贾建军[1]2003年在《人胎盘绒毛血管生成及相关调控因子表达的研究》文中进行了进一步梳理目的：利用免疫组织化学技术和体视学方法，探讨VEGF、bFGF和TGF-β1叁种细胞因子在胎盘滋养层上的表达及早、中、晚叁期绒毛血管的密度变化，为今后研究绒毛血管相关性的疾病提供理论依据。 方法：取孕6-9周行人工流产术的胎盘10例(早孕组)、孕18-22周行水囊引产术的胎盘10例(中孕组)、孕37-38周行剖宫产术的胎盘10例(晚孕组)，行常规HE染色和免疫组织化学染色。前者对绒毛行形态学研究，后者则利用图像分析技术对绒毛间质内血管行体视学研究，同时定量分析VEGF、TGF-β1和bFGF叁种细胞因子在绒毛滋养层上的表达。 结果：1．光镜下绒毛形态学研究：在早孕组，绒毛较稀少，直径较大，细胞滋养细胞和合体滋养细胞界限清楚，绒毛间质中央可见小血管，内皮细胞较厚。在中孕组，绒毛数目较多，体积较小，细胞滋养细胞不如早期明显，合体滋养细胞层变薄，绒毛血管明显，内皮细胞呈扁平形；在晚孕组，绒毛滋养层厚薄不均匀，绒毛血管数目显着增多且多位于绒毛周边，血管扩张不明显。 2．绒毛间质内血管体视学研究：在妊娠过程中，即早、中、晚孕期间，血管管径参数无统计学意义(26.67±7.74，25.08±4.67，23.36±5.30。P＞0.05)；血管长度密度则逐渐增大，有统计学意义(1.46±0.64， 5．58t．31，19．56土 1．40，P＜0．01） 3．VEGF、bFGF及TGF pl在人胎盘绒毛滋养层表达的变化：在妊娠过 程中，叁种细胞因子在滋养层的表达均逐渐减弱且均有统计学意义， VEGF为（2．19土3．of，18．65上2．43，4．95土0．86，P＜0．01）；bFGF为 （1．80上1．23，9．92上1．65，4．18土0．52，P＜0．01）；TGF．61为 （l．54上2．56， 7．58ti．77，3．24t0．87，P＜0．01）。结论：1．组织问缺氧环境的变化和胎盘细胞凋亡的存在，可能是调控胎盘滋养层 组织形态变化的因素之一。 2．妊娠过程中，绒毛fAJ质内血管数目的增加对胎儿生长与母胎物质交换至 关重要，而血管管径则无显着性改变。 3．绒毛间质内血管的生成是一个复杂过程，妊娠过程中VEGF、bFGF和 TGF pl的显着减弱，说明其他细胞因子可能参与调控血管生成作用。
王跃嗣[2]2005年在《人nthESC向HSC诱导分化和胚胎造血标志物表达研究》文中研究指明造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是近年来研究较多的一类组织干细胞,目前发现卵黄囊、胎肝、主动脉-性腺-中肾区(AGM)、胎儿血液以及胎盘中均存在具有高度扩增能力的HSC。本论文主要进行了具有课题组专利的人自体基因胚胎干细胞(nthESC)向造血干细胞的诱导分化、人胚胎发育过程中卵黄囊、胎肝和胎盘中的造血发育以及胎盘贴壁细胞的分离培养、向神经细胞诱导分化的研究,为nthESC 和HSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。1. 探讨了人胚骨髓间充质干细胞(MSC)的体外分离、扩增、冻存、复苏、转GFP基因和向成骨和神经细胞的诱导分化条件,结果发现MSC有60%可转染GFP基因,表达CD29、CD13、CD59,而CD34、CD45和CD38表达阴性。Vimentin染色阳性,mallory染色显示胶原存在,分离的细胞可在神经诱导体系和成骨诱导体系下进一步向神经细胞和成骨细胞分化。表明MSC在体外能迅速扩增,具有向成骨和神经细胞分化潜能,可以作为稳定饲养层来源。2. 利用人MSC 与人nthESC 共培养,研究人MSC 对胚胎干细胞诱导造血的作用并建立一种有效诱导nthESC 为HSC 的方法。经过20 d 培养,获得大量的CD133+和CD34+绿色荧光标记的HSC。来源于nthESC 的KDR+细胞首先出现在第5 天,CD133 随后出现,CD34+细胞出现在第7 天,随时间延长叁者表达增强,第11 天左右表达最强,随后减弱,20 d 仍有表达。培养中发现11 d 可形成小造血集落,14 d 形成大集落。在BMP4、FGF-1和VEGF 等因子作用下,可促进造血细胞形成。结果显示由nthES 与MSC 共培养可产生CD34+细胞,nthESC 的造血分化程序为先形成KDR+细胞,其次是CD133+,再形成CD34+细胞。表明nthESC 可在人胚骨髓MSC 饲养层上有效诱导成HSC。3. 采用分阶段悬浮培养法,首先诱导nthESC 形成拟胚体(EB),在此过程中添加BMP4 和FGF-1。第二阶段,打散EB,再添加VEGF 和其他细胞因子,对HSC 进行扩增。结果发现,采用低黏附板可有效促进EB 形成,BMP4 和FGF-1 可使EB 形成数量明显增加,可使KDR+和CD133+荧光细胞数量明显增多。添加VEGF 等细胞因子,可有效促进CD34+细胞数量增加。结果表明,联合使用BMP4、FGF-1、VEGF 和SCF 等细胞因子,可使悬浮培养形成EB 数量增加,产生更多的造血前体细胞,继而产生大量HSC。
唐薇[3]2009年在《米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛的影响》文中研究说明目的:1.对比观察米非司酮对孕7-9周人胎盘绒毛中前列腺素合成及表达、氧化/抗氧化状态和间质微血管形态及数量的影响,从前列腺素合成调控、氧化应激和胎盘绒毛间质微血管变化叁方面探讨米非司酮终止早孕的可能机制。2.进一步完善米非司酮在药物流产中作用机理的认识,为临床上合理扩大米非司酮终孕应用范围提供理论基础和实验参考依据,同时为其在其它领域的应用提供理论依据。方法:1.应用免疫组织化学(SP)法检测COX-2、COX-1、NF-κB在米非司酮药流组与人流对照组(孕7-9周各12例)胎盘绒毛滋养细胞中表达量的差异;应用酶联免疫吸附定量(ELISA)法检测PGF_(2α)在上述两组胎盘绒毛中含量的差异,了解米非司酮对人早孕7-9周胎盘绒毛前列腺素合成及表达的影响。2.应用化学比色法检测MDA、T-AOC、CuZn-SOD和MDA/T-AOC比值在上述两组胎盘绒毛中含量的差异,了解米非司酮对人早孕7-9周胎盘绒毛氧化/抗氧化平衡状态的影响。3.应用免疫组化法定位HO-1在上述两组胎盘绒毛中的表达部位及检测其在滋养细胞中表达量的差异;蛋白质印迹(Western blot)法检测HO-1在上述两组胎盘绒毛中蛋白表达量的差异;逆转录酶—聚合酶链式反应(RT—PCR)法检测HO-1mRNA在上述两组胎盘绒毛中RNA转录量的差异,通过HO-1将前列腺素合成调控、氧化应激和胎盘绒毛间质微血管变化叁方面相互作用联系起来探讨米非司酮终止早孕的可能机制。4.应用免疫组化法检测VEGF在上述两组胎盘绒毛滋养细胞中表达量的差异;间接免疫荧光组织化学方法及激光共聚焦成像技术,观察分析上述两组胎盘绒毛间质中CD34荧光标记的微血管形态及数量的差异,准确直观地了解米非司酮对孕7—9周人胎盘绒毛间质微血管形成的影响。结果:1.COX-2主要强表达于绒毛表面的合体滋养细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆弱表达,米非司酮药流组阳性表达较人流对照组强(P＜0.01)。NF-κB主要强表达于绒毛表面的合体滋养细胞胞浆中,细胞滋养细胞胞浆表达稍弱,米非司酮药流组阳性表达较人流对照组强(P＜0.01)。COX-1强表达于米非司酮药流组与人流对照组胎盘绒毛合体及细胞滋养细胞胞浆中,两组表达无明显差别(P=0.064,P＞0.05)。米非司酮药流组胎盘绒毛中PGF_(2α)的表达较人流对照组明显增多(P＜0.01)。2.米非司酮药流组胎盘绒毛中MDA含量较人流对照组明显增多(P＜0.01)。米非司酮药流组胎盘绒毛中T-AOC含量较人流对照组明显减少(P＜0.01)。米非司酮药流组胎盘绒毛中CuZn-SOD含量较人流对照组明显减少(P＜0.01)。米非司酮药流组胎盘绒毛中MDA/T—AOC比值较人流对照组明显增大(P＜0.01)。3.HO-1主要强表达于绒毛的滋养细胞胞核及胞浆中,部分血管内皮细胞和间质细胞胞核、胞浆也有表达。米非司酮药流组滋养细胞胞核、胞浆阳性表达较对照组强(P＜0.01)。Western blot法检测HO-1在上述两组胎盘绒毛中蛋白表达量,米非司酮药流组较对照组增多(P＜0.01)。RT-PCR法检测HO-1mRNA在上述两组胎盘绒毛中RNA转录量,米非司酮药流组较对照组增多(P＜0.01)。4.米非司酮药流组与人流对照组均可见血管内皮细胞在FITC-CD34标记下呈清晰明亮的绿色荧光,人流对照组毛细血管的形态规则,管腔清晰,管径大小正常。米非司酮药流组毛细血管的数目增多,形态不规则,管腔不同程度扭曲扩张。米非司酮药流组微血管长度密度(Lv)较人流组增高(P=0 043,P＜0.05)。米非司酮药流组微血管体积密度(Vv)较人流组增高(P=0.031,P＜0.05)。VEGF表达于上述两组胎盘绒毛滋养细胞、血管内皮细胞胞浆中,米非司酮药流组滋养细胞阳性表达较人流对照组减弱(P＜0.01)。结论:1.米非司酮激活NF-κB,使COX-2表达增多,继而使PGs(尤其PGF_(2α))合成增多,PGF_(2α)引起血管收缩,蜕膜组织变性坏死继而直接或间接影响绒毛组织的血液供应,刺激产生更多ROS,进一步加重氧化损伤,同时激活子宫平滑肌收缩及扩张宫颈,导致正常妊娠无法维持而终孕。2.人早孕7-9周胎盘绒毛中存在氧化应激现象。米非司酮可使MDA含量增加,T-AOC和CuZn-SOD含量减少,MDA/T-AOC比值增大,加重氧化/抗氧化失衡,促进ROS产生和NF-κB激活,使PGs(尤其PGF_(2α))合成及表达增多,血管收缩使血管内皮细胞和线粒体功能受损,又进一步促进ROS的产生,加重氧化/抗氧化失衡。3.米非司酮促进ROS产生,ROS通过激活HO-1基因启动区的NF-κB上调HO-1mRNA转录和蛋白合成。HO-1发挥其抗氧化应激、扩血管改善胎盘循环和胎儿生长发育、细胞保护、抗炎、抑制血小板凝集、抑制凋亡等作用来对抗米非司酮的作用。PGF_(2α)与HO-1相互竞争,究竟是使氧化/抗氧化在新的水平上保持平衡,妊娠得以维持,还是PGs最终引起血管收缩,血管内皮细胞损伤,进一步促进ROS的产生,导致氧化/抗氧化完全失衡,这种竞争的结果就决定了妊娠的结局。4.在顿服米非司酮150mg后24-48h而未加用米索前列醇的情况下,人早孕7-9周胎盘绒毛出现了PGs合成及表达增多、氧化/抗氧化失衡状态,但同时也出现HO-1mRNA转录和蛋白合成增加来对抗米非司酮上述作用,胎盘绒毛微血管出现数目增多,管腔不同程度扭曲扩张,可能反映此时胎盘绒毛处于一种代偿状态而非耗竭现象。此时需加服前列腺素抑制HO-1的代偿作用或适当延长米非司酮作用时间和剂量,以加重氧化/抗氧化失衡状态,刺激产生更多ROS,进一步加重氧化损伤,激活子宫平滑肌收缩及扩张宫颈,以达到预期的药物流产效果。
植枝福[4]2018年在《HIF-1α/VEGF在孕早期稽留流产发病中的作用及低氧下的相关调控机制研究》文中提出第一部分:低氧下HIF-1α调控VEGF与稽留流产发病的关系的研究目的:通过检测缺氧诱导因子-1α(Hypoxi-indueibl factor 1αlfa,HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial factor,VEGF)在稽留流产患者绒毛组织的表达及其在体外构建的早孕低氧环境下HTR8/Svneo细胞的相关功能试验,研究HIF-1α调控VEGF在绒毛血管形成中的作用,阐明其在稽留流产发病机制中的临床意义。方法:1、收集稽留流产患者绒毛组织及早孕人流绒毛组织各30例,利用免疫组化方法检测两组标本的HIF-1α、VEGF及CD34标记的微血管密度(Microvessel density,MVD)的表达差异,进一步研究绒毛组织中HIF-1α、VEGF的表达与MVD的相关性。2、低氧(2%O2)与常氧(20%O2)条件下体外培养HTR8/Svneo细胞实验,比较两种不同氧环境下分别培养6小时、12小时、24小时、48小时后细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力的变化。3、Western Blot实验测定低氧与常氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后HIF-1α蛋白的变化;QRT-q PCR检测低氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后HIF-1α的m RNA水平的变化;Western Blot实验测定低氧条件培养HTR8/Svneo细胞6小时、12小时、24小时、48小时后VEGF蛋白的表达变化。4、利用si RNA技术沉默HIF-1α后在低氧环境下转染HTR8/Svneo细胞,检测VEGF表达的变化及细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的微血管密度明显低于早孕人流组绒毛的微血管密度(P<0.001),稽留流产组绒毛的HIF-1α、VEGF的平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P<0.001);在早孕人流组中,MVD与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.644,P<0.001),MVD与VEGF的表达也呈正相关(r=0.695,P<0.001);在稽留流产组中,MVD与HIF-1α的表达呈正相关(r=0.898,P<0.001),MVD与VEGF的表达也呈正相关(r=0.940,P<0.001)。2、低氧与常氧条件培养6小时后两组HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力均差异无统计学意义(P>0.05),低氧培养12、24、48小时后细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力均有统计学差异(P<0.05),低氧刺激一段时间后可以促进HTR-8/SVneo细胞的增殖、迁移、侵袭、成管能力。3、HIF-1α蛋白在常氧下表达极少,低氧下HIF-1α蛋白表达明显高于常氧(P<0.001),低氧下HIF-1α蛋白表达在低氧作用12小时后开始升高,可以稳定至48小时。低氧可以刺激HIF-1αm RNA转录水平,转录水平变化与其蛋白水平变化基本一致。低氧刺激作用下VEGF蛋白的变化也呈现时间依赖性,与HIF-1α蛋白表达基本同步。4、在低氧下沉默HIF-1α后转染细胞,VEGF蛋白的表达明显受到抑制,HTR8/Svneo细胞成管能力明显减弱。结论:稽留流产的发病与绒毛血管形成障碍相关;从临床水平及体外细胞实验证实HIF-1α调控VEGF是绒毛血管形成的关键因素;HIF-1α的下调导致其调控基因VEGF表达的低下,从而引起绒毛血管形成障碍而导致稽留流产的发病。第二部分:低氧下PI3K/AKT调控HIF-1α/VEGF与稽留流产的关系目的:通过对磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路在体外低氧环境下的细胞相关实验及通路关键蛋白因子在稽留流产绒毛标本的表达的检测,研究低氧环境下PI3K/AKT通路对HIF-1α/VEGF的调控作用及对细胞成管能力的影响,阐明PI3K/AKT通路调控HIF-1α/VEGF在稽留流产发病中的意义。方法:1、免疫组化测定稽留流产及早孕人流绒毛组织中PI3K、AKT的表达,并分析与MVD的相关性。2、Western Blot实验检测低氧条件培养下在PI3K抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后AKT、HIF-1α、VEGF蛋白水平的改变。3、检测低氧条件培养下在PI3K抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的PI3K平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.019),稽留流产组绒毛的AKT平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.046);在早孕人流组中,MVD与PI3K呈正相关(r=0.583,p=0.001),MVD与AKT呈正相关(r=0.533,p=0.002);在稽留流产组中,MVD与PI3K不呈正相关(r=0.264,p=0.159),MVD与AKT不呈正相关(r=0.218,p=0.247)。2、单纯低氧环境可以上调AKT、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,PI3K抑制剂作用后可以降低AKT、HIF-1α、VEGF蛋白在低氧下的表达水平,HIF-1α沉默后不降低AKT在低氧下的表达水平,低氧环境下PI3K抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时HIF-1α、VEGF的表达明显下调。3、HTR8/Svneo细胞成管能力单纯低氧环境下最强,PI3K抑制剂可以降低HTR8/Svneo细胞在低氧下的成管能力,PI3K抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时细胞成管能力最低。结论:低氧环境下PI3K/AKT通路激活HIF-1α而上调VEGF的表达,从而调控滋养细胞的成管能力。PI3K/AKT表达低下导致HIF-1α/VEGF的下调,从而引起绒毛血管形成障碍,可能导致稽留流产的发病。第叁部分:低氧环境下EGFR调控HIF-1α/VEGF与稽留流产的关系目的:通过对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在体外低氧环境下的相关细胞实验及其在稽留流产绒毛组织的表达的检测,研究低氧环境下EGFR对HIF-1α/VEGF的调控作用及对HTR8/Svneo细胞成管能力的影响,阐明EGFR调控HIF-1α/VEGF在稽留流产发病中的意义。方法:1、免疫组化测定稽留流产及早孕人流绒毛组织的EGFR的表达及与MVD的关系。2、Western Blot实验检测低氧条件培养下在EGFR抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后EGFR、HIF-1α、VEGF蛋白水平的改变。3、检测低氧条件培养下在EGFR抑制剂、si RNA技术沉默HIF-1α作用后细胞成管能力的改变。结果:1、稽留流产组绒毛的EGFR平均光密度低于早孕人流组绒毛的表达(P=0.019);在早孕人流组中,MVD与EGFR呈正相关(r=0.581,P<0.01);在稽留流产组中,MVD与EGFR呈正相关(r=0.707,P<0.01)。2、单纯低氧环境可以上调EGFR、HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平,EGFR抑制剂作用后可以降低EGFR、HIF-1α、VEGF蛋白在低氧下的表达水平,HIF-1α沉默后不降低EGFR在低氧下的表达水平,低氧环境下EGFR抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时HIF-1α、VEGF的表达明显下调。3、HTR8/Svneo细胞成管能力单纯低氧环境下最强,EGFR抑制剂可以降低HTR8/Svneo细胞在低氧下的成管能力,EGFR抑制剂与HIF-1α沉默同时作用时细胞成管能力最低。结论:低氧环境下EGFR激活HIF-1α而上调VEGF的表达,从而调控滋养细胞的成管能力。EGFR表达低下导致HIF-1α/VEGF的下调,从而引起绒毛血管形成障碍,可能导致稽留流产的发病。
赵亮[5]2004年在《激活素A和金属基质蛋白酶在人细胞滋养层细胞中的表达和调控》文中认为人胎盘绒毛膜绒毛的结构由内向外依次是绒毛基质，细胞滋养层细胞和其外层的合体细胞滋养细胞。绒毛分为两种，漂浮绒毛和锚定绒毛，漂浮绒毛的间隙充满了母体的血液，母体提供的胎儿生长发育所必需的营养和气体在这个界面进行交换，锚定绒毛是将胎盘锚定在子宫壁的结构，主要由细胞滋养层细胞柱构成，构成细胞滋养层细胞柱的几种滋养细胞体现了与侵袭相关的逐步演化进程，绒毛细胞滋养层细胞逐渐转变成侵袭性绒毛外细胞滋养层细胞，随后侵袭到子宫蜕膜，最终侵袭到母体子宫肌层的动脉。胎盘的正常发育依赖于细胞滋养层细胞增殖动态平衡，和分化为合体滋养细胞和侵袭性细胞滋养层细胞的动态平衡。在这一过程中出现异常，会导致异常妊娠，例如流产、胎儿生长受限和先兆子痫。先兆子痫是一个引人注意的妊娠相关疾病，发生先兆子痫时，有细胞滋养层细胞的过度增殖，并且从绒毛内细胞滋养层细胞向绒毛外侵袭性细胞滋养层细胞转化的过程中发生中断。 滋养层细胞逐渐转化的过程始于绒毛内细胞滋养层细胞从滋养层细胞柱移行到绒毛外，并最终转化为侵袭性细胞滋养层细胞，这个过程要求严格的时间和空间调控，这一过程受到来自于胚胎和母体子宫的多种因子的协同调控。在这一过程中，有节制的滋养细胞侵袭到母体子宫内膜是一个重要事件，其包括了细胞外基质的降解和重建，也包括子宫血管的重建。金属基质蛋白酶(MMPs)是胚胎植入过程中降解细胞外基质主要的蛋白酶。生理上，金属基质蛋白酶的生物学活性受其组织抑制因子(TIMPs)的抑制。激活素A是二聚体糖蛋白，属于转移生长因子(TGF)-β家族。激活素A是局部调节滋养层细胞分化和基质金属蛋白酶分泌的细胞因子。在妊娠早期和中期，孕妇循环中激活素A稳定于较低水平，大约从妊娠24周开始迅速升高，大约在妊娠足月时达高峰。胎儿一胎盘单位和胎膜是孕妇循环中激活素A的主要来源。然而受实验材料的限制，有关人胚胎植人早期母胎间相互作用中，关于MMPs，TIMPs，激活素A的研究很有限，选择适当的研究模型迫在眉睫。输卵管妊娠是一种异常妊娠，有报道，其滋养细胞的行为可能与正常妊娠相似，而且可以获得母胎界面保持良好的早至妊娠3周的材料。 我们目前的研究主要是想阐述(l)应用免疫组织化学和原位杂交技术，研究在孕龄为3一9周的输卵管妊娠和正常妊娠早期，母胎界面金属蛋白酶一2，一9，一26和组织抑制因子一1，一2，一3在时间和空间上的表达。(2)在妊娠早期激活素A对人细胞滋养层细胞基质金属蛋白酶一2，一9，-26表达的影响。(3)激活素A，卵泡休止素和先兆子痛的相关性。 我们的研究结果显示在输卵管妊娠母胎界面上，各种金属基质蛋白酶和组织抑制因子的表达方式与正常子宫妊娠相似。在植人的不同时期，金属基质蛋白酶和组织抑制因子相互作用，精确调控绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)的侵袭。妊娠早期，随妊娠周龄的增长，绒毛外细胞滋养层细胞MMP一2和MMP一9的表达呈相反的趋势，早期以MMP一2为主，稍后以MMP一9为主，这可能与滋养层组织侵袭的不同阶段是相适应的。并且TIMP一1和MMP一9的表达呈平行的关系，说明这种协调的表达对于细胞外基质以一种受控制的方式降解具有重要的作用。同时，应用原位杂交和免疫组化的方法，我们第一次从转录水平和蛋白水平报道了基质金属蛋白酶一26存在于人细胞滋养层细胞柱和绒毛滋养细胞上。MMP一26存在于这些细胞，提示其可能参与滋养细胞的侵袭。在第二部分研究，我们的结果显示在原代培养的人早孕滋养层细胞中，激活素A刺激金属基质蛋白酶-2，一26的生成，而抑制金属基质蛋白酶一9和组织抑制因子一1，一2，一3的生成，提示MMP一26和激活素A在胚胎植人和胎盘形成中起重要的作用。在第叁部分研究，我们的结果显示在先兆子痛孕妇循环中，激活素A的浓度明显高于同孕龄正常妊娠孕妇，胎盘组织中激活素A的含量与孕妇血清浓度密切相关。说明激活素A在先兆子痛的病理生理中起重要的作用，并且先兆子痛孕妇循环中较高浓度的激活素A至少归于胎盘组织分泌的增加。 总之，我们的研究不仅揭示金属基质蛋白酶和组织抑制因子在母胎界面上的时间和空间表达，同时也发现在患先兆子痛的妇女，其胎盘组织产生激活素A增多，这对其循环中激活素A浓度升高现象是一个很好的解释。我们的工作，对进一步澄清金属基质蛋白酶和激活素A在胚胎植人和胎盘形成中的作用提供了依据。
张林东[6]2010年在《PLGF、Bcl-2及FasL在胎儿生长受限中的研究》文中研究指明胎儿生长受限(fetal growth restriction,简称FGR)是指孕37周后,胎儿出生时体重小于2500g；或者低于同孕龄平均体重的两个标准差；或者低于同孕龄正常体重的第10个百分位数。其发病率2.75%～15.53%不等,并且围产儿的死亡率为正常儿的4～6倍,是引起围产期的重要并发症之一,居围产儿死亡原因第二位。他不仅导致胎儿发育异常,远期也影响儿童期及青春期的体能与智能发育,心血管及糖尿病等患病率也明显升高。胎儿生长受限的病因在国内外已有较多的研究,但目前病因仍不十分明确。目的为探讨FGR孕妇母血、脐血中胎盘生长因子(placenta growth factor,PLGF)水平及胎盘组织中的Bcl-2 (B-cell lymphoma/lenkemiaz, Bcl-2)与FasL (Fasrymndrit Fas, FasL)表达情况,以及探讨叁者间的相关性及其在FGR发生中的作用。材料与方法1研究对象选择郑州大学第叁附属医院2008年7月至2009年5月住院分娩的FGR孕妇40例,同期住院的正常孕妇(对照组)30例。两组孕妇平均年龄为(27.35±2.46)岁,平均孕龄为(38.52±1.28)周。所有孕妇均为单胎、初产妇、月经周期规律、排除肝肾功能异常、无任何妊娠合并症和并发症、无宫缩、剖宫产分娩者。2标本采集孕妇分娩前抽取肘静脉血3ml,胎儿娩出后立即抽脐静脉血3ml。标本采集后经离心(3000r/min,10 min),吸取上清液后放入-80℃冰箱冻存待检。胎盘自然娩出后迅速取母体面中央(避免钙化灶)处约1.0cm×1.0cm×1.0cm小块组织,标本采集后立即用生理盐水冲洗,洗净血液后置入10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片。常规HE染色,分别观察胎盘组织形态以判断切片好坏。3结果判定用酶联吸附试验(ELISA)检测两组脐血、母血血清中PLGF浓度,用免疫组化SP法检测胎盘组织中Bcl-2、FasL表达。以PBS液代替一抗作阴性对照,并设阳性对照,实验步骤严格按照产品说明书操作。胎盘组织中细胞膜和/或细胞浆呈黄色或棕黄色颗粒者为阳性表达,以阳性区平均灰度值为检测指标。每张免疫组化切片随机选取5个具有代表意义的高倍视野(10×40),计算其阳性区平均光密度值。采用上海山富科学仪器有限公司的Biosens Digatal Imaging Systerm对两指标进行灰度值分析。4统计学方法采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析,所有数据均采用(x±s)表示,并且对数据进行正态性检验,两个均数间比较采用t检验,两因素相关性采用直线相关分析。检验水准a=0.05。结果1两组研究对象一般资料比较：FGR组与对照组相比,年龄和孕周的差异无统计学意义(P>0.05)。2 PLGF在两组母血、脐血中的表达比较：FGR组与对照组相比,FGR组明显低于对照组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3 Bcl-2在两组胎盘组织中的表达：在正常组胎盘组织中Bcl-2阳性表达于细胞胞浆或细胞膜,在FGR中相对于正常组织显示弱阳性低表达。FGR组和对照组胎盘组织每高倍镜视野平均灰度值分别为(59.77±9.77)、(79.45±7.19)；
刘萍萍[7]2012年在《sFlt-1、HIF-1α、caspase-3与特发性胎我生长受限发病的相关性》文中研究指明背景胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)是指胎儿娩出后的体重低于同孕龄大小的胎儿平均体重的两个标准差或偏离平均体重的第十个百分数。FGR的发生不仅影响胎儿在宫内的生长发育,而且对胎儿娩出后的体能和智能方面的发育也有重要影响。FGR的常见发病原因分为母体因素、胎儿因素、胎盘因素叁个方面,但目前仍有部分患者病因不明,称之为特发性胎儿生长受限(idiopathic fetal growth restriction, IFGR)。近年来随着微血管病因学研究的不断加深,胎盘侵润性绒毛的血管形成因素也受到关注。动物实验研究表明,IFGR的发病原因与胎盘部位滋养细胞侵润形成的微血管因素密切相关,常表现为胎盘绒毛毛细血管的数目减少或结构功能障碍。究其原因,可能是因为在胚胎发育和胎盘形成的早期,宫内相对缺氧的环境中发生了绒毛滋养细胞的侵润、分化以及成熟异常,导致胎盘的血管形成和功能受到影响,进而出现一系列影响妊娠的并发症。本课题就胎盘组织因供氧不足而引起的胎盘血管形成异常进行研究,以期能对IFGR的早期预测,治疗的评价提供帮助。其中缺氧诱导因子(HIF-1α)是在细胞内的低氧环境下反应灵敏的转录因子。它能调控VEGF、 sFlt-1促细胞生成素、瘦素、内皮素等因子,并参与血管的形成,同时能维持血管的结构和功能。可溶性血管内皮生长因子受体(sFlt-1)与特异VEGF配体结合也会对血管的形成产生作用,且受HIF-1α的调节。半胱天冬氨酸蛋白3(caspase-3)是蛋白酶级联反应的核心蛋白,参与调节胎盘部位绒毛外滋养细胞的凋亡过程,过度表达可使胚胎发育和胎盘形成初期的新生血管数目减少而出现一系列临床症状。目前有关HIF-lα、caspase-3及sFlt-1在IFGR发病中的机制尚不明确。目的研究IFGR患者和对照组胎盘组织中HIF.1a和caspase-3的表达水平以及母血、脐血血清中sFlt.1的表达水平,分析叁者在IFGR发病机制中的作用及相关性。方法1.研究对象选取2010年7月至2011年7月在郑州大学第叁附属医院产科住院并行剖宫产分娩手术的IFGR孕妇30例为实验组。同期选择因骨盆狭窄、社会因素等原因行剖宫产手术的正常足月孕妇30例作为对照组。诊断标准严格参照丰有吉主编的《妇产科学》第2版中关于IFGR的诊断。2.研究方法2.1实验方法：采用免疫组化法测定IFGR组和正常组孕妇胎盘组织中HIF-la和caspase-3的表达,采用酶联免疫吸附技术(ELISA)检测IFGR组和正常对照组胎儿脐带血血清、母血血清中sFlt-1浓度水平。2.2数据分析：实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,实验数据表示为均数士标准差(x-±s),两均数间的比较采用t检验,两因素间的相关性采用Pearson分析法,以a=0.05为检验水准。结果1. IFGR组和正常组孕妇及新生儿一般临床资料的情况分析1.1IFGR组和正常组孕妇的一般临床资料包括：两组孕妇年龄比较(p=0.602),孕前体重比较(p=0.634),孕次比较(p=0.687),分娩孕周比较(p=0.071),产次比较(p=0.746)进行分析比较,差异均无统计学意义(p>0.05),资料具有可比性。1.2新生儿出生时情况比较：IFGR组新生儿体重为(2212±212)g,与正常组新生儿体重(3535±353)g比较p=0.000),差异有统计学意义(p<0.05)。IFGR组的新生儿Apger的评分较正常组新生儿的评分低,差异有统计学意义(p<0.05)。2.IFGR组和正常组孕妇胎盘组织中HIF-1α、caspase-3表达的比较HIF-1α和caspase-3在两组孕妇胎盘组织上均有不同程度的表达。光镜下观察两种蛋白呈棕褐色阳性表达定位,主要集中在胎盘合体滋养细胞、绒毛外滋养细胞和绒毛膜间质及血管内膜周围细胞的胞膜及胞浆上。HIF-la在IFGR组孕妇胎盘组织中的表达水平较正常组高,差异有统计学意义(p<0.05)。caspase-3在IFGR组孕妇胎盘组织的表达水平较正常组高,差异有统计学意义(p<0.05)。3.IFGR组和正常组的血清中sFlt-1表达的比较IFGR组母体血的血清中sFlt-1表达水平高于正常组母体血的血清中的表达水平,差异有统计学意义(p<0.05)。IFGR组脐血血清中sFlt-1的表达水平高于其在正常组脐血血清中的表达水平,差异有统计学意义(p<O.05)。IFGR组脐血血清中sFlt-1的表达水平高于其在IFGR组母体血的血清中的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。4. IFGR组母血、脐血中sFlt-1表达水平与胎盘组织中HIF-lα、caspase-3表达的相关性分析4.1IFGR组脐血血清中sFlt-1的表达水平与胎盘组织中HIF-1α表达水平呈正相关(p<0.05)；母血血清中的sFlt-1水平与胎盘组织中HIF-1α的表达呈正相关(p<0.05)。4.2IFGR组脐血血清中sFlt-1的表达水平与胎盘组织中caspase-3表达水平呈正相关(p<0.05)；母血血清中的sFlt-1水平与胎盘组织中caspase-3的表达呈正相关(p<0.05)。4.3IFGR组胎盘组织中HIF-la蛋白的表达水平与caspase-3蛋白的表达水平呈正相关性(p<0.05)。而在正常组中的表达则无相关性。4.4IFGR组脐血血清、母血血清中sFlt-1的表达呈正相关性(p<0.05)。结论1.胎盘组织中HIF-la和caspase-3的表达异常以及母血、脐血血清中sFlt-1的浓度异常可能参与了IFGR的发病机制。2. HIF-1α可能通过调节caspase-3、sFlt-1的表达,共同影响胎儿宫内生长发育。
徐静[8]2008年在《HIF-1α、VEGF在不明原因反复自然流产患者绒毛组织中的表达及与MVD的关系》文中指出目的:观察不明原因反复自然流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)患者绒毛组织中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1 Alpha,HIF-1α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况及与微血管密度(Microvessel denisity,MVD)的关系,探讨HIF-1α对靶基因VEGF的调节机制在URSA发病过程中的机理,为临床治疗提供理论依据。方法:用免疫组化S-P法检测28例不明原因反复自然流产患者(简称研究组)绒毛组织中HIF-1α、VEGF、MVD的表达情况,以20例同期正常妊娠要求人工流产者作为对照组。采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析。结果1)对照组绒毛中细胞滋养细胞轮廓清晰,核空泡状,合体滋养细胞较大,彼此融合,绒毛内课件星芒状排列的间充质细胞;而病例组绒毛水肿,细胞滋养细胞增生、数量增加,合体滋养细胞明显减少,甚至断裂消失。2)HIF-1α、VEGF在URSA和人工流产组均有表达,主要表达于绒毛滋养细胞和血管内皮细胞的胞浆和胞膜,间质细胞略有表达;病理组绒毛组织中HIF-1α、VEGF的表达强度较对照组显着减弱。3)病例组血管发育不良,管腔狭小或者无明显的管腔,腔内血细胞较少。病理组MVD值显着低于对照组MVD值。4)病理组中HIF-1α与VEGF的表达呈正相关;HIF-1α、VEGF的表达均与MVD呈正相关。结论:1)URSA患者绒毛组织出现程度不同的退行性变,绒毛血管发育不良。2)HIF-1α、VEGF在绒毛组织中的表达,说明了胎盘局部氧信号通过刺激HIF-1α的表达调节靶基因VEGF的转录和翻译,从而参与胎盘滋养细胞的浸润和胎盘血管的发生。3)URSA患者绒毛组织HIF-1α、VEGF表达显着降低,且绒毛组织发育不良,提示HIF-1α、VEGF在妊娠期胎盘局部氧分压信号可通过HIF-1α调节VEGF的表达,与绒毛结构退行性变、血管发育不良存在相关关系,这可能是URSA发生的重要原因之一。4)HIF-1α、VEGF与MVD的相关关系的研究,有望为URSA的预防和治疗提供有力的理论依据。
董枫[9]2011年在《妊娠早期不明原因自然流产患者绒毛及蜕膜组织血管增殖及细胞凋亡的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨血管增殖相关因子胎盘生长因子(PLGF)和可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)及细胞凋亡相关因子半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在早期不明原因自然流产患者绒毛和蜕膜组织中的表达情况;同时分析绒毛和蜕膜细胞的细胞凋亡情况。方法:选择30例不明原因早期自然流产患者(不明原因流产组)、30例早期药物流产患者(药物流产组)和30例正常早期妊娠妇女要求人工流产者(人工流产组)为研究对象,分别收集其绒毛及蜕膜组织。采用DNA缺口原位末端标记技术(TUNEL法)检测绒毛滋养细胞和蜕膜细胞的细胞凋亡情况;采用免疫组织化学SP法检测叁组绒毛和蜕膜组织中Caspase-3、PLGF和sFlt-1的表达水平。结果:1. Caspase-3、PLGF和sFlt-1在绒毛和蜕膜组织中的表达部位:Caspase-3主要在绒毛组织中的细胞滋养细胞和蜕膜组织中的蜕膜细胞中表达,为棕黄色颗粒,在细胞核和细胞浆中同时表达;PLGF和sFlt-1主要表达于绒毛滋养细胞和蜕膜细胞,表达部位在细胞浆,亦为棕黄色颗粒。2. Caspase-3和sFlt-1在叁组绒毛和蜕膜组织中的表达情况:Caspase-3和sFlt-1在叁组绒毛滋养细胞和蜕膜细胞中的表达差异有统计学意义(P均<0.01)。经两两比较,Caspase-3在不明原因流产组绒毛(0.426±0.044)和蜕膜(0.418±0.052)组织中的表达强度显着高于药物流产组(0.281±0.051 , 0.287±0.041)和人工流产组(0.304±0.041 ,0.311±0.034),P均<0.05;sFlt-1在不明原因流产组绒毛(0.432±0.042)和蜕膜(0.436±0.044)组织中的表达强度也显着高于药物流产组(0.299±0.041,0.292±0.039)和人工流产组(0.281±0.044,0.277±0.035),P均<0.05;而药物流产组绒毛和蜕膜组织中Caspase-3和sFlt-1表达强度与人工流产组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。3. PLGF在叁组绒毛和蜕膜组织中的表达情况:PLGF在叁组绒毛和蜕膜组织细胞中的表达差异均有统计学意义(P均<0.01)。经两两比较,不明原因流产组绒毛(0.321±0.035)和蜕膜(0.318±0.022)组织PLGF表达强度显着低于药物流产组(0.414±0.046,0.447±0.044)和人工流产组(0.405±0.029,0.412±0.034),P均<0.05;药物流产组绒毛和蜕膜组织PLGF表达强度与人工流产组比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.绒毛及蜕膜细胞凋亡状况:经过TUNEL染色后,绒毛及蜕膜细胞核呈棕黄色或黄色者为凋亡细胞。凋亡在叁组绒毛和蜕膜细胞中的表达情况:其表达的差异有统计学意义(P <0.01)。经两两比较,不明原因流产组绒毛(50.166±5.180)%和蜕膜(48.668±4.482)%细胞的凋亡指数显着高于药物流产组(19.166±4.169)%、(18.433±3.945)%和人工流产组(18.000±4.000)%、(18.400±3.719)%,差异有统计学意义(P均<0.05) ;药物流产组和人工流产组绒毛和蜕膜细胞的凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.早期不明原因自然流产的发生可能与胎盘绒毛过度凋亡有关,其中caspase-3表达增加可能在凋亡的发生中起重要作用。2.早期不明原因自然流产的发生可能与PLGF表达不足和sFlt-1表达增加导致绒毛和蜕膜血管增殖异常有关。
何于夏[10]2016年在《Twist1通过GCM1调控人类胎盘滋养层细胞合体化的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景新生命的孕育始于卵子和精子的结合。卵子和精子的受精发生在输卵管的壶腹部,受精卵在输卵管向子宫移动的过程中经历卵裂发育为桑椹胚。在受精后4-5天发育为囊胚,此时已到达子宫腔,囊胚由位于内部的内细胞团和外部的滋养外胚层组成,日后滋养外胚层发育为胎盘,内细胞团发育为胎儿。胎盘是一个临时性器官,但是在母体整个妊娠过程中起着举足轻重的作用。胎儿的正常发育离不开胎盘,胎盘是联系母体与胎儿的纽带,对于母胎的健康至关重要。胎盘的发生发育出现异常则会导致妊娠相关疾病的发生,包括子痫前期(pre-eclampsia)、早期流产(first trimester miscarriage)和胎儿发育迟缓(fetal growth restriction),严重时可导致胎儿死亡。因此,胎盘的正常发育和其功能的正常调控对于人类妊娠过程中胎儿的正常发育非常重要。细胞融合是哺乳动物常见的生理过程,它参与受精、胎盘发育、骨骼肌和骨头的发育以及免疫防御反应。在卵子和精子结合的过程中,精子穿过透明带后继续穿过卵细胞的细胞膜,受精卵形成的这个过程发生了精子与卵细胞的融合。在人类胎盘绒毛发育过程中,同样也存在细胞融合事件的发生。囊胚种植入子宫后,接下来的胎盘发育开始出现胎盘绒毛。在胎盘绒毛的形成过程中,细胞滋养层细胞主要沿着两条途径分化。侵润迁移途径：细胞滋养层细胞(cytotrophoblast, CTB)分化为具有侵润能力的绒毛外滋养层细胞(extravillouscytotrophoblast, EVT)向母体子宫发生侵润;融合途径：胎盘绒毛细胞滋养层细胞中有一类具有增殖分化能力的细胞,这类细胞可分裂为两个细胞,其中一个与外围的合体滋养层(syncytiotrophoblast, STB)发生融合,而另一个细胞继续保持有丝分裂特性。在细胞滋养层细胞融合到合体滋养层的过程中,细胞滋养层细胞不仅将其细胞核融进合体滋养层,还有胞质中的细胞器包括线粒体、内质网、高尔基体等所有物质都进入了合体滋养层。细胞滋养层细胞不断持续融入合体滋养层的这种特性能够让合体滋养层的表面积不断扩大,同时更新现有的合体滋养层,使得合体滋养层中老化的部分代谢到母体血液循环中完成自身的新陈代谢从而实现胎盘的发育和成熟。老化的内容物和凋亡的物质聚在一起形成合体滋养层结节,这种结节将从合体滋养层排放到母体血液中从而维持的合体滋养层稳态。这对于胎儿胎盘的新陈代谢是至关重要的。如果细胞融合失去控制,导致合体滋养层凋亡或坏死物质大量的排到母体血液中则有可能引起母体妊娠炎症反应过度,导致妊娠疾病如子痫前期等的发生。胎盘是母体与胎儿进行气体交换、供应营养物质和排除代谢产物的场所。大约在受精后第3周末,绒毛内的中胚层分化出毛细血管形成叁级绒毛,此时开始胎儿胎盘循环系统的建立。绒毛间隙充满了由母体子宫螺旋动脉提供的血液,子宫螺旋动脉的血液富含氧气及胎儿发育所需的营养物质。位于绒毛外层的合体滋养层可与子宫螺旋动脉血直接接触,进行营养物质、代谢物和气体的交换。同时合体滋养层还可以阻碍来自于母体病原体的进入,如抵抗李斯特细菌等病原体。若合体滋养层结构遭到破坏,来自母体血液的病原体则可能入侵,影响胎儿的生长与发育。胎盘同时还是一个具有代谢和内分泌功能的器官,可合成各种激素,包括绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、胎盘催乳素(human placental lactogen, hPL)、雌激素、孕激素和胎盘生长因子等。这些分子的正常合成及分泌对于胎盘的正常发育和功能的发挥以及妊娠的维持等各个方面起着至关重要的作用。气体、营养物质在母体与胎儿的正常交换、母体病原体进入胎儿受到的阻碍以及以上激素的正常分泌依赖于合体滋养层结构的正常发育,形成良好的胎盘屏障结构,充分保证了胎儿发育的正常进行。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition. EMT)是上皮细胞转化为具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。EMT中最典型的特征是E-cadherin的降低或缺失。研究发现一些转录因子包括Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2以及Twist1可通过抑制E-cadherin的表达促进上皮向间质的转化。这些转录因子被称为EMT相关因子。本研究团队之前已报道Cullin7通过调控ZEB1和Slug的表达,从而促进胎盘绒毛中滋养层细胞的侵润迁移,滋养层细胞的EMT转化。其他研究也发现EMT相关因子,包括Twist1、Snail和Slug在胎盘绒毛中滋养层细胞的侵润迁移分化过程中发挥重要的作用。以上研究表明EMT相关因子(ZEB1、Twist1、Snail和Slug)在滋养层细胞的侵润迁移过程中发挥重要作用,但这些EMT相关因子在绒毛中滋养层细胞分化的融合途径中是否也发挥同样重要的作用,这方面的研究报道不多。因此,本实验的研究目的主要是检测EMT相关因子在胎盘绒毛中细胞滋养层细胞融合分化途径中的作用。通过实验研究我们证实了转录蛋白Twist1参与了滋养层细胞的融合分化过程,并在其中发挥着重要的作用。并首次研究发现了Twist1可在转录水平上调控GCM1的表达从而促进滋养层细胞的融合。EMT相关因子Twist1不仅在胎盘母胎界面促进上皮.间质的转化,在滋养层细胞的另一条分化途径中(融合途径)同样发挥重要的生理功能。这些研究结果将有助于我们进一步了解胎盘滋养层融合发生及胎盘形成的分子机制。深入研究胎盘形成的生理机制为临床上预防胎盘发育异常引起的妊娠相关疾病提供分子理论基础,更加深入了解妊娠相关疾病发生的病理机制,为日后治疗妊娠相关疾病提供更多、更加有效的治疗方法。第一部分Twist1在人类胎盘滋养层细胞融合过程中的作用[研究目的]通过检测EMT相关分子在人类胎盘绒毛滋养层细胞自发合体化过程中的表达情况,探讨EMT相关分子在人类胎盘绒毛滋养层细胞融合过程中的作用,有利于我们进一步了解胎盘发育过程中滋养层细胞的融合分化途径。[研究方法]2014年5月至2015年5月从北京妇产医院收集人类胎盘,包括妊娠早期人工流产绒毛(6-8周)、妊娠中期引产的正常胎盘(18-20周)和足月分娩的胎盘(38-40周)。从足月胎盘中分离原代滋养层细胞,建立原代滋养层细胞自发合体化模型。原代滋养层细胞培养期间,收集不同时间点的细胞,通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测p型人绒毛膜促性腺激素(p-hCG)的mRNA水平及蛋白表达水平,运用免疫荧光方法检测原代滋养层细胞合胞体的形成确定原代滋养层细胞自发合体化模型的成功建立。利用实时定量PCR检测EMT相关因子(Twist1、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2)在原代滋养层细胞自发合体化过程中的表达变化。运用免疫组化方法检测EMT相关因子Twist1在妊娠早期绒毛、妊娠中期胎盘及足月胎盘的表达定位。通过蛋白免疫印迹方法检测原代滋养层细胞自发合体化过程中及forskolin (FSK)诱导BeWo细胞融合过程中的Twist1的蛋白表达水平。使用特异性siRNA靶向抑制BeWo细胞中Twist1的表达24小时,随后FSK诱导BeWo细胞融合48小时。观察其对FSK处理的BeWo细胞融合过程的影响,包括合胞体的形成及β-hCG的蛋白表达水平。[研究结果](1)免疫荧光显示原代滋养层细胞在培养的过程中会自发聚集形成合胞体。随着培养时间的延长,滋养层细胞形成的合胞体越大,72小时后合胞体中的细胞核数可达10个以上。β-hCG的mRNA水平及蛋白表达水平随着滋养层细胞自发合体化的进程而逐渐升高。(2)实时定量PCR检测显示EMT相关因子Twist1的mRNA水平在原代滋养层细胞自发合体化过程中其表达显着性升高,而其他EMT相关因子(Snail、Slug、ZEB1和ZEB2) mRNA水平显着性降低。(3)在妊娠不同时期胎盘绒毛中转录因子Twist1主要表达在细胞滋养层细胞、合体滋养层及绒毛间质细胞,具有明显的核定位信号。(4)Western blotting显示原代滋养层细胞自发合体化过程中,Twist1的蛋白表达水平在24小时已明显升高并持续至72小时。FSK诱导Be Wo细胞融合过程中,与对照组相比较(DMSO), Twist1的蛋白表达水平升高。(5)特异性siRNA靶向抑制Twist1的表达,与对照组(scrambled siRNA)相比较,FSK处理的BeWo细胞的β-hCG蛋白表达水平降低,形成的合胞体数减少,融合指数显着降低。[研究结论](1)足月胎盘分离得到的原代滋养层细胞培养过程中滋养层细胞自发融合形成合胞体,表明了人胎盘原代滋养层细胞自发合体化模型的成功建立。(2)EMT相关因子Twist1的mRNA水平及蛋白表达水平随着原代滋养层细胞自发合体化的进程而升高,并且在妊娠不同时期的胎盘绒毛中的细胞滋养层和合体滋养层都有明显的核定位信号。提示了Twistl可能参与了合体滋养层的形成。(3)利用人绒毛膜癌滋养层细胞系BeWo细胞进行功能实验,发现靶向抑制Twistl的表达后,抑制FSK诱导的BeWo细胞融合,融合指数显着降低,且合成分泌的β-hCG减少。进一步证实了Twist1在滋养层细胞融合过程中的重要作用。第二部分Twist1通过调控GCM1表达促进滋养层细胞的融合[研究目的]本课题第一部分已经初步证实了在人类胎盘绒毛发育过程中Twist1可促进细胞滋养层细胞的融合发生。但目前对于Twist1调控滋养层细胞发生融合的作用机制鲜有报道。GCM 1是目前公认的可促进人类胎盘绒毛中细胞滋养层细胞向合体滋养层发生融合的分子。本部分实验主要探讨Twist1是否通过调控GCM1表达促进滋养层细胞的融合,研究Twistl促进滋养层细胞融合的分子机制。[研究方法]运用免疫组化方法检测Twist1和GCM1在人类早期妊娠绒毛中的表达定位。从人类足月胎盘绒毛中分离得到的原代滋养层细胞分别在常氧(20%)和低氧(2%)条件下培养至72小时,培养期间收集不同时间点的细胞,通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测不同培养条件下Twist1、GCM1和β-hCG的表达情况。使用特异性siRNA靶向抑制BeWo细胞中Twist1的表达,然后FSK诱导BeWo细胞融合48小时。运用实时定量PCR观察Twist1 siRNA对FSK处理的BeWo细胞融合过程中GCM1以及下游分子syncytin1和syncytin2的mRNA表达水平的影响。在293T细胞中共同转染表达Twist1的质粒及插入GCM1基因第二内含子区域的报告质粒,利用荧光素酶报告实验检测了不同总量的Twist1质粒对GCM1转录活性的影响。进一步通过染色质免疫共沉淀实验研究Twist1蛋白与GCM1靶基因的相互作用。[研究结果](1)免疫组化结果显示Twist1和GCM1在人类妊娠早期绒毛中具有相似的表达定位,在妊娠早期绒毛的细胞滋养层和合体滋养层都有表达,具有明显的核定位信号。(2)与常氧(20%)培养条件相比,从足月胎盘分离得到的原代滋养层细胞在低氧(2%)条件中培养时,融合能力受到影响,表现为β-hCG蛋白的表达水平受到抑制。在常氧(20%)培养条件下,随着培养时间的延长,原代滋养层细胞的Twist1蛋白表达水平升高及GCM1的mRNA水平显着升高。而在低氧(2%)培养条件下,Twist1蛋白的表达水平及GCM1的mRNA水平同时受到抑制。(3)在人绒毛膜癌来源的细胞系BeWo细胞中特异性地敲低Twist1的表达,GCM1在siRNA实验组的mRNA水平显着降低。GCM1下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA实验组亦显着降低。(4)在293T细胞中共转染了过表达Twist1质粒和GCM1报告质粒,荧光素酶报告实验发现Twist1影响了GCM1的转录活性,具有增强GCM1转录活性的作用,并且随着转染过表达Twist1质粒总量的增加,GCM1的转录活性也随着升高。(5)BeWo细胞中加入FSK诱导融合48小时后,通过染色质免疫共沉淀实验发现转录因子Twist1可以与位于GCM1基因第二内含子中的E-box序列结合。[研究结论](1)Twist1和GCM1在妊娠早期绒毛中相似的表达定位,并且在不同氧气浓度培养条件下,Twist1和GCM1表达水平的变化趋势具有相似性,推测Twist1和GCM1之间是否存在可能的联系。(2)在BeWo细胞中特异性敲低Twist1的表达后,GCM1及其下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA实验组显着降低,提示Twist1可能通过调控GCM 1的表达促进滋养层细胞的融合。(3)为了进一步验证了以上假设,通过荧光素酶报告实验发现Twist1可增强GCM1的转录活性。同时,染色质免疫共沉淀研究结果显示Twist1可与GCM1基因的第2内含子中富含E-box序列的区域结合。综上所述,Twist1可能通过与GCM1基因第2内含子中的E-box序列结合,从而调控GCM1的表达,促进滋养层细胞的融合。
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[10]. Twist1通过GCM1调控人类胎盘滋养层细胞合体化的机制研究[D]. 何于夏. 南方医科大学. 2016
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