系统、骨骼肌以及肾脏、肝脏组织中都存在AR。在人类的肿瘤中,前列腺癌、肝癌、大肠癌、黑色素瘤中都有AR。在膀胱癌组织中也有AR,李世文等检测64例膀胱移行细胞癌,AR阳性率为78.13%,高于17例正常膀胱粘膜AR阳性率41.18%；在64例膀胱癌中,8例Ⅰ级膀胱癌AR阳性率100%,27例Ⅱ级癌AR阳性率81.48%,29Ⅲ-Ⅳ级癌AR阳性率68.97%,提示膀胱癌AR阳性率随肿瘤分级增加而降低。同时还发现同一患者的癌组织AR阳性率高于癌旁组织及自身膀胱粘膜,原发肿瘤的AR阳性率高于复发肿瘤,程荣璇等检测93例膀胱移行细胞癌,AR阳性率为52.68%,AR阳性患者中多发性癌较高,非浸润性癌的AR阳性率高于浸润性癌,分化好的AR阳性率高于分化差的,并认为AR可能是膀胱癌新的生物学标记,检测AR对预测膀胱癌预后有重要意义。化疗药物灌注膀胱诱导癌细胞凋亡已成为膀胱癌术后辅助治疗的主要手段。然而临床结果显示灌注后仍有较高的复发率。其主要原因就是对化疗药物耐药及敏感性下降,导致细胞凋亡不足。有大量资料显示,在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有Caspase的活化。在此传导途径中起关键作用的caspase-3在许多正常组织和肿瘤组织中表达,而且许多肿瘤治疗是通过caspase-3途径介导的。caspase-3表达下调导致膀胱癌细胞凋亡减少,可能在膀胱癌的发生发展过程中起重要作用。RNA干扰（RNA interference, RNAi）作为一种高效的基因沉默技术,有望成为基因治疗的有效手段。通过RNAi实现对AR的沉默,能够分析其在肿瘤中的作用：雄激素是否通过AR促进了膀胱癌细胞的增殖能力?AR与细胞周期调节和信号转导之间的关系如何?其机制可能是什么?圆满地解决这些问题,必然将找到预防和治疗膀胱癌的新途径,延长膀胱癌患者的生命,具有潜在的经济与社会效益。正是在这样的前提与背景下,本研究拟准备：①研究雄激素对膀胱癌细胞株T24的生长的影响,其与AR表达之间的关系；②构建靶向于AR的慢病毒载体；③探讨AR在丝裂霉素C诱导膀胱癌T24细胞系凋亡中所发挥的作用及其与凋亡信号通路的联系,从而为抑制膀胱癌细胞增殖治疗和加强化疗药物对膀胱癌细胞的作用效果提供实验依据。目的探讨DHT对膀胱癌细胞株T24及其AR表达的作用。方法采用细胞培养和RT-PCR方法研究不同的DHT浓度（0、10-10M、10-9M、10-8M）对膀胱癌细胞株（T24）中ARmRNA的表达；MTT法测细胞生长曲线,观察其对细胞增殖的影响。结果Real-time PCR扩增良好。溶解曲线图中没有出现杂峰,也未出现主峰的异常增宽,表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。分析数据提示不同DHT浓度对AR表达无明显影响（P>0.05）。而在不同水平DHT培养T24细胞第4天和第5天MTT检测结果分析显示光吸收值无显着性差异（P>0.1）。小结T24细胞表达AR；DHT浓度对AR表达无明显影响；DHT对T24细胞无直接刺激增殖作用。目的制备靶向于AR的干扰慢病毒载体,为进一步研究AR提供条件。方法针对AR基因靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计2个RNA干扰靶点序列,使用双链DNA oligo,,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将连接好的产物转入制备好的感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,在进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。通过RT-PCR检测两种慢病毒载体感染T24细胞后,AR基因的表达情况。结果通过阳性克隆测序,证实两条序列构造载体分别成功。慢病毒滴度测定两个病毒载体滴度分别为1E+9,2E+9 TU/mL。从荧光观察结果可见：T24细胞的感染效率都达到80%以上。T24细胞中,KD1,KD2组对AR基因的表达有显着敲减效果。相对NC组,KD1,KD2组对AR基因敲减效率分别达到85%以上（P<0.05）。小结利用RNAi的理论和方法制备出2个靶向AR基因的慢病毒载体。目的探讨AR在丝裂霉素诱导膀胱癌T24细胞系凋亡中所发挥的作用,从而为抑制膀胱癌细胞增殖治疗和加强化疗药物对膀胱癌细胞的作用效果提供实验依据。方法采用RNAi及MTT和流式细胞术（FCM）等方法观察AR对丝裂霉素C诱导T24细胞凋亡的影响。Realtime RT-PCR技术检测T24细胞中ARmRNA和caspase3mRNA的表达。结果分别于转染后RT-PCR检测AR及caspase3的表达,ARmRNA显着降低（P<0.05）,而caspase-3显着增高（P<0.05）。流式细胞仪检测空白组、阴性对照组及转染组MMC作用的凋亡率结果,在不加化疗药物的情况下,单纯转染RNA干扰载体,细胞的凋亡率与转染前相比稍有升高,在MMC的作用下,抑制AR的表达后,细胞的凋亡率可明显升高,转染组细胞凋亡率为（35.38±1.54）%,明显高于空白组（15.67±1.23）%与阴性对照组（17.43±1.45）%,差异有统计学意义（P<0.05）。小结AR-siRNA介导膀胱癌T24细胞系凋亡可能通过caspase途径。AR明显抑制了丝裂霉素（MMC）诱导膀胱癌T24细胞的凋亡,高表达AR可能是膀胱癌易复发和产生多药耐药的一个重要原因。
沈彬[10]（2009）在《Twist基因在膀胱癌中表达与RNA干扰的实验研究》文中进行了进一步梳理膀胱肿瘤是泌尿外科最常见的恶性肿瘤,其临床特点主要是高发病率、高复发率和低度恶性。细胞凋亡是机体重要的生理过程,也是机体维持细胞群体数量稳定的重要机制。肿瘤是一类细胞周期失控性疾病,细胞凋亡和增殖失去平衡是肿瘤产生和发展的主要原因之一,也是肿瘤细胞的基本特征。Twist是一个在进化过程中高度保守的转录因子,Twist蛋白被认为是一种癌蛋白,能影响许多肿瘤细胞的凋亡、侵袭和转移。RNA干扰是一项新兴的高效、特异、安全、可操作性强的基因阻断技术。它的发现改变了人们对细胞基因调控的传统理解,RNA干扰技术在对基因功能研究、信号转导基因上下游关系确认以及抗病毒、抗肿瘤治疗中有着广阔的应用前景。本研究应用免疫组化法探讨了Twist在膀胱癌组织中的表达与临床病理特征之间的关系,成功构建了靶向Twist基因的shRNA质粒表达载体,并筛选出其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体。用RNAi技术沉默膀胱癌T24细胞Twist基因的表达,观察其对人膀胱癌细胞生物学行为的影响。实验结果提示Twist在人膀胱癌组织中高表达,并与肿瘤的病理分级、临床分期有显着相关性。Twist是一个膀胱癌临床辅助诊断的分子标志物,并极可能是膀胱癌的一个潜在的治疗靶点,具有广阔的临床应用价值。人膀胱癌细胞系T24中Twist高表达,可以用作Twist基因沉默研究的靶细胞。RNAi沉默Twist基因后,明显地改变了人膀胱癌细胞生物学行为,表现细胞增殖能力降低,细胞凋亡的增加,细胞迁移速度明显减低。Twist基因干扰还可以明显提高膀胱癌T24细胞对化疗药物的敏感性,这将有助于减少化疗药物的毒副作用,增加化疗药物的疗效,对减少膀胱癌的复发起到重要作用。本研究提示:针对Twist基因及其表达产物的检测,将有助于判断膀胱癌的恶性程度,指导膀胱癌治疗;RNAi技术可以做为沉默膀胱癌中Twist基因的有效方法;而靶向Twist的基因治疗,可能为膀胱癌的治疗提供新的策略。
二、端粒酶反义RNA转染促进膀胱癌T24细胞凋亡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶反义RNA转染促进膀胱癌T24细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 SLCO4A1-AS1在膀胱癌的生物学功能研究 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) SLCO4A1-AS1在膀胱癌组织和细胞系中高表达 |
| (二) SLCO4A1-AS1的表达和膀胱癌患者OS、T分期相关 |
| (三) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的增殖 |
| (四) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的克隆形成 |
| (五) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭 |
| (六) 沉默SLCO4A1-AS1显着抑制体内膀胱癌生长 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 SLCO4A1-AS1与靶标MIR-335-5P的关系 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) 生物信息学预测SLCO4A1-AS1靶向miRNA |
| (二) miR-335-5p在膀胱癌组织和细胞系中低表达 |
| (三) miR-335-5p是膀胱癌预后的生物标志物 |
| (四) SLCO4A1-AS1与miR-335-5p之间呈负相关 |
| (五) 上调miR-335-5p抑制SLCO4A1-AS1的表达 |
| (六) 敲低SLCO4A1-AS1上调miR-335-5p的表达 |
| (七) miR-335-5p直接与SLCO4A1-AS1相互作用 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 SLCO4A1-AS1通过靶向MIR-335-5P上调OCT4表达 |
| 一、前言 |
| 二、实验材料和方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 三、结果 |
| (一) 生物信息学预测miR-335-5p候迭靶基因 |
| (二) OCT4在膀胱癌组织和细胞系中高表达 |
| (三) OCT4是膀胱癌预后的生物标志物 |
| (四) miR-335-5p与OCT4、SLCO4A1-AS1与OCT4相关性分析 |
| (五) 上调miR-335-5p抑制OCT4的表达 |
| (六)miR-335-5p直接与OGT4相互作用 |
| (七)沉默SLCO4A1-AS1抑制OCT4的表达 |
| (八)过表达OCT4逆转SLCO4A1-AS1沉默对膀胱癌细胞的影响 |
| (九)过表达OCT4逆转SLCO4A1-AS1沉默对体内肿瘤的影响 |
| (十)抑制miR-335-5p能逆转SLCO4A1-AS1沉默对OGT4的作用 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 全文小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
（2）LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC00612/miR-590/PHF14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LINC00612/miR-590/PHF 14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在膀胱癌中表达的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 已发表英文论文 |
| 致谢 |
（3）IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一部分 lncRNA TUG1和VEGFA在子宫内膜癌组织、细胞中的表达 |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第二部分 lncRNA TUG1通过竞争性结合miR-299和miR-34a-5p调控VEGFA |
| 引言 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第三部分 结论及展望 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 lncRNA在子宫内膜癌细胞生物学行为调控机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表(Abbreviation) |
| 博士生期间完成的论文 |
| 致谢 |
（4）一种嵌合型不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒构建及其抗膀胱癌作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 膀胱癌概述 |
| 1.2 膀胱癌的基因治疗 |
| 1.3 溶瘤腺病毒在膀胱癌治疗中的应用 |
| 1.4 不依赖于CAR的嵌合型溶瘤腺病毒的构建 |
| 1.5 顺铂在膀胱癌治疗中的应用 |
| 1.6 前期工作、选题依据和本课题主要研究工作 |
| 技术路线图 |
| 第二章 嵌合型不依赖于CAR的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A的构建、纯化及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 穿梭质粒Rp-PSCAE-UPII-E1A的PCR鉴定 |
| 2.3.2 重组腺病毒质粒p Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A的鉴定 |
| 2.3.3 嵌合型腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A的包装、鉴定及滴度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对膀胱癌细胞的体外抗肿瘤作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 膀胱癌细胞表面CAR及CD46的表达情况 |
| 3.3.2 RNAi技术干扰膀胱癌细胞CAR的表达 |
| 3.3.3 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对膀胱癌细胞的体外抗增殖作用 |
| 3.3.4 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A对CAR-SiRNA干扰前后膀胱癌细胞的抗增殖作用 |
| 3.3.5 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染膀胱癌细胞后Hexon及E1A的表达情况 |
| 3.3.6 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染CAR-SiRNA干扰前后膀胱癌细胞E1A的表达情况 |
| 3.3.7 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染膀胱癌细胞后对细胞周期的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞的体外抗肿瘤作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞抗增殖作用 |
| 4.3.2 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞凋亡的影响 |
| 4.3.3 Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A联合顺铂对膀胱癌细胞凋亡相关分子的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）端粒酶hTERT基因反义核酸对肿瘤坏死因子-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 引物合成 |
| 1.3 细胞培养 |
| 1.4 端粒酶活性检测 |
| 1.5 噻唑蓝比色试验检测各组对膀胱癌T24细胞活力的影响 |
| 1.6 流式细胞仪测定凋亡细胞的百分率 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 hTERT基因的全硫代修饰反义寡核苷酸对膀胱癌T24细胞端粒酶活性的影响 |
| 2.2 噻唑蓝比色试验检测结果 |
| 2.3 流式细胞仪测定结果 |
| 3 讨论 |
（6）PTEN基因转染对膀胱癌T24细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）dsRNAs上调若干肿瘤抑制基因及其对膀胱癌治疗作用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 目次 |
| 1 绪论 |
| 1.1 RNA干扰 |
| 1.2 RNA激活 |
| 1.3 RNAa的相关机制 |
| 1.3.1 RNAa与基因启动子区saRNA靶位序列的关系 |
| 1.3.2 RNAa的作用机制是否与RNAi类似 |
| 1.3.3 RNAa现象中的靶基因是否发生了表观遗传学改变 |
| 1.3.4 反义转录产物是saRNA诱导基因激活的媒介 |
| 1.4 小RNAs调节基因表达在肿瘤治疗中的应用潜力 |
| 1.5 本文的研究内容 |
| 2. 功能性saRNAs的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 细胞系和主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 dsRNAs的设计及合成 |
| 2.2.4 细胞培养及转染 |
| 2.2.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 2.2.6 蛋白印迹(Western Blot) |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 dsRNAs上调p21的表达 |
| 2.3.2 dsRNAs上调par-4的表达 |
| 2.3.3 dsRNAs未能上调KAI1的表达 |
| 2.3.4 dsRNAs未能上调NKX3-1的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3. 功能性saRNAs的序列特征和相关作用机制的探讨 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 细胞系和主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 dsRNAs的设计及合成 |
| 3.2.4 细胞培养及转染 |
| 3.2.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 3.2.6 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 saRNAs序列位移对RNAa的影响 |
| 3.3.2 已发现的功能性saRNAs的序列特征分析 |
| 3.3.3 表观遗传学修饰与RNAa的关系 |
| 3.3.4 启动子区转录产物与RNAa的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4. 功能性saRNAs对膀胱癌治疗作用的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 细胞系和主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 dsRNAs的设计及合成 |
| 4.2.4 细胞培养及转染 |
| 4.2.5 四唑盐(MTT)比色法 |
| 4.2.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 4.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.2.8 蛋白印迹(Western Blot) |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 dsP21-306上调p21对膀胱癌细胞的治疗作用 |
| 4.3.2 dsPar4-435上调par-4对膀胱癌细胞的治疗作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5. 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录一 |
| 附录二 |
（8）淫羊藿苷对人膀胱癌T24细胞抑制作用的体外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 淫羊藿苷对人膀胱癌T24 细胞抑制作用的体外研究 |
| 引言 |
| 第一部分 淫羊藿苷对人膀胱癌T24 细胞增殖和细胞周期的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 淫羊藿苷对人膀胱癌T24 细胞凋亡的诱导作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 中药干预膀胱癌的实验研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）靶向AR基因的RNA干扰诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 不同水平DHT对膀胱癌细胞株T24生长及其AR表达的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 AR基因RNA干扰慢病毒载体制备 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 AR影响丝裂霉素诱导膀胱癌T24细胞系凋亡及其机制研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
（10）Twist基因在膀胱癌中表达与RNA干扰的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1篇 文献综述 |
| 第1章 Twist 基因在肿瘤形成中的意义 |
| 1.1 Twist 的发现及结构 |
| 1.2 Twist 与细胞凋亡 |
| 1.3 Twist 与肿瘤的发生 |
| 1.4 Twist 与肿瘤的转移 |
| 1.5 Twist 与肿瘤血管生成 |
| 第2章 基因干扰技术在膀胱癌中的意义 |
| 2.1 RNAi 的发现 |
| 2.2 RNAi 作用机制 |
| 2.3 RNAi 的特性 |
| 2.4 siRNA 制备方法 |
| 2.5 siRNA 的转染 |
| 2.6 小片段发夹RNA 的研究 |
| 2.7 RNAi 的应用及前景 |
| 第2篇 实验研究 |
| 第1章 Twist 在人膀胱癌组织及膀胱癌细胞中的表达 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 1.6 附图 |
| 第2章 Twist-siRNA 表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 附图 |
| 第3章 RNAi 沉默Twist 基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 附图 |
| 结论 |
| 本研究创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 攻读期间发表论文及参与课题情况 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
四、端粒酶反义RNA转染促进膀胱癌T24细胞凋亡的研究（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-335-5p促进膀胱癌生长和侵袭的机制研究[D]. 杨宇. 山东大学, 2020(10)
- [2]LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究[D]. 缪立英. 苏州大学, 2019(06)
- [3]IncRNA TUG1在子宫内膜癌中的生物学行为作用及机制研究[D]. 刘利芬. 苏州大学, 2019(04)
- [4]一种嵌合型不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒构建及其抗膀胱癌作用研究[D]. 曹文娟. 兰州大学, 2017(01)
- [5]端粒酶hTERT基因反义核酸对肿瘤坏死因子-α诱导膀胱癌T24细胞凋亡的影响[J]. 高晓东,陈一戎. 兰州大学学报(医学版), 2014(02)
- [6]PTEN基因转染对膀胱癌T24细胞凋亡的影响[D]. 于立春. 辽宁医学院, 2013(05)
- [7]dsRNAs上调若干肿瘤抑制基因及其对膀胱癌治疗作用的研究[D]. 杨凯. 浙江大学, 2010(09)
- [8]淫羊藿苷对人膀胱癌T24细胞抑制作用的体外研究[D]. 高明. 河北医科大学, 2010(04)
- [9]靶向AR基因的RNA干扰诱导膀胱癌T24细胞凋亡的实验研究[D]. 何围. 中南大学, 2010(11)
- [10]Twist基因在膀胱癌中表达与RNA干扰的实验研究[D]. 沈彬. 吉林大学, 2009(10)