王玢瑸[1]2016年在《新城疫病毒激活NLRP3炎症小体及其作用》文中研究说明新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus),基因组为单股负链不分节的RNA。NDV能引起对禽类高度致死的疾病新城疫,但对人类而言,NDV并不致病,而是一种重要的溶瘤病毒,研究NDV抗肿瘤的机制有利于NDV在抗肿瘤治疗中的应用。通常认为NDV抗肿瘤的效果源于病毒感染导致的细胞死亡和刺激天然免疫和适应性免疫反应。病毒感染会引起细胞死亡,但其机制并不相同,目前研究发现NDV能诱导细胞凋亡和自噬,凋亡是一种由半胱天冬酶(Caspase)调节的,细胞核和细胞质固缩,细胞膜逐渐形成凋亡小体的细胞死亡方式,不引起炎症,自噬同样不引起炎症,细胞发生自噬会降解细胞组分,在细胞内形成自噬泡,研究发现NDV导致的细胞凋亡在抗肿瘤效应中发挥了重要的作用,而引起的细胞自噬能通过抑制凋亡促进病毒复制,使病毒能大量复制,进而有利于其抗肿瘤,因此我们推测NDV是否引起其他死亡方式发挥抗肿瘤的作用,此外,NDV如何调节宿主天然免疫系统从而成功杀死肿瘤细胞的机制有待研究。天然免疫反应是抵御病原微生物的第一道防线,其中炎症小体是一种大分子的复合信号平台,它能活化前炎性因子pro-IL-1β和pro-IL-18,诱导一种细胞炎性死亡——焦亡(pyroptosis);炎性因子IL-1β和IL-18的分泌需要两个信号,第一信号是pro-IL-1β和pro-IL-18的表达,这由转录激活因子NF-κB信号通路调控,上游主要是模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),例如Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)等,第二信号来源于炎症小体的激活,它能导致Caspase-1自催化激活,活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18,形成有功能的活性形式;焦亡不同于其他细胞死亡方式,由Caspase-1调节,焦亡导致细胞膜破裂并释放大量炎症因子和病原微生物,引起病理性炎症。NDV在发挥抗肿瘤作用中是否会通过炎性小体的途径刺激机体的天然免疫系统,导致肿瘤细胞发生焦亡尚不清楚,围绕“炎症小体——炎症反应”信号通路为主要方向,利用NDV病毒与THP-1诱导的巨噬细胞模型进行了一系列的研究,研究结果表明:(1)NDV感染PMA诱导的THP-1细胞导致IL-1β分泌上调,THP-1细胞经PMA诱导分化形成巨噬细胞,NDV强毒株Herts/33感染12h后,IL-1β分泌显著上调,IL-1β分泌量与病毒感染时间和计量正相关,但UV灭活的病毒不能诱导巨噬细胞分泌IL-1β,通常IL-1β由Caspase-1剪切,Caspase-1的活性由炎症小体调控,采用Caspase-1的抑制剂处理后发现NDV诱导的IL-1β显著下调,表明NDV能诱导IL-1β分泌,且该活性由Caspase-1调控,以上结果表明NDV感染巨噬细胞能够激活炎性小体,诱导IL-1β分泌。(2)NDV激活NLRP3炎症小体,我们通过构建稳定表达shRNA的THP-1细胞系,干扰NLRP3的表达,Western blot结果显示NLRP3干扰细胞系中NLRP3的表达水平下降,已知ATP是NLRP3的阳性刺激物,因此采用LPS+ATP刺激干扰NLRP3的THP-1细胞,结果发现在干扰细胞系中,ATP诱导的IL-1β分泌显著下降,这表明NLRP3干扰成功。NDV感染该细胞系后,IL-1β分泌量同样下降了,同时还构建了NLRP3炎症小体的其他组分的干扰细胞系,ASC和pro-Caspase-1干扰细胞系,结果同样显示NDV诱导的IL-1β水平下调;还通过NLRP3敲除小鼠的骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)验证,以上结果证明NDV可以激活NLRP3炎症小体。(3)NDV感染激活炎症小体,导致细胞发生焦亡;炎症小体活化能诱导一种细胞死亡方式——焦亡,分析NDV对NLRP3干扰细胞系的细胞毒性,细胞接种1MOI的Herts/33后,18h检查细胞死亡情况,相比对照组,干扰细胞系均存活率更高,为了进一步验证该结果,采用了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制剂处理细胞,其中Caspase-1调节焦亡,Caspase-3调节凋亡,Caspase能抑制所有该家族的酶类,结果发现抑制剂能下调细胞死亡率,进一步研究结果发现NDV感染THP-1和HeLa细胞均能诱导GSDMD的剪切,剪切下来的GSDMD的氨基端能直接诱导细胞焦亡,以上结果显示NDV感染可以诱导NLRP3炎症小体活化,并进一步引起细胞焦亡。(4)炎症小体活化能抑制NDV复制,0.01 MOI Herts/33接种THP-1细胞后,不同时间点检查病毒滴度,结果发现在60h时,在NLRP3,ASC和Caspase-1的干扰细胞系中,病毒滴度较高,病毒复制可能得益于细胞未发生焦亡,延长了病毒复制时间,为了进一步验证此结果,我们同样测定了Caspase-1、Caspase-3和Caspase抑制剂处理细胞中的病毒滴度,结果一致,这表明NLRP3炎症小体在抵抗NDV感染中发挥重要作用。(5)NDV的P和V蛋白能抑制NLRP3炎症小体活化诱导的IL-1β分泌;我们构建了稳定表达病毒蛋白P、V、W和NP的THP-1细胞系,相比对照组,表达P和V蛋白的细胞在LPS+ATP的刺激下,细胞上清中检查到更少量的IL-1β,为了验证这一结果,选择天然缺失NLRP3和ASC的293T细胞,转染炎症小体组分,重建NLRP3炎症小体,结果发现P和V蛋白同样能抑制IL-1β的分泌,在293T中转染NLRP3和ASC与病毒蛋白,间接免疫荧光结果发现P和V蛋白与NLRP3共定位,以上结果证明NDV的P与V蛋白抑制NLRP3炎症小体活化。本文使用THP-1细胞,证明了NDV能诱导NLRP3炎症小体的活化,并引起细胞炎性死亡焦亡,在细胞水平上验证了NLRP3炎症小体与病毒复制的关系,NLRP3炎症小体是细胞对NDV感染的天然免疫反应,能抑制病毒复制,而病毒蛋白P和V能抑制NLRP3炎症小体的活性,本研究为进一步揭示NDV抗肿瘤机制和应用提供了理论基础。
康银峰[2]2016年在《NDV调控PI3K介导的信号通路研究》文中进行了进一步梳理新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的一种高度接触性传染病。强毒NDV能引起感染鸟类消化道和呼吸道出血或中枢神经系统损伤。自1926年在印度尼西亚和1927年在英国首次暴发ND以来,该疾病现已呈全球分布,包括亚洲、欧洲、非洲和南美洲等全球六大洲都曾多次报道过ND的疫情。目前在全球的多个国家以Class I、Class II基因VI型和基因VII型的NDVs流行和传播为主;但如基因XVII型和基因XVIII型等新型的NDV毒株不断在非洲等国家出现。NDV的宿主范围非常广,能感染超过250种鸟类,而野鸟一直被认为是NDV的天然宿主和传播载体,带毒的野鸟可能通过直接接触在鸟类,甚至在家禽间传播该疾病,对养禽业造成巨大的经济损失,然而目前带毒的野鸟和家禽之间的传播模式仍然有待进一步研究。因此,从2010年开始,我们对广东省活鸟市场进行NDV的流行病学监测,并且进一步研究在不同宿主上分离到的NDV对不同鸟类的致病性和传播特性。在本研究中,从广东省活鸟市场中鸡、鸭和鸽等宿主中分离到25株NDVs,并对这25株NDVs的基因型和致病特性进行了分析。为了模拟活鸟市场不同种鸟类的自然传播特性,选择了其中5株分别分离于鸡(GM)、鸭(SS-10、NH-10和YF18)、鸽(GZ289)不同宿主的代表性毒株,研究它们分别对鸡、鸭和鸽不同宿主的致病性和传播特性。对鸡、鸭和鸽通过点眼滴鼻方式分别以106 EID50接种病毒,感染8 h后,分别在每个感染组的实验动物中放置相对应的3个同居对照动物做水平传播实验。实验结果表明广东省内活鸟市场存在多种NDV的基因型,并且来源不同的鸟类有不同的组织趋性和宿主范围。病毒感染与致病是病毒和宿主相互作用的结果,既有病毒为逃避宿主防御机制而发挥抗病毒作用,维持自身的复制,也有宿主为清除病毒而调动固有免疫体系迅速产生效应分子和免疫效应,构建机体抵御病毒入侵的生物防线。为了阐明NDV的致病机制,本研究通过NDV感染鸡胚成纤维(Chicken embryo fibroblast,CEF)细胞在病毒感染早期短暂激活PI3K/Akt信号通路,并且在NDV感染CEF细胞15 min后观察到Akt磷酸化。而NDV激活Akt的磷酸化在感染后1 h达到顶峰,感染24 h后逐渐减弱。紫外灭活的NDV也能够激活PI3K/Akt信号通路,表明激活这条信号通路并不需要病毒复制。另外,在NDV感染CEF细胞前先用PI3K特异性抑制剂LY294002或者Wortmannin处理CEF细胞后再用NDV感染处理过的细胞,能够明显观察到Akt的磷酸化被抑制了,同时NDV病毒滴度也减少。最后,网格蛋白介导内吞作用的抑制剂甲基-β-环糊精和氯丙嗪能够抑制GM和F48E9毒株诱导的Akt磷酸化,却对疫苗毒La sota诱导的Akt磷酸化没有明显影响,提示NDV侵入细胞可能与PI3K/Akt信号通路有关。然而,抑制PI3K/Akt信号通路的激活能够加强NDV感染CEF细胞早期诱导的细胞凋亡反应,如Caspase 3和PARP裂解加强、GSK 3β磷酸化减少和Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞增多。此外,泛半胱天冬酶抑制剂ZVAD-FMK和PI3K抑制剂LY294002能够通过抑制细胞凋亡促进PI3K激活,导致Akt磷酸化增多和病毒复制增强,同时促进NDV感染的细胞宿主生存,提示PI3K/Akt信号通路具有抗凋亡作用和促进NDV复制。根据底物特异性和序列同源性,PI3K分为3类:class I、class II和class III。PI3K I类激活Akt/mTOR信号通路,促进营养物质的摄取和代谢活动抑制自噬,然而PI3K III类Vps34结合Vps15转换PI为PI(3)P促进自噬的发生。NDV既能诱导自噬,也能诱导细胞凋亡。尽管细胞凋亡和自噬承担不同的形态特征和生理过程,然而两者之间存在错综复杂的相互作用仍然不明确。因此为了深入阐明NDV的致病机制和探讨NDV与宿主细胞相互作用的分子机制,本研究分析了NDV诱导PI3K介导的自噬和细胞凋亡对NDV复制的作用。在本研究中,相对于阴性对照组,NDV感染或者饥饿诱导CEF细胞在早期能观察到LC3-I向LC3-II转化、p62/SQSTM1发生降解和通过透射电子显微镜观察到自噬体增多等现象,表明NDV感染或者饥饿诱导CEF细胞能够诱导自噬。然而紫外灭活的NDV感染CEF细胞却没有能够观察到LC3-I向LC3-II转化、p62/SQSTM1降解等现象,同时Caspase 3和PARP也未发生裂解,说明自噬体的产生需要病毒复制。在体内外NDV感染实验发现,NDV感染早期可以观察到Caspase 3和PARP分裂以及通过FITC-V/PI染色的凋亡细胞数均表明抑制自噬能够加强细胞凋亡反应。类似地,诱导自噬减少细胞凋亡反应。此外,除了Beclin 1,诱导自噬能够增加NDV感染SPF鸡的脾脏和肺脏中的自噬相关基因、抗凋亡因子(Bcl-2和Bcl-x L)和促炎症因子(IL-6和IL-1β)的表达水平,同时减少脾脏和肺脏中的凋亡细胞。然而半胱天冬酶通用抑制剂ZVAD-FMK抑制细胞凋亡能够促进LC3-I向LC3-II转化和p62/SQSTM1发生降解,同时还能够增强病毒复制,表明抑制NDV感染CEF诱导的细胞凋亡能够促进自噬的发生和细胞生存。综上所述,研究结果揭示了PI3K/Akt信号通路和自噬与细胞凋亡的关系对NDV感染宿主细胞的分子机制,这将有助于理解NDV与宿主细胞相互作用的分子机制和NDV的致病分子机制,为ND的防控提供新的思路。
程靖华[3]2016年在《TLR3调控新城疫病毒复制及细胞自噬的分子机制研究》文中认为新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)可以引起禽类的呼吸道疾病和死亡,给养禽业造成巨大的经济损失。NDV也能在人类肿瘤细胞中复制并破坏肿瘤细胞,因此作为一种溶瘤病毒被广泛关注。近年来,病毒感染诱导的天然免疫机制逐渐成为研究热点。Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是新发现的一类细胞表面受体,其中的TLR3能够识别病毒相关的dsRNA或dsRNA模拟物poly (I:C),在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。目前,关于NDV诱导的TLR3信号通路及其对病毒复制的影响还没有相关报道,激活的TLR3信号通路与细胞自噬之间是否具有联系也不清楚。为了探究这些问题,我们开展了以下的研究：1.NDV感染与TLR3信号通路的激活用NDV Herts/33强毒株感染HeLa细胞系,以Western-blot和免疫荧光方法鉴定被感染细胞的TLR3变化。发现Herts/33强毒株感染能够显着提高TLR3的水平,在感染后12-24h最为明显。使用dsRNA特异性抗体进行染色,发现NDV复制过程中能够产生dsRNA,并激活TLR3信号通路；而紫外灭活的NDV不能激活该通路。采用NDV La Sota弱毒株进行了相同的实验,所得到的结果与Herts/33强毒株相同。由此可见,NDV在感染细胞内复制过程中产生的dsRNA能够被TLR3识别并将其活化。2.TLR3信号通路与NDV复制的关系构建人TLR3 (hTLR3)的真核表达质粒,转染HeLa细胞系后检测过表达TLR3对NDV感染的影响。hTLR3过表达能够显着抑制病毒蛋白的转录和翻译,减少细胞上清中的病毒滴度。将TLR3干扰RNA (siRNA)转染HeLa细胞系后,TLR3的表达受到抑制,病毒蛋白的转录和翻译水平上调,病毒滴度增加。以real-time PCR检测过表达TLR3后对干扰素和炎性因子产生的影响,IFN-β、IL-6、 IL-8和IFIT1 mRNA水平与对照组发生显着变化。使用荧光素酶报告基因的方法检测了转染TLR3的细胞在感染NDV以后IFN-β、NF-κB启动子活性,两个启动子的活性显着增强。上述结果表明,TLR3在NDV感染中通过诱导干扰素的释放和炎症因子的产生发挥其抗病毒作用。3.抗NDV感染天然免疫中TLR3和RIG-I信号通路的关系评价了TLR3和视黄酸诱导基因蛋白-I(retinoic acid-inducible gene 1, RIG-I)信号通路在抗NDV感染中作用。将TLR3 siRNA、RIG-I siRNA、TLR3 siRNA+RIG-I siRNA分别转染HeLa细胞,然后感染NDV,以real-time PCR的方法检测IFN-β、IL-6、IL-8.IFIT1 mRNA水平的变化。发现单独干扰TLR3的细胞中炎症因子IL-6、IL-8 mRNA表达的水平低于单独干扰RIG-I的细胞,而单独干扰RIG-I的细胞中IFN-p mRNA表达水平低于单独干扰TLR3的细胞。此外我们还通过双荧光素酶报告基因的方法检测了IFN-β、NF-κB启动子活性的变化,同样发现单独干扰TLR3时NF-κB启动子的活性低于单独干扰RIG-I时,单独干扰RIG-I时IFN-β启动子的活性低于单独干扰TLR3。综上所述,两种天然免疫的模式识别受体TLR3和RIG-I对下游干扰素和炎性因子的调节方式是不同的,两者共同参与了NDV介导天然免疫反应。4.TLR3信号-通路激活与细胞自噬的关系用TLR3配体poly (I:C)处理A549细胞系,转染GFP-LC3质粒12-24 h后,GFP-LC3在细胞中呈现显着的点状分布;Western-blot显示细胞内的LC3-I向LC3-Ⅱ的转化。同时,用poly(I:C)处理HeLa田胞系,也得到了相同的结果。说明TLR3激活后可以引起自噬。为了探究TLR3激活后引起的白噬是否为完整的自噬,我们用poly(I:C)刺激后对p62的降解进行了检测,使用溶酶体抑制剂处理后western-blot检测LC3-II的turnover,并且通过荧光观察了GFP-LC3与LAMP1的共定位。综上所述,poly (I:C)刺激后能够引起细胞自噬,并且产生完整的自噬流。5.TLR3信号通路激活后诱导细胞自噬的机制通过免疫荧光的方法,观察了TLR3及下游蛋白与Beclin-1的共定位。通过免疫共沉淀的方法,对TLR3及下游接头蛋白与自噬相关蛋白进行互作研究。结果显示,TLR3信号通路激活后,下游接头蛋白TRIF与Beclin-1能够发生部分共定位,并且发生相互作用,互作的区域在TRIF的TIR结合域和Beclin的BH3功能域。自噬未激活时,Beclin-1与B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)结合。综上所述,TLR3信号通路激活后,下游接头蛋白TRIF与Beclin-1相互作用,竞争性地抑制Bcl-2与Beclin-1结合,正向调控细胞白噬的过程。6.NDV病毒蛋白NP、P通过内质网应激诱导细胞自噬分别构建了NDV各结构蛋白的真核表达质粒并转染A549细胞系,以Western-blot和荧光试验鉴定细胞自噬的产生以及内质网稳态的改变。结果显示,NDV NP和P转染细胞后能够引起细胞自噬以及内质网应激。此外NP和P还能够激活非折迭蛋白通路(unfolded protein response, UPR)中的PERK和ATF6通路,而XBP1通路不被激活。将PERK和ATF6干扰后能够抑制NDV诱导的自噬,降低NDV的复制水平。结论：本研究证明了TLR3信号通路在NDV感染细胞后可以被激活,TLR3通过促进下游细胞因子和干扰素的释放发挥抗病毒作用；证实Beclin-1能与TLR3信号通路中的接头蛋白TRIF互作,促进自噬的发生；发现NDV的NP和P蛋白能够通过内质网应激相关的非折迭蛋白通路调控细胞自噬。
高小龙[4]2016年在《新城疫病毒HN蛋白纳米抗体的筛选及功能研究》文中提出新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种严重危害鸡和多种禽类的急性高度接触性传染病。自1926年首次报道以来,ND在全球范围内已发生四次大流行,给各国养禽业造成了巨大的经济损失,同时也严重威胁着野生鸟类健康,是影响养禽业最主要疫病之一,被国际兽医局(Office International Des Epizooties,OIE)列为必须通报的动物疫病。过去几十年,由于世界各国采取了严格的疫苗免疫措施,使ND的大规模流行得到了有效控制,然而免疫鸡群发生ND的情况仍然存在,并且不断从免疫鸡群中分离到致病性NDV,同时研究表明现有疫苗和治疗性生物制品并不能完全阻止ND的传播,因此很有必要尝试开发新的产品以用于ND的防控。20世纪90年代后期,Hamers等在骆驼科和鲨鱼科动物体内首次报道了重链抗体的存在,克隆其具有抗原结合能力的可变区后即为VHH(Variable domain of camelid heavy-chain antibody)。由于VHH为单域结构,分子量仅为常规抗体的1/10,且大小在纳米级,因此又被称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。分析重链抗体重链可变区后发现,相比常规抗体而言,VHH抗体FR2区(Framework regions,FR)37、44、45和47位发生亲水性氨基酸替换,CDR1(Complement determine region,CDR)和CDR3区存在额外半胱氨酸残基,且CDR3区较常规抗体CDR3区要长。上述结构特点使纳米抗体具有分子量小、结构稳定、亲和力高、不易聚集、可识别常规抗体不能识别的结构和一些隐蔽表位等优点。因此,纳米抗体是病毒性疾病诊断和治疗的理想分子,但目前尚未见有关抗NDV纳米抗体的报道。本研究为了获得抗NDV的纳米抗体,首先构建了NDV免疫纳米抗体酵母双杂交文库,并对文库质量进行了评价;以截短的NDV HN蛋白为靶标,构建p GBKT7-HN诱饵质粒,对纳米抗体酵母双杂交文库进行筛选,并将筛选出的纳米抗体表达纯化后进行活性鉴定;同时构建了二聚化纳米抗体,比较了二聚化纳米抗体和单体纳米抗体的反应活性;最后构建了稳定表达纳米抗体的DF-1细胞系,探究了稳定表达纳米抗体对NDV增殖的影响。主要内容如下:(1)利用新城疫(La Sota株)和H9禽流感(F株)二联灭活疫苗参照骆驼与成年鸡体重比对6月龄雌性双峰驼进行5次免疫,免疫后通过HI试验监测双峰驼体液免疫应答水平,当抗体水平最高时采集外周血,分离外周血淋巴细胞。以分离的外周血淋巴细胞为起始材料,抽提总RNA,通过巢式PCR扩增编码VHH的基因序列。将带有同源臂的VHH PCR产物与线性化的p GADT7-Rec质粒共转Y187酵母感受态细胞,通过在酵母细胞内同源重组来构建纳米抗体酵母双杂交文库。经测定,构建的文库库容为1.25×107,滴度为3.45×108cfu/m L,文库插入效率为96%;随机挑取10个PCR阳性的克隆做测序比对,结果显示均为VHH抗体序列,且序列各不相同,表明文库多样性良好。(2)以NDV HN蛋白编码基因为模板,PCR扩增得到截掉跨膜区的HN基因序列(49-577位氨基酸),克隆至p GBKT7载体上构建诱饵质粒p GBKT7-HN。诱饵质粒转化Y2H Gold酵母感受态细胞后,进行自激活能力和毒性验证,结果表明此诱饵菌无自激活活性和毒性。以此诱饵菌与文库菌进行杂交来筛选抗HN蛋白的纳米抗体,筛选到的阳性克隆进行文库质粒拯救,拯救的阳性质粒与诱饵质粒再次共转Y2H Gold感受态细胞进行确证,最后对确认的真阳性质粒进行序列测定和比对分析,最终成功获得7株阳性克隆。(3)将获得的7株抗体序列克隆至原核表达载体p HSIE上,构建纳米抗体原核表达质粒p HSIE-VHH;转化Rosetta感受态细胞进行诱导表达,并优化表达条件,发现纳米抗体在IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导6 h时表达量最佳;按照优化的最佳表达条件进行大量诱导表达后,参照Clontech公司的Talon Metal Affinity Resin树脂说明书纯化重组蛋白,并优化了纯化时的洗脱条件,获得了杂带少、条带单一的VHH抗体。同时为鉴定纯化的VHH抗体与NDV和HN蛋白的反应活性,本研究进行了血凝抑制试验(Haemagglutination inhibition assay,HI)、间接ELISA、斑点杂交、Pull down、免疫细胞化学试验和细胞中和试验。HI试验结果显示,7株VHH抗体可不同程度抑制多种NDV毒株的血凝活性,但HI滴度均显着低于阳性血清对照(P<0.05)。间接ELISA结果表明,VHH抗体均可与NDV反应,其OD450值显着高于阴性对照(P<0.05),且VHH3、VHH4、VHH5、VHH6和VHH7的反应性高于阳性对照。斑点杂交结果显示,VHH抗体可识别非变性的NDV病毒粒子。Pull down试验进一步证明VHH抗体可与HN蛋白反应。细胞免疫化学试验结果显示,VHH抗体还可识别被病毒感染的DF-1细胞内的NDV抗原。最后,细胞中和试验发现部分VHH抗体可在感染早期干扰病毒的复制。(4)为改善VHH抗体的反应性和中和活性,利用一段linker通过Overlap PCR将2个VHH单体进行串联后克隆至表达载体p HSIE上,构建了二聚化VHH抗体表达载体p HSIE-Dim VHH。将p HSIE-Dim VHH转化Rosetta感受态细胞后,进行了二聚化抗体的诱导表达,并优化了表达条件,结果发现二聚化VHH抗体在IPTG终浓度为0.4mmol/L,诱导12 h后表达量最佳。根据Talon树脂(Clontech)操作说明纯化了二聚化VHH抗体,并优化了纯化条件,最终获得了较纯的二聚化VHH抗体。间接ELISA和中和试验结果显示,二聚化VHH抗体的ELISA反应活性高于单价VHH抗体,但中和活性并无改善。(5)为了探究VHH抗体在细胞内的抗病毒活性,本章构建了纳米抗体慢病毒表达载体,与包装辅助质粒共转染293T细胞后,拯救出了慢病毒,再通过慢病毒转导的方式将VHH抗体导入DF-1细胞中,经过嘌呤霉素筛选后获得了稳定表达VHH抗体的细胞系,并在稳定表达VHH的细胞系对NDV增殖情况进行了探究,发现稳定表达VHH的可抑制NDV的增殖。
王学艳[5]2008年在《NDV分离株F及HN基因的遗传变异分析与核酸疫苗质粒的构建》文中提出新城疫病毒(NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽病毒属的成员,是有囊膜的负链RNA病毒,可引起禽类的新城疫。我国经过多年的综合防制,现已基本控制了该病的流行。近年来,我国新城疫的发生出现新的特点,即非典型新城疫病例日益增多,高抗体鸡群出现发病等。许多学者认为这可能与NDV毒株变异有关。开展NDV的病原研究和新型疫苗的开发显的尤为重要。本研究对6株NDV分离株的F、HN基因的遗传变异进行研究,目的是从分子水平上了解我国NDV流行毒株与疫苗毒株的分子差异,探索新城疫疫苗免疫失败的原因;采用生物信息学工具对NDV分离株的F蛋白的结构与参考毒株进行了比较分析,目的为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供依据;克隆了NDV-F基因和鸡的IL-2基因,构建了鸡新城疫核酸疫苗质粒,旨在为预防NDV感染的辅助免疫提供理论基础和技术支持。研究内容如下:1.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株(ZD、JZ、XB、CA、ZZ、CC)的F基因主要功能区片段进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的F基因进行核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%之间;分离毒株与参考毒株F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%之间;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;其F基因的分子特性显示6个分离株均属基因Ⅶ型。研究结果提示,6个NDV分离株可能是同一毒株在传播过程中发生的不同变异株。NDV分离株与临床常用疫苗株的F基因同源性较低,在遗传进化上亲缘关系较远,这可能是疫苗免疫鸡群发病的重要原因之一。2.应用RT-PCR方法对6个NDV分离株的HN基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的NDV参考毒株的HN基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列分析。结果表明,6个NDV分离毒株间的HN基因核苷酸和HN蛋白氨基酸同源性分别在98.7%~99.8%和98.1%~99.7%之间;分离毒株与参考毒株HN基因核苷酸HN蛋白氨基酸序列同源性分别在78.22%~85.3%和82.6%~90.0%之间;6个NDV分离株的HN蛋白均属于HN571亚型,分离株与常用疫苗株的HN基因同源性较低。5个NDV分离株中的HN蛋白在538~540aa缺失潜在糖基化位点。3.对NDV分离株ZD的F基因进行了序列测定,对其推导氨基酸序列与GenBank登录的NDV参考毒株的F蛋白序列进行了结构分析。ZD株的F基因的开放阅读框架编码553个氨基酸的F蛋白。二级结构分析后发现,ZD株的F蛋白的α螺旋中心、β-折叠、转角和无规则卷曲的分布与JS-2-06株最为接近,与常规疫苗株La Sota、Clone-30、B1和V4等毒株相比,在124-167aa的α螺旋中心分为两段,在377-386aa少一个β-折迭区域。对蛋白B细胞抗原表位、跨膜结构分析后发现,ZD株B细胞抗原表位4个参数共同区的分布与F48E9、Mukteswar和JS-2-06相似。而比La Sota、Clone-30、B1和V4株在110-117aa区段多一个共同区域。利用生物学软件对ZD株F0蛋白的叁维空间结构进行了预测。这为在核苷酸和氨基酸水平解释NDV分离株生物学特性的变异提供了研究线索。4.将NDV分离株的F基因成功地插入到pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F;将NDV的F基因和鸡IL-2基因串联插入pcDNA4/HisMax,构建了新城疫核酸疫苗质粒pcDNA4-F+IL-2,并进行了鸡的免疫试验。试验显示,构建的新城疫核酸疫苗质粒对NDV感染有一定的保护作用。这为新城疫的核酸疫苗研究提供了有用的资料。
李亚玲[6]2016年在《S1PR1调控不同毒力新城疫病毒诱导炎症反应的机制研究》文中研究说明新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种以禽类呼吸道、消化道黏膜出血为特征的急性、烈性、败血性传染病。NDV感染引起机体各组织不同程度的渗出性炎症,反映了NDV致病能力的高低,然而目前对其炎症反应的机制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇受体1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1)是病毒诱导的炎症致病中关键的免疫调节因子,关于禽类S1PR1分子的功能研究鲜见报道,鸡S1PR1在ND炎症反应的功能值得探讨。本研究分别以强、弱NDV毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、鸡髓样树突状细胞(m DCs)和SPF鸡为模型,通过体内和体外试验综合比较不同毒力NDV感染引起的炎症反应及S1PR1的表达差异;在此基础上,研究S1PR1调控NDV引起宿主炎症反应的分子机制,为临床上控制NDV感染引起的炎症反应及应用免疫调节性药物防治ND提供理论指导。本研究主要内容如下:1.不同毒力新城疫病毒感染引起的鸡炎症反应及鸡S1PR1基因的表达本研究首先选取2株生物学特性差异较大的NDV毒株GM株和La Sota株感染SPF鸡,观察不同毒株引起的炎症表现,并通过荧光定量PCR对促炎性细胞因子IL-1β的转录进行分析。强毒株GM株感染后表现出渗出性炎症症状,感染鸡呼吸道出现大量黏液,消化道有明显的出血点;而La Sota株仅表现出轻微的呼吸道症状。组织切片观察可见,在GM株感染鸡的脑、肺脏、脾脏和腺胃中出现出血和大量炎性细胞浸润等炎性显微病理变化,La Sota株仅有少量炎性细胞聚集。GM株在小肠、脑、法氏囊、腺胃和盲肠扁桃体中增殖显着上调,依次为27.5倍、14倍、5.6倍、3.8倍和3.5倍;La Sota株仅在脑中增殖水平较高(6.8倍)。在感染组脏器中检测到IL-1β的上调表达,GM组高达8.7倍,La Sota组达到6.4倍,GM组的表达水平达显着高于La Sota组。NDV感染后S1PR1在脑、肝脏、腺胃和法氏囊中表达量较高,最高可达6倍(脑),最低为2倍(法氏囊);在肾脏、小肠和胰腺等组织中表达下调。为研究鸡S1PR1的功能,本研究从DF-1细胞中扩增了鸡S1PR1基因,并构建了真核表达载体p CI-S1PR1,在DF-1细胞中鸡S1PR1基因得到了有效的表达。2.S1PR1参与调控NDV诱导的炎症反应为探究S1PR1与NDV炎症的关系,本研究检测了NDV感染后DF-1细胞中炎性细胞因子及S1PR1的表达:GM感染后IL-1β、IL-6和IL-18表达显着上调,依次达22倍、41倍和5.5倍,La Sota株感染组与对照组无显着差异,仅有2倍、1.2倍和1.5倍上调;GM感染诱导IL-8和CCL5 48倍和9.2倍的上调表达,La Sota株感染组也有8.5倍和4.3倍上调表达,显着高于对照组;TNF-α在La Sota组后呈2.8倍的上调表达,而GM组表达下调。GM株感染引起S1PR1基因2.5倍的上调表达,而La Sota株感染后S1PR1的表达水平无显着差异;NDV感染3 h起,可在感染细胞中检测到S1PR1的蛋白表达,且GM组表达水平高于La Sota组。使用W146抑制S1PR1基因表达后,显着下调IL-6(40倍)和IL-1β(10倍)的转录和160 pg/m L、250 pg/m L蛋白表达。S1PR1过表达显着上调NDV诱导的IL-1β的基因转录(5倍)和蛋白表达水平(250 pg/m L),下调IL-6的表达210 pg/m L。抑制或过表达S1PR1基因不影响NDV的复制与增殖。3.S1PR1调控新城疫病毒感染引起炎性反应的信号通路研究为进一步研究S1PR1对NDV炎症反应的调控机制,选择与诱导IL-1β表达相关的核转录因子NF-κB开展研究。本研究利用NDV强毒GM株感染DF-1细胞,在GM株感染早期Rel A/p65的表达水平显着上调,在感染3 h其m RNA水平达到6.7倍,至感染6 h达到最高峰(10.8倍),后呈下降趋势,感染24 h其表达水平与未感染组无显着差异;NDV感染后细胞荧光素酶值显着上调,高于对照组12倍;在感染3 h其蛋白表达水平最高,随着感染时间的延长逐渐降低。W146处理后,NDV感染引起的NF-κB转录显着下调,比DMSO处理组降低了10倍;其荧光素酶值显着下调了1.5倍。此外,W146处理组NF-κB的蛋白表达水平和亚细胞定位情况与DMSO处理组无显着差异。由于NF-κB的激活还需要IκB蛋白的磷酸化等过程,因此,本研究对于S1PR1能否调控NF-κB信号通路还不能提供明确的结论,具体通路有待研究。4.不同毒力NDV诱导的鸡DC细胞炎症反应为了更加全面地研究NDV感染引起的鸡炎症反应,本研究选择具有抗原递呈功能的树突状细胞(DC)作为模型,研究NDV在其中的炎性反应。首先从雏鸡骨髓中分离单核细胞,利用GM-CSF和IL-4在体外诱导分化成DC。根据细胞分化周期和病毒感染特性,在细胞培养第3天分别接种NDV毒株GM株和La Sota株,检测NDV复制以及炎性细胞因和S1PR1的表达。结果显示,NDV在DC中能够有效复制并形成细胞病变,GM株最高滴度可达107.2 TCID50/100μL,与La Sota株最高峰值差约为10 000倍。GM组感染后IL-1β(10.2倍)、IFN-β(7.6倍)和CCL5(35.4倍)的表达显着上调;而La Sota株诱导IL-10表达(峰值为7.5倍),上调CCL5表达(14.3倍)。S1PR1基因在DC细胞中呈下调表达。本研究从NDV感染过程中机体免疫和病毒感染的动态变化出发,结合对免疫调节分子S1PR1的研究,对NDV感染导致机体渗出性炎症的分子机制进行研究。主要发现了S1PR1分子在NDV感染禽类的炎症反应中具有调节细胞因子表达水平的作用,丰富了NDV致病机制的内容,为临床上控制NDV感染引起渗出性炎症及应用免疫调节性药物防治ND提供科学的理论指导。
靳继惠[7]2017年在《HN蛋白的来源和长度对新城疫病毒生物学特性的影响》文中提出新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽类的一种急性、高度接触性传染病。NDV的血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase protein,HN蛋白)是其表面重要的囊膜糖蛋白之一,它介导了病毒与宿主细胞受体的特异性结合,并且在子代病毒释放和促进细胞膜融合方面也扮演了重要的角色。因此,研究HN蛋白在病毒致病机制中的作用具有重要的意义。HN蛋白在决定病毒毒力和组织嗜性中具有重要作用,但利用不同毒株、甚至不同学者利用相同毒株得出的研究结果存在差异。为系统研究HN蛋白对NDV生物学特性的影响,本研究分别以Class Ⅱ的基因Ⅶ型强毒株SG10和基因Ⅱ型弱毒株LaSota为骨架,利用同源重组和反向遗传操作技术构建了一系列含不同来源HN蛋白的重组NDV,并评价了这些重组病毒的生物学特性和不同来源HN蛋白的活性。研究结果显示,YuHN显着降低了 rSG10的复制效率,SGHN和BJHN显着提高了 rLaSota的前期增殖能力;以强毒株rSG10为骨架的重组NDV毒力均低于亲本病毒,其中rSG10-YuHHN转变为中等毒力毒株,以弱毒株rLaSota为骨架的重组NDV毒力均高于亲本病毒,其中rLaSota-SGHN的毒力升高最为明显;rSG10-YuHN对鸡的致病性明显低于亲本病毒rSG10,rLaSota-SGHN与亲本病毒rLaSota相比对鸡的致病性有所提高;BJHN、LaHN、HBHN、YuHN显着降低了 rSG10的红细胞吸附活性、神经氨酸酶活性和细胞融合能力,SGHN、BJHN显着提高了 rLaSota的红细胞吸附活性、神经氨酸酶活性和细胞融合能力;蛋白水平的不同来源HN蛋白相关生物学活性与病毒水平研究结果一致。结果表明,不同来源HN蛋白对NDV生物学特性影响程度不同;NDV的复制能力、毒力和致病性与其红细胞吸附活性、神经氨酸酶活性和膜融合能力密切相关;HN蛋白的活性决定了 NDV的红细胞吸附活性、神经氨酸酶活性和膜融合能力,进而影响了 NDV的复制能力、毒力和致病性。通过对NCBI数据库中NDV HN蛋白序列进行比对,发现共存在至少12种不同长度的HN蛋白,分别为 570 氨基酸(amino acids,aa)、571 aa、572 aa、577 aa、578 aa、580 aa、581 aa、582 aa、585 aa、586 aa、615aa和616aa。HN蛋白长度的差异是通过改变C端球状区长度来实现的,球状区是HN的主要功能区,长度变化对HN蛋白活性甚至病毒的生物学特性产生怎样的影响有待系统研究。本研究以基因Ⅶ型代表毒株SG10为模式病毒,利用定点突变和反向遗传操作技术构建了一系列含截短和延长HN蛋白的重组NDV,并对其生物学特性和不同长度HN蛋白的活性进行了分析。研究结果显示,与亲本病毒rNDV-SG10-HN571 一致,所有含不同长度HN蛋白重组NDV均属于典型的强毒株;含截短HN蛋白重组NDV(rNDV-SG10-HN567)的增殖能力与亲本病毒相似,含延长HN蛋白重组NDV(rNDV-SG10-HN582和rNDV-SG10-HN616)的增殖能力显着低于亲本病毒;含截短HN蛋白重组NDV(rNDV-SG10-HN567)的受体结合能力、神经氨酸酶活性和细胞融合能力与亲本病毒差异不显着,含延长HN蛋白重组NDV(rNDV-SG10-HN577、rNDV-SG10-HN582 和 rNDV-SG10-HN616)的受体结合能力高于亲本病毒,其神经氨酸酶活性和细胞融合能力均显着低于亲本病毒;蛋白水平的不同长度HN蛋白相关生物学活性与病毒水平研究结果基本一致。结果表明,HN蛋白的长度变化对NDV毒力无明显影响;HN蛋白的延长降低了 NDV的复制能力;HN蛋白的延长提高了 NDV的受体结合能力,降低了 NDV的NA活性和膜融合能力。本研究系统揭示了 HN蛋白对NDV生物学特性的影响,证明HN蛋白影响NDV的毒力、复制能力、组织嗜性和相关生物学活性,其影响程度与HN蛋白的来源有关。HN蛋白的长度影响NDV的生物学特性:HN蛋白的延长显着地影响了 NDV的生物学活性,这种影响降低了 NDV的复制能力而与毒力无关。本研究为进一步阐明NDV致病的分子机制奠定了基础。
田志革[8]2015年在《野生水禽副粘病毒的分离鉴定及Ⅴ蛋白对抗宿主细胞先天免疫机制的研究》文中进行了进一步梳理新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种烈性传染病,发病急,感染率和死亡率高(有时高达100%),它主要危害禽类。该病分布广泛,对养殖业危害极大。针对新城疫病毒的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽,而作为新城疫病毒的天然宿主,野生鸟类在病毒传播过程中所起到的作用并未引起足够的重视。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主,可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙,携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾病的爆发和流行。因此,对野生鸟类进行常见病原的分子流行病学监测,具有重要的指示意义。为研究野生鸟类感染或携带新城疫病毒的情况,本研究对2011年10月至2013年5月期间收集自吉林省向海自然保护区的野生鸟类粪便拭子共计1002份,进行新城疫病毒的分子流行病学调查。一方面调查新城疫病毒的携带情况,进行病毒的分离与鉴定,并选取有代表性的毒株进行基因克隆和序列的分子遗传特征分析；另一方面,首次分离到6型禽副粘病毒(avian paramyxo virus virus type 6,APMV6),并对其进行全基因组测序。1、野生鸟类粪便拭子的PCR检测将粪便拭子按常规方法无菌处理后,接种SPF鸡胚,72h后收集尿囊液,提取尿囊液中的病毒RNA,用特异性的检测新城疫病毒和禽副粘病毒的PCR方法进行初步检测。实验结果表明野鸟存在NDV以及APMV6的感染。所有野生鸟类样品的NDV PCR阳性检出率为4.19%,APMV6 PCR阳性检出率为0.2%。野生鸟类新城疫病毒携带情况不具明显的季节性,不同年份野鸟的NDV检出率有一定差别,其中2011年NDV阳性检出率最高,为14.02%。2、野鸟源NDV的分离鉴定及F基因遗传演化分析将用NDV PCR检测引物初筛为阳性的尿囊液经适当处理后接种鸡胚成纤维细胞(CEF)培养增殖,进行蚀斑纯化。经特异性PCR、血凝试验及血凝抑制试验鉴定,确定共分离到42株野鸟源NDV。对42株病毒的毒力基因F基因进行部分克隆和序列测定,与GenBank上已发表的NDV参考株进行序列比对和分析。测序结果显示42株分离株均为弱毒株,其中3株属于class Ⅰ genotype2,另外39株属于class Ⅱ genotype Ⅰ。序列分析结果显示：3个class Ⅰ分离株F基因核苷酸序列相似性为97.5%-98.9%；核苷酸遗传进化分析表明,这3株野鸟源NDV分离株与南方家禽分离株亲缘关系较近。39株classⅡ分离株F基因核苷酸序列相似性为96.4%-100%,核苷酸遗传进化分析表明,毒株NEFU1301,NEFU1302, NEFU1102, NEFU1104, NEFU1113表现出高度的序列相似性,与2004-2006年间南方家禽分离株和远东及日本野鸟分离株亲缘关系较近。另外34株classⅡ分离株亲缘关系较近,处于另一个相对独立的集簇,但这39株分离株均与疫苗株亲缘关系较远。结果说明我国野生鸟类中存在NDV的感染,分离株均为弱毒株,提示强毒株在野鸟中并未广泛流行；弱毒株在远东地区、日本地区及中国东海岸线可能已经发生广泛交流；经免疫的家禽可能无法抵御来自野鸟所携带病毒的感染。本研究选择NDV代表株NEFU1106和NEFU1136进行全基因组序列,获得的GenBank登陆号分别为KF361507和KC894391。本研究既丰富了东北地区NDV的流行病学资料,又警示我们要对野生鸟类在NDV传播中所起的作用引起重视,为深入研究NDV的传播、遗传、进化等奠定基础。3、野鸟源APMV6的分离及其全基因组测序通过副粘病毒通用引物PCR检测及电镜观察,确定共分离到2株野鸟源APMV6,分别命名为JL190及JL127。设计特异性引物分16段扩增这两株病毒的基因组,通过软件拼接获得它们的全长基因组序列。其基因组全长为16236nt,获得的GenBank登录号分别为JX522537和KF267717；基因组结构为3'leader-NP-P-M-F-SH-HN-L-Trailer5',根据JL217的F基因及HN基因氨基酸序列构建系统发育树,结果表明,JL127株病毒与TW和FE株亲缘关系较近,与HK株亲缘关系较远。4、副粘病毒V蛋白对抗宿主细胞先天免疫机制的研究扩增新城疫病毒强毒株、弱毒株以及APMV6的V基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达质粒,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-luc报告质粒共转染HEK-293T细胞,接种仙台病毒刺激细胞后,测定细胞内萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性。结果表明,新城疫病毒强弱毒株的V蛋白均能抑制宿主细胞干扰素p的产生,但强毒株V蛋白抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子转录的作用要强于弱毒株V蛋白,构建的强弱毒株V蛋白嵌合体表明,强毒株V蛋白C末端在此过程中发挥重要作用；APMV6的V蛋白能通过降低NF-κB的活性显着抑制宿主细胞产生IFN-β。
孙英杰[9]2015年在《新城疫病毒诱导宿主细胞应激颗粒形成机制的研究》文中进行了进一步梳理本文研究了新城疫病毒(NDV)诱导应激颗粒(SG)形成以及形成的机制,对病毒感染产生的SG中存在的特异性成分进行判定,以及阐明SG在病毒复制中发挥的作用,最后对SG如何调控病毒复制的机制进行深入探索。本文的主要结论是：1.NDV感染能够诱导HeLa细胞产生稳定的SG,且病毒的NP蛋白被特异性招募至SG中。2.NDV感染诱导总蛋白翻译水平的下降,病毒主要通过PKR-eIF2α通路诱导SG形成。3.病毒感染诱导的SG需要持续的蛋白合成,并且包含一些小核糖体亚基以及翻译起始复合物前体成分。4.病毒感染诱导形成的大SG依赖于微管蛋白的完整性。5.SG形成关键基因TIA-1和TIAR的敲低能够显着抑制NDV蛋白的表达以及病毒释放,并且能够同时导致细胞总蛋白翻译水平上升。6.病毒感染诱导的SG中主要包含宿主的总mRNA,大部分病毒的特异性mRNA逃逸SG包裹。
钱晶[10]2017年在《新城疫病毒样颗粒的构建及免疫原性和免疫机制研究》文中认为病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是由病毒结构蛋白装配而成的空心蛋白颗粒,与真实病毒形态结构相似,无自主复制能力,可作为安全有效的新型疫苗预防病毒性传染病,近年来VLP技术已成为疫苗研究领域的热点。新城疫病毒样颗粒(Newcastle disease virus-like particles,NDV VLPs)是由新城疫病毒基质蛋白(M)为病毒骨架,可装配病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白(F)或核蛋白(NP)。已有研究表明,NDV VLPs能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答,以及有效的免疫保护效力,这与其他VLP疫苗诱导的适应性免疫应答能力相似。然而,关于NDV VLPs如何激活天然免疫应答的研究尚无报道。正常情况下,机体免疫系统识别外源抗原涉及特定的免疫细胞,如吞噬细胞或淋巴细胞。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前抗原递呈能力最强的专职免疫细胞,在连接天然免疫与适应性免疫之间具有独特功能。成熟DCs(m DCs)迁移至次级淋巴组织能够刺激初始型T细胞(Na?ve T cell)活化和增殖,被认为是特异性免疫应答的始动者。因此,阐明NDV VLPs诱导DC成熟与迁移的免疫机制对更好地理解VLP激活的天然免疫应答具有重要科学意义。目前,有关DC成熟与迁移的研究主要集中在小鼠等哺乳动物模型上,虽然NDV感染的宿主为禽类,但是已经明确禽类的免疫反应大部分与其他生物物种相同,只是在细节上存在差异。为此,本研究以NDV VLPs与小鼠DCs为研究靶点,利用昆虫杆状病毒表达系统组装了NDV VLPs,通过小鼠模型分析NDV VLPs激发的体液和细胞免疫应答水平以评价其免疫原性;利用分子生物学方法、细胞生物学分析手段以及系统免疫学技术体系,探讨NDV VLPs诱导体外DC成熟与迁移的分子机制及其信号通路,揭示体内DCs捕获NDV VLPs后的迁移路径及递呈效应。主要研究内容如下:一、本实验首先利用昆虫杆状病毒表达系统,构建共表达NDV结构蛋白的重组杆状病毒(r BV-M和r BV-M+HN),组装并纯化了NDV VLPs(M和M-HN)。免疫电镜检测结果可见明显胶体金颗粒,表明NDV VLPs能与NDV HN蛋白单克隆抗体发生特异性反应,同时可见病毒颗粒具有典型的囊膜结构,与野生型NDV大小相似(100-200nm)。Western blot分析结果可见约40k Da和68k Da大小条带,表明该颗粒还能与特异性NDV抗体发生反应。为评价NDV VLPs在小鼠模型中的免疫原性,血凝抑制试验和间接ELISA法检测结果表明VLP组可诱导产生更高的血凝抑制抗体效价和特异性Ig G抗体水平,与异源病毒(La Sota株)的反应原性一致,同时也发现VLP组Ig G抗体亚型以Ig G1为主。流式细胞术检测结果表明,VLPs可诱导产生较多的Th细胞(CD3+CD4+细胞),并且相比于WIV组能激活更多的Th1细胞(CD4+IFN-γ+细胞)和Tc细胞(CD8+IFN-γ+细胞);另外还发现VLPs招募了更多的DC迁移至脾脏。以上结果表明,NDV VLPs能产生特异性免疫应答,这可能与招募的DC活化程度有关。二、为探索NDV VLPs诱导体外DC成熟与迁移的免疫机制,采用体外重组细胞因子GM-CSF和IL-4联合诱导小鼠骨髓细胞分化为具有典型树枝状突起DCs,且表面标志分子CD11c和MHC II符合后续实验的要求。以原代细胞开展系统性DC免疫学研究,FITC-葡聚糖吞噬实验结果表明DCs可有效摄取VLPs;混合淋巴细胞反应数据说明,VLP组DCs可促进初始型T细胞分化,具体表现为Th1型(IL-2)和Th2型(IL-10)细胞因子分泌水平增加;流式细胞术检测表面成熟标志分子和ELISA法检测细胞因子结果可见,VLPs能诱导DC上调MHC II、CD80、CD86、CD40分子的表达以及增加TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL12p70的分泌;另外,还发现单独M VLPs或是HN蛋白也能促进炎性细胞因子的分泌,这表明完整的病毒粒子结构和HN蛋白也可诱导DC成熟;然而不同组装类型的VLPs其分泌炎性细胞因子的水平不一,推测这可能与NDV F或HN特性有关。为进一步探讨NDV VLPs诱导DC成熟的免疫机制及其可能的信号通路,流式细胞术和ELISA法检测结果表明,TLR4和NF-κB抑制剂处理能降低NDV VLPs诱导的DC活化,表现为DC表面成熟标志分子表达不同程度降低并且分泌细胞因子水平显着减少;Western blot结果显示NDV VLPs促进了DC胞内NF-κB(p65)、IκB以及IKK分子的磷酸化表达,说明VLPs诱导DC成熟可通过TLR4-IKK-IκB-NF-κB信号通路实现。与此同时,VLPs可上调DC表面CCR7分子的表达,而下调CCR5分子的表达;进一步采用Transwell小室法和抗体阻断法验证了VLPs诱导DC迁移依赖于CCR7-CCL19/CCL21轴的作用,并且CCL21的作用更为显着。叁、为了揭示NDV VLPs诱导体内DC成熟与迁移的细胞与分子机制,本实验先采用CFSE标记m DCs经尾静脉过继回输给小鼠,流式细胞术检测引流淋巴结和脾脏并结合ELISA法测定趋化因子结果表明,m DCs在体内的迁移仍是依赖CCL19和CCL21的浓度差作用,负载VLPs的DCs可促进淋巴组织中CCL19和CCL21的分泌,并且CCL21对m DC迁移更为重要;最终通过流式细胞术检测细胞表型以及胞内细胞因子结果显示m DC组各亚型T细胞显着高于im DC组和PBS组,表明该m DCs能够在体内激活脾脏T细胞并向各亚群分化。为了模拟真实VLPs在体内被处理加工的过程,本实验另外也注射VLPs至小鼠足底,结果表明VLPs早期招募DCs在引流淋巴结聚集,而随着时间推移,脾脏DCs的百分比上升,推测DC是由外周组织经引流淋巴结向脾脏迁移,而72h后脾脏T、B淋巴细胞活化和增殖导致DC百分占比率降低。另外,胞内细胞因子染色结果表明仅Th型(CD4+IFN-γ+和CD4+IL-4+)细胞产生了分化,说明VLPs被体内DCs摄取进而激活初始型T细胞。以上结果显示,VLPs能诱导体内DC经由引流淋巴结迁移至脾脏,进而促使初始型T细胞活化和分化。综上所述,本研究组装了NDV VLPs,该颗粒具有良好的免疫原性;揭示NDV VLPs诱导体内、外DC成熟与迁移的免疫机制,为深入阐明VLPs激活天然免疫应答机制提供科学依据。
参考文献：
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[9]. 新城疫病毒诱导宿主细胞应激颗粒形成机制的研究[D]. 孙英杰. 中国农业科学院. 2015
[10]. 新城疫病毒样颗粒的构建及免疫原性和免疫机制研究[D]. 钱晶. 吉林大学. 2017