利用环境DNA探究滇中高原湖泊的鱼类多样性

论文摘要

滇中高原湖泊是我国五大湖泊类型之一,其生境特殊,高海拔、低纬度,湖泊径流少,且湖泊相互孤立,鱼类区系简单、物种分化强烈,是国内外研究的热点之一。目前,高原湖泊鱼类生物多样性监测,主要采用人工捕捞和渔民访查等方法,费时费力,尤其在濒危鱼类种群数量较低时,数据可靠性不高。环境DNA结合高通量条形码技术可以对物种进行快速鉴定。前人研究表明,环境DNA结合高通量条形码技术可以用于水环境生物多样性监测,但该方法是否适用于高原湖泊这一特殊生境,目前还未见报道。环境DNA指的是生物体的DNA通过生物体分泌的毛屑、脱落细胞、排泄物、粘液等释放到环境中的DNA片段。本研究以滇中高原的抚仙湖、星云湖、阳宗海、滇池为研究区域,利用环境DNA结合高通量条形码技术研究鱼类生物多样性,探索该技术在高原湖泊特殊生境中的水生生物多样性监测的适用性。本研究的目标包括:1)将环境DNA结合高通量条形码技术用于滇中高原湖泊鱼类生物多样性监测,并对流程进行优化;2)利用环境DNA技术的数据,推断四个高原湖泊的鱼类生物多样性,结合采样路线来绘制物种分布图,并与历史文献数据进行比较。本研究于2018年7月在抚仙湖、阳宗海、滇池和星云湖四个湖泊进行样本采集,共采集28个环境DNA样品。随后,采用Qiagen的血液组织试剂盒提取环境DNA、定量并稀释成100倍浓度作为PCR的底物浓度。与以往方法不同的是,为减少由PCR随机性及测序等引起的错误,本研究采用双胞胎标记的通用引物MiFish,每个环境DNA样品采用3对不同的双胞胎标签引物,分别进行独立的3次PCR扩增,并将每一板的PCR扩增产物混合后分别构建扩增子文库。在Illumina的Miseq测序平台进行高通量测序。运用(AdapterRemoval 2.2.0、sickle 1.33、SPAdes 3.10.1、PandaSeq2.11)软件对原始序列进行错误矫正及质控,运行软件DAMe对带标签的序列进行分析,并以sumaclust进行聚类。本研究的主要结果如下:1、环境DNA结合高通量条形码技术可以对滇中高原湖泊主要鱼类进行快速鉴定,且比较省时。本研究通过对滇中高原湖泊的鱼类生物多样性的调查,优化出了适用于监测滇中高原鱼类多样性的环境DNA技术流程,可供同类研究以作参考;2、环境DNA技术对4个滇中高原湖泊的鱼类多样性进行调查,得到39个OTU,除去非鱼类OTU和阳性对照,得到4个湖泊的30个鱼类OTU,这30个OTU能以大于97%的相似度匹配到数据库中鱼类的属一级分类信息,共隶属于6个目25个属,其中12个OTU以超过97%相似度匹配到数据库中鱼类的种一级分类信息,即有12个OTU被鉴定到具体的种,包括土著鱼类鲫鱼(Carassius auratus)和珍稀鱼类滇池金线鲃(Sinocyclocheilus grahami)。利用这些数据,我们绘制了4个湖泊的鱼类物种组成分布图。以上结果表明,环境DNA技术结合高通量条形码可以应用于监测滇中高原湖泊的鱼类多样性,但需要在多个方面进行优化以提高其适用性。本研究在野外采样、DNA提取、PCR扩增和生物信息学分析等方面对该技术进行了优化,本研究结果可为其他滇中高原湖泊水生生物的研究提供借鉴,同时也为其他自然保护区和环境监测局的调查研究提供技术支持。

论文目录

摘要

Abstract

1 前言

1.1 高原湖泊的鱼类生物多样性研究

1.1.1 生物多样性概述

1.1.2 云南高原湖泊鱼类生物多样性面临的威胁

1.1.3 鱼类生物多样性研究的方法

1.2 环境DNA技术

1.2.1 环境DNA技术概述

1.2.2 环境DNA技术在水生环境中的应用

1.3 DNA高通量条形码技术

1.3.1 DNA条形码

1.3.2 DNA高通量条形码概述

1.3.3 DNA高通量条形码技术的应用

1.4 科学问题

1.5 研究目的和意义

1.5.1 研究目的

1.5.2 研究意义

1.6 技术路线

2 实验材料与研究方法

2.1 实验湖泊概况

2.2 湖泊环境DNA样品采样

2.3 实验研究方法

2.3.1 环境DNA样品的采集方法

2.3.2 环境DNA提取

2.3.3 环境DNA的定量

2.3.4 环境DNA浓度稀释

2.3.5 环境DNA的PCR过程

2.3.6 环境DNA的PCR产物混样

2.3.7 环境DNA技术的PCR产物纯化

2.3.8 环境DNA扩增子建库

2.4 数据分析

2.4.1 生物信息学分析

2.4.2 4个湖泊的鱼类多样性分析

3 研究结果

3.1 环境DNA技术的优化

3.2 4个湖泊环境DNA样品的高通量测序结果

3.2.1 环境DNA样品的生物信息学分析结果

3.2.2 测序样本的注释信息统计

3.3 环境DNA技术对4个湖泊鱼类的监测

3.4 环境DNA技术监测与传统监测的比较

3.5 环境DNA结合高通量条形码评估4个湖泊的鱼类多样性

3.5.1 土著鱼类的监测

3.5.2 水质对鱼类多样性的影响

3.5.3 利用环境DNA高通量条形码技术评估4个湖泊鱼类丰度与分布

4 讨论

4.1 环境DNA技术的优化

4.1.1 环境DNA技术样品采集优化

4.1.2 环境DNA技术PCR操作的优化

4.1.3 环境DNA技术引物优化

4.2 环境DNA技术的高通量测序

4.3 环境DNA技术与传统监测技术的比较

4.4 4个湖泊土著鱼类

4.5 环境DNA技术对滇中高原湖泊鱼类多样性监测的适用性

5 结论

6 展望

附录Ⅰ 环境DNA技术引物标签序列

附录Ⅱ 环境DNA技术监测到的鱼类分类学信息统计表

附录Ⅲ 环境DNA监测到的鱼类DNA序列

附录Ⅳ 生物信息学分析脚本

参考文献

硕士学位期间完成的科研成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 罗加山

导师: 耿宇鹏

关键词: 高原湖泊,环境,高通量条形码,优化,鱼类多样性

来源: 云南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 云南大学

分类号: Q958.8

总页数: 101

文件大小: 6307K

下载量: 241

利用环境DNA探究滇中高原湖泊的鱼类多样性

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢