油污湿地石油降解菌的筛选鉴定和特性研究

论文摘要

在石油开采区附近,石油污染一直是一个不可避免的问题。针对这一问题,目前主要有三种主要修复方法:物理法、化学法和生物法。微生物修复方法是最主要的生物修复方法之一。微生物法具有成本低,效率高,无二次污染,局限性小,使用面积广泛等优点。筛选出高效的油污湿地土壤石油降解菌不仅具有重要的学术价值,同时对于油污湿地土壤原位修复具有重要的应用价值和现实意义。本研究以大庆湿地油井附近石油污染土壤为研究对象,以原油为唯一碳源,对菌株进行了生理生化鉴定、16S rDNA鉴定,以及生长和降解特性,并模拟油污土壤修复过程,对石油降解基因进行初步研究,期望从中筛选出较为高效的石油降解菌。（1）通过初步筛选实验,找到110株石油降解菌。通过模拟油污土壤实验（复筛）,表明单独加菌液对于油污土壤修复是具有可行性的。菌株对于2 g/kg油污土壤修复能力排在前三位的是A油3J1-1（A3J1-1）、C3植J1（C3J1-2）和C2中J2,经过7 d的对石油的去除率可达63.07%、39.88%和32.22%,排在第十位的去除油污能力可达24.6%。同时发现菌株可以通过与植物（黄豆）联合作用提高石油降解菌的降解能力。（2）通过细菌的形态观察、生理生化实验和16S rDNA测序,建立进化树。发现菌株C3J1-2为微小杆菌属Exiguobacterium、菌株E1J4-1和菌株A3J1-1均为不动杆菌属Acinetobacter,均为已验证的对于石油烃具有较好降解效果的菌株。（3）通过血平板法,发现三株石油降解菌都具有产表面活性剂能力。菌株C3J1-2和菌株A3J1-1的产表面活性剂能力较强,菌株E1J4-1的产表面活性剂的能力较弱。表面活性剂可以增强微生物细胞表面的疏水性,进而提高石油烃降解菌的降解能力。（4）通过单因子实验法,着重研究了不同温度、不同盐度、不同pH、不同摇床转速、不同碳源条件下三株细菌生长曲线的变化情况。了解了菌株的生长特性,为后续野外修复提供部分条件支持。（5）通过单因子实验法,研究了培养时间、细菌接种量、不同菌液组合（混合菌群）以及石油浓度四个影响因素条件下三株细菌的降解特性,加深了对三株细菌的降解能力和特性了解。三株细菌随着培养时间的增加,降解能力均呈不断提高趋势,但是降解速度随着时间的增加,逐渐放缓,培养20 d情况下,降解率最高可达62.91%;三株细菌接种量都直接影响着降解效率,其中菌株A3J1-1和菌株C3J1-2最佳接种量是5%,菌株E1J4-1的最佳接种量为7%;菌株C3J1-2+菌株A3J1-1的组合效果最好,降解率最高为71.99%;菌株E1J4-1和菌株A3J1-1随着石油浓度的增加出现了降解率先增加后降低的趋势,在浓度为5 000 mg/L的时候,降解能力最强,分别为80.92%和52.00%。（6）最后,利用特异性引物,找出了三株石油降解菌的降解基因。菌株A3J1-1具有芳烃双加氧酶（Ahd-569F21、Ahd-977R21）和萘双加氧酶（Nd-546F21、Nd-954R21）基因;菌株C3J1-2具有萘双加氧酶（Nd-546F21、Nd-954R21）基因;菌株E1J4-1具有邻苯二酚双加氧酶（C23d-189F21、C23d-679R21）和萘双加氧酶（Nd-546F21、Nd-954R21）基因。本研究丰富了石油烃降解菌的种质资源,为后续油污湿地的微生物修复提供了菌种资源和信息,也为后续野外试验提供部分数据支撑。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 研究背景

1.2 研究意义

1.3 石油污染修复国内外研究现状

1.4 研究内容

1.5 技术路线

第2章油污湿地石油降解菌的筛选和鉴定研究

2.1 实验材料

2.1.1 土壤样品采集和原油

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验生物试剂

2.1.4 实验培养基

2.2 实验方法

2.2.1 土壤理化性质测定

2.2.2 石油降解菌的初筛

2.2.3 石油降解菌的保存

2.2.4 石油降解菌的复筛

2.2.5 石油降解菌分子生物学鉴定

2.3 结果与分析

2.3.1 土壤基本理化性质

2.3.2 复筛结果分析

2.3.3 三株细菌16S rDNA电泳图

2.3.4 三株细菌系统发育分析

2.4 本章小结

第3章油污湿地石油降解菌的生长特性研究

3.1 实验材料

3.1.1 实验仪器

3.1.2 实验药品

3.1.3 实验菌株

3.1.4 主要培养基

3.2 实验方法

3.2.1 细菌的形态观察

3.2.2 扫描电镜实验

3.2.3 生理生化实验

3.2.4 表面活性剂检测

3.2.5 生长曲线测量方法

3.2.6 不同环境条件对细菌生长的影响

3.3 结果与分析

3.3.1 三株石油降解菌形态观察结果

3.3.2 扫描电镜观察结果

3.3.3 生理生化实验结果

3.3.4 表面活性剂检测结果

3.3.5 细菌生长曲线

3.3.6 不同环境条件对细菌生长的影响

3.4 本章小结

第4章油污湿地石油降解菌的降解特性和石油烃代谢基因研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验仪器

4.1.2 实验药品

4.1.3 实验菌株

4.1.4 主要培养基

4.2 实验方法

4.2.1 石油含量测量方法

4.2.2 不同培养时间条件

4.2.3 不同接种量条件

4.2.4 不同菌液组合条件

4.2.5 不同石油浓度条件

4.2.6 石油烃代谢基因初步检测

4.3 结果与分析

4.3.1 标准曲线的绘制

4.3.2 不同时间条件下的降解性能

4.3.3 不同接种量条件下的降解性能

4.3.4 不同菌液组合条件下的降解性能

4.3.5 不同石油浓度条件下的降解性能

4.3.6 代谢基因初步检测结果

4.4 本章小结

结论

基本结论

展望

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 程进

导师: 王继富

关键词: 油污湿地,石油降解菌,特性

来源: 哈尔滨师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,石油天然气工业,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 哈尔滨师范大学

基金: 国家重点研发计划子课题任务—退化盐碱湿地重要栖息地修复与功能提升技术研发(2016YFC0500404-6)

分类号: X172;X741

总页数: 65

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