导读:本文包含了高效表达载体构建论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:干扰素,黄芩,淀粉,碳水化合物,载体,基因,直链。
高效表达载体构建论文文献综述
蒋璐蔓,李崇,杨晓峰,彭俏丽,吴珍芳[1]（2019）在《靶向小鼠Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统高效切割位点筛选及其表达载体构建》一文中研究指出性反转是指动物表现的性别特征与其应有的性别相反的现象。性反转小鼠可作为动物模型研究哺乳动物性别分化机制、性别控制技术以及研究人类性别连锁疾病发病机理和防治方法。已有研究证明,在胚胎期敲除雄性小鼠的Y染色体将获得XO基因型的性反转小鼠。本研究设计了6个不同的sgRNA,使共能介导Cas9蛋白作用于小鼠Y染色体上的多拷贝基因—Rbmy(RNA-binding motif gene),通过比较不同的sgRNA介导Cas9对靶序列的切割效率,最终筛选出一条能够高效介导Cas9靶向Rbmy基因的sgRNA6,该sgRNA6在体外切割效率达到100%,细胞内切割突变效率为15.4%,利用该sgRNA6构建了靶向Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统表达载体。利用该载体转染小鼠雄性睾丸间质瘤细胞,成功获得了XO基因型的单细胞克隆团。本研究所构建的靶向Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统表达载体可用于小鼠胚胎注射,为获得Y染色体敲除的XO型性反转小鼠模型提供基础。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2019年12期）
王朋宝,张晶晶,石菁,王威,曹智[2]（2019）在《抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化》一文中研究指出【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显着提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.(本文来源于《甘肃农业大学学报》期刊2019年03期）
高何瑞[3]（2018）在《几种高效表达载体的构建及基于宏基因组库改造pfLamA葡聚糖酶的研究》一文中研究指出分子克隆是生物技术、遗传学、制药、蛋白质生物化学、结构生物学等领域的重要基础。近年来,随着下一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)的快速发展和应用,产生了大量的基因组信息。为了在功能研究中分析和利用这些重要的基因组信息,需要有效的分子克隆和蛋白质表达工具。现有的克隆和表达载体在克隆效率、表达方式和蛋白纯化方式等方面仍需进一步改进。为此,本研究设计和构建了一系列新型质粒载体,为解决上述难题提供了重要的工具。本研究采用新构建的质粒对激烈火球菌β-1,3-内切葡聚糖酶(pf LamA)基因和里氏木霉内切木聚糖酶(Hj-Xyn)基因进行了分子克隆、异源表达和蛋白纯化。同时还利用新构建载体,通过宏基因组区段改组的方式,对pfLamA进行了分子改造。首先,为了解决现有pET载体克隆效率不够高、容易出现假阳性、克隆位点的选择不够灵活等问题,本研究构建了一种迷你型的新质粒载体pANY2。该载体利用ccdB为负筛选标记,具有更高的克隆效率,而且假阳性率很低。此外,该载体的多克隆位点可以同时满足粘性末端克隆、平末端克隆和重组酶克隆的需要。更重要的是,该酶切位点还含有特殊设计的AhdI酶切位点,可以在实验室自制T载体,进行无背景的TA克隆。另外,该质粒还有T7启动子和组氨酸标签,可以满足蛋白质高效表达和纯化的需要。同时具备上述多种特征,属于国内外首创,这也决定了本质粒具有广泛的应用前景。第二,为了解决目前温度诱导型质粒的克隆效率低的问题,本研究构建了一种包含cIts857-pR/pL温敏调控原件的新质粒载体pANY3,既能显着提高克隆的效率,又可以实现温度诱导型蛋白表达。同时本研究还进一步分析了诱导温度对蛋白质表达水平和酶活力的影响,结果表明,诱导温度对于不同的蛋白的表达水平的影响差异非常显着,因此对诱导温度的优化十分必要。以往研究中多采用42℃固定温度进行诱导表达,而本研究结果对于纠正这一做法有重要的参考价值。第叁,现有的表达载体都只能进行单向表达,对于固定的目的基因来说,一次克隆步骤最终只能得到一个目标重组质粒。本研究构建了一种新型的双向表达质粒,可以通过TA克隆同时获得两个目标重组质粒。这两个目标重组质粒中的目的基因的插入方向相反,在不同的启动子作用下,可以分别实现IPTG诱导表达或温度诱导表达。这样既可以一步平行获得两个克隆,还可以方便的比较两种表达系统对同一个基因的表达效率。这种双向表达载体属于国内外首创,也对相关的研究具有重要的参考价值。第四,常用的基于组氨酸标签的重组酶纯化方法具有成本高的缺点,另外咪唑的使用也常常影响到酶活性。本研究构建了一种新的质粒载体pANY6,既可以进行高效的分子克隆,又可以采用简单的盐沉淀方法实现重组蛋白的纯化。该质粒含有具有自断裂功能的内含肽(Intein)及类弹性蛋白(ELP)的融合标签标签,利用ELP标签可通过沉淀步骤分离融合蛋白,并通过内含肽切去ELP标签。另外,本研究还探索了将ELP沉淀纯化过程与尿素变性、复性纯化包涵体过程相偶联,这样就能够有效避免了传统透析法除尿素的耗时操作。采用这种简便的偶联策略进行pfLamA纯化,最终纯化浓度提高近3倍,而总酶活提高近50%。这一研究结果对于不溶性的重组蛋白的纯化具有特别重要的意义。第五,本研究还采用新构建的克隆载体,采用宏基因组区段改组的方式,对pf LamA进行了分子改造。通过宏基因组16s测序,确定土壤样品的微生物组成,在此基础上通过pfLamA保守区设计简并引物,通过PCR从土壤基因组中获取与pfLamA具有同源性的DNA片段,通过重迭延伸重组全长基因,然后连接到质粒载体上构建突变体库,并进行活性筛选。这种宏基因组区段改组的方法在国内外未见报道,因此,本研究为土壤微生物酶的分子改造提供新思路,同时也验证了新型表达载体在构建突变库方面的有效性。综上所述,本研究设计和构建了一系列新型质粒载体,并在此基础上实现了pf LamA和Hj-Xyn的分子克隆、异源表达、蛋白纯化,和基于宏基因组改组策略的蛋白分子改造。这些新的质粒载体及其相关的研究方法对于同类研究具有非常重要的参考价值,并有望在生物科学、生物技术、农业和食品等领域具有广泛的运用前景。(本文来源于《沈阳农业大学》期刊2018-06-11）
刘奕彤[4]（2017）在《热纤梭菌阿魏酸酯酶的酶学特性分析及其植物高效表达载体构建》一文中研究指出阿魏酸和半纤维素、木质素共价交联形成木质素—阿魏酸—阿拉伯木聚糖复合物,是禾本科植物细胞壁形成坚固抗降解屏障的重要分子基础。在植物中异源表达阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase,FAE),可水解细胞壁中的阿魏酸酯键,促进细胞壁解聚,有效降低木质纤维素降解转化的成本,但目前仍面临转基因的常温FAE酶活性干扰宿主植物生长发育、降低抗逆性等技术挑战,而采用嗜热FAE酶基因进行遗传转化是一种重要的替代策略。本文对一种来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的嗜热FAE酶的酶学特性开展了系统的研究,并构建了该嗜热FAE酶编码基因的植物高效表达载体,为培育木质纤维素易降解的新型能源植物奠定了基础,其主要研究结果如下:1)分别克隆了热纤梭菌C.thermocellum XynZ的阿魏酸酯酶催化域(FAE)及该阿魏酸酯酶催化域和碳水化合物结合域(FAE-CBM6)编码基因,与pET22b连接分别构建了原核表达重组质粒pET22b-FAE和pET22b-FAE-CBM6,并在大肠杆菌BL21(DE-3)中实现异源表达,分别获得分子量约为29.0 kDa和45.0 kDa的重组蛋白产物。2)分析比较了温度、pH、底物、金属离子等因子对FAE和FAE-CBM6这两种重组嗜热阿魏酸酯酶活性的影响。结果表明,它们的最适温度分别为60℃和70℃,最适pH值分别为6.0和7.0。FAE酶在pH 5.0-pH 9.0范围内比较稳定,而FAE-CBM6酶在pH 4.0-pH 9.0范围内比较稳定;FAE酶在70℃或75℃下孵育2 h后其相对酶活仍能维持在60%以上,而FAE-CBM6酶在70℃孵育2 h后仍能维持80%以上的酶活。Mn2+和Zn2+对于FAE酶的酶活有促进作用,但Mg2+、Cu2+、Ni2+有抑制作用;而Cu2+和Zn2+对FAE-CBM6酶活有明显抑制作用。在同一反应条件下,FAE-CBM6的酶活一般比FAE的高,说明CBM6结合域的存在对该嗜热阿魏酸酯酶活性有促进作用。3)根据禾本科植物玉米(Zea mays)密码子偏好性对嗜热阿魏酸酯酶的编码基因序列进行了优化,并人工合成了优化后的基因序列,在此基础之上,通过与单子叶植物Ubiquitin强启动子、增强子Ω序列以及不同亚细胞定位信号肽(质外体或内质网定位信号肽)编码序列进行组合,构建了该嗜热阿魏酸酯酶基因的多种植物高效表达载体。(本文来源于《江苏大学》期刊2017-05-31）
李果明,雷桅,税晓容[5]（2016）在《黄芩CHS基因的分子克隆、序列分析及其高效表达载体的构建》一文中研究指出黄芩是一种传统的中药,黄芩苷是其重要的药用成分之一,具有广泛的药理作用并被用于多种疾病的治疗,具有巨大的药用价值和经济价值。CHS是催化黄芩苷合成限速步骤的关键酶,其表达量对黄芩苷的积累起关键的作用。本研究利用基因工程的手段,构建黄芩的CHS过表达载体,并将其导入根癌农杆菌中,拟在黄芩中持续表达CHS,促进黄芩苷合成。基于NCBI上公布的黄芩基因信息,设计特异引物,通过RT-PCR技术扩增CHS的c DNA全长序列,并利用生物信息学软件对序列进行分析,在引物两端引入特异酶切位点,将目的序列CHS通过限制性内切酶酶切和连接的方式,构建载体p BI 121-35S-CHS。通过PCR和酶切的方法进行验证,获得黄芩CHS基因的高效表达载体,可直接用于黄芩的遗传转化,使CHS基因表达量增加,促进黄芩苷的合成。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2016年10期）
李红,刘成倩,严华祥,王家豪,易建中[6]（2016）在《猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达》一文中研究指出干扰素(interferon,IFN)因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而备受关注。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核苷酸序列设计1对引物,通过PCR方法扩增出猪IFN-δ基因,片段大小为513bp,并将其克隆到原核表达载体上得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Transetta BL21(DE3)受体菌,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明,pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20ku,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。(本文来源于《中国畜牧兽医》期刊2016年04期）
李红,刘成倩,严华祥,王家豪,易建中[7]（2016）在《猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达》一文中研究指出干扰素因具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性及免疫调节作用而受到重视。本研究根据GenBank上公布的猪IFN-δ核酸序列设计1对引物,通过RT-PCR方法扩增出猪IFN-δ基因,其大小为513 bp,并将其克隆到原核表达栽体上,得到重组质粒。将重组质粒转化大肠杆茵Transetta BL(DE3)感受态细胞,经SDS-PAGE电泳分析,结果表明pET-30a-DsbA-IFN-δ表达量较高,表达的融合蛋白分子质量约20 kD,且主要以包涵体形成存在,经Western blotting分析发现表达的融合蛋白能与His标签单克隆抗体发生特异性反应。(本文来源于《第叁届规模化养猪新技术国际研讨会论文集》期刊2016-03-09）
张乐乐[8]（2015）在《Mycobacterium neoaurum高效表达载体的构建及其在合成雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮中的应用》一文中研究指出雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要甾体药物中间体,可合成多种甾体药物。目前,AD和ADD的生产主要采用微生物转化法实现。胆固醇氧化酶(Cho M)和3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)是分枝杆菌降解甾醇合成AD和ADD代谢途径中的关键酶。本实验室从自然界中筛选到一株转化植物甾醇高产ADD的新金色分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12,并对其植物甾醇代谢过程中的关键酶Cho M和KSDD进行了研究。本论文在此基础上,将Cho M和KSDD在原始菌中强化表达,以提高ADD的产量。(1)利用载体p MF41在M.neoaurum JC-12中分别加强表达Cho M(Cho M1和Cho M2)和KSDD。在M.neoaurum JC-12中Cho M2是主要的胆固醇氧化酶。重组菌M.neoaurum JC-12/p MF41-cho M2的AD和ADD摇瓶发酵产量分别为1.17 g/L和4.98g/L,分别比原始菌提高了27.2%和2.5%;重组菌M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd的AD和ADD摇瓶发酵产量分别为0.59 g/L和5.27 g/L,AD降低了35.9%,ADD提高了8.3%。(2)构建新金色分枝杆菌表达载体并对其进行优化。以tac启动子替换p MF41的启动子p ACE得到载体p MTac。重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-gfp的构建定性证明了p MTac在M.neoaurum JC-12中能够表达蛋白。M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd定量证明p MTac在M.neoaurum JC-12中的表达效果,M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd中KSDD的酶活达到2.41 U/mg,为原始菌的6.53倍。对载体p MTac的启动子的-10区序列进行优化得到载体p MTac-2。M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd的KSDD的活性达到5.16U/mg,比原始菌提高了15.12倍。全细胞转化试验中,重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd转化1 g/L AD,14 h时转化率达到82%,为原始菌的10.7倍;重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-2-cho M2转化1 g/L胆固醇,24 h时转化率达到56%,为原始菌的2.1倍。在摇瓶发酵试验中,M.neoaurum JC-12/p MTac-2-ksdd的AD和ADD产量分别为0.12 g/L和6.14 g/L,AD降低了86.9%,ADD提高了26.3%;M.neoaurum JC-12/p MTac-2-cho M2的AD和ADD产量分别为1.43 g/L和5.18 g/L,与原始菌相比分别提高了55.4%和6.7%。(3)将ksdd和cho M2在M.neoaurum JC-12中串联表达。5 L发酵罐中,以20 g/L植物甾醇为底物,重组菌M.neoaurum JC-12/p MTac-ksdd-cho M2的AD和ADD产量分别为0.62 g/L和10.47 g/L,与原始菌相比,AD的产量降低了50%,ADD的产量提高了27.4%。(本文来源于《江南大学》期刊2015-06-01）
牛福星[9]（2015）在《枯草芽孢杆菌转化方法的建立和Pglv高效表达载体的构建》一文中研究指出大肠杆菌表达系统,虽然它的载体、受体系统已经比较成熟完善,但其表达产物容易形成包涵体,分泌效率低,此外大肠杆菌是一种潜在病原菌,生长过程中不断释放脂多糖热原物质等内毒素,目前已被限制用于表达生产医药和食品。枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis)作为表达系统具有无致病性,不产生内毒素,严格生长在有氧条件下,容易将表达蛋白分泌到培养基中。此外芽孢杆菌的发酵技术已经非常成熟,如α-淀粉酶、蛋白酶等商品化的酶都是利用枯草芽孢杆菌生产的。本实验着重构建可调控的枯草芽孢杆菌高效表达载体。从筛选强麦芽糖启动子出发,并成功构建了麦芽糖诱导型表达载体Pglv-pHCMC04,并通过转化方法比较、优化得出最适转化枯草芽孢杆菌的方法：低盐环境饥饿法,即S法,转化效率达到1.2xlO~4CFU/μg DNA;后为了研究所构建的表达载体特性,本实验从大小基因及信号肽方面着手,通过连接红色荧光蛋白、带有地衣芽孢杆菌信号肽的高温淀粉酶基因、去掉信号肽的地衣芽孢杆菌高温淀粉酶基因、带有灰色链霉菌信号肽的淀粉酶基因等一系列报告基因对其特性研究得出：小基因在枯草中表达的可能性及大基因在枯草中表达需要带信号肽,且枯草在分泌胞外蛋白时对不同属的信号肽具有识别作用。然后对连接有地衣芽孢杆菌信号肽的高温淀粉酶基因进行发酵条件优化,从最适麦芽糖添加量、最适诱导温度、最适诱导物添加时间、和最适接种量几方面着手,进行单因素发酵条件优化,得出了最适的发酵条件,即：将过夜培养菌株接种2%至OD600达到0.55时添加1.5%麦芽糖,35℃下诱导,酶活达最高至2.53(U/mL)。最后通过反向PCR技术将麦芽糖启动子内部的代谢物阻遏元件cre序列进行定点CG→AT的突变,并在以上优化的实验基础上再次测定酶活力,得出高速产酶时间提前,且酶活力提高了近五倍,达到12.2(U/mL)。(本文来源于《广西大学》期刊2015-05-01）
李楠,赵吉元,尹悦佳,柳青,郭嘉[10]（2015）在《玉米淀粉分支酶基因SBEⅡ b高效沉默表达载体的构建及转化表达》一文中研究指出淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)是淀粉合成的限速酶。为了进一步研究SBEⅡb沉默对玉米生长及直链淀粉合成的影响,克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEⅡb基因片段,构建了SBEⅡb的发卡结构表达载体p TFU-SBEⅡb hairpin,用农杆菌介导法将其导入玉米HiⅡ幼胚中,经除草剂筛选获得了194株转化再生植株,其中4株结实,获得转基因种子35粒。T1代植株经PCR及试纸条检测获得3株阳性材料,半定量RT-PCR结果得出SBEⅡb的表达量降低,推断出基因表达水平降低对直链淀粉的合成具有正效应。(本文来源于《生物技术进展》期刊2015年02期）
高效表达载体构建论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显着提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
高效表达载体构建论文参考文献
[1].蒋璐蔓,李崇,杨晓峰,彭俏丽,吴珍芳.靶向小鼠Rbmy基因的CRISPR/Cas9系统高效切割位点筛选及其表达载体构建[J].畜牧与兽医.2019
[2].王朋宝,张晶晶,石菁,王威,曹智.抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化[J].甘肃农业大学学报.2019
[3].高何瑞.几种高效表达载体的构建及基于宏基因组库改造pfLamA葡聚糖酶的研究[D].沈阳农业大学.2018
[4].刘奕彤.热纤梭菌阿魏酸酯酶的酶学特性分析及其植物高效表达载体构建[D].江苏大学.2017
[5].李果明,雷桅,税晓容.黄芩CHS基因的分子克隆、序列分析及其高效表达载体的构建[J].基因组学与应用生物学.2016
[6].李红,刘成倩,严华祥,王家豪,易建中.猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达[J].中国畜牧兽医.2016
[7].李红,刘成倩,严华祥,王家豪,易建中.猪干扰素-δ基因原核表达载体的构建及高效表达[C].第叁届规模化养猪新技术国际研讨会论文集.2016
[8].张乐乐.Mycobacteriumneoaurum高效表达载体的构建及其在合成雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮中的应用[D].江南大学.2015
[9].牛福星.枯草芽孢杆菌转化方法的建立和Pglv高效表达载体的构建[D].广西大学.2015
[10].李楠,赵吉元,尹悦佳,柳青,郭嘉.玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb高效沉默表达载体的构建及转化表达[J].生物技术进展.2015
论文知识图
