王思勤[1]2004年在《N～α-脱乙酰化重组人胸腺素α1工程菌的构建及表达产物分析》文中研究指明胸腺素α1（Thymosin α1，Tα1）是一种酸性多肽，含有28个氨基酸，不含蛋氨酸、半胱氨酸和芳香氨基酸，无二硫键及糖基化，唯一的修饰是N端乙酰化。采用独特的大肠杆菌分泌型表达技术，将含有人Tα1基因的重组质粒转入大肠杆菌，使表达产物直接分泌至细菌的细胞间质中，因此下游纯化工作简单，产品成本较低。以大肠杆菌表达的Tα1，与天然的Tα1具有相同的氨基酸组成，唯一不同的是N端缺少乙酰化修饰。而在1998年，美国科学家采用多种方法对Tα1体外生物学活性进行了研究和比较，结果表明N端有无乙酰化修饰，对Tα1生物活性影响不显着。为了实现Tα1的高效表达，首先要成功地构建基因工程表达质粒PSTⅡ-Tα1。用PSTⅡ作为起始质粒，其结构包括碱性磷酸酶启动子（PhoA promoter），翻译增强子序列，Shine-Dalgano序列，STⅡ序列，Amp及Tet抗性基因，复制起点。合成Tα1目的基因后，将其克隆入PST Ⅱ的启动子下游。Tα1的cDNA序列采用化学法分步合成，先合成4个两两互补的寡核苷酸片段，将其互补配对后，两端会分别形成Hind Ⅲ和Sph I核酸内切酶位点的粘性末端。然后利用双酶切法构建重组质粒，经连接、转化、鉴定、筛选等步骤后，最终获得带有目的基因片段的重组质粒PSTⅡ- Tα1。该质粒经双酶切鉴定、目的基因序列分析，证实了重组质粒结构的正确性。重组质粒获得后，选择合适的表达工程菌进行外源基因的表达至关重要，基因正确表达后才能最终获得需要的产品Tα1。采
方宏清[2]2009年在《胸腺素α1（Tα1）的生物合成研究》文中进行了进一步梳理胸腺素α1(Tα1)具有重要的免疫调节活性,在感染性疾病和癌症治疗方面具有潜力。此外,Tα1还具有佐剂作用,提高流感疫苗和乙肝疫苗的免疫效果。SciClone公司上市的Zadaxin(化学合成的Tα1)已在临床上用于乙肝、丙肝和肿瘤等疾病的治疗。化学合成的Tα1成本高,价格昂贵,本研究拟建立一种生物合成Tα1的方法以降低生产成本。Tα1是一个由28个氨基酸残基组成的多肽,其N-末端具有乙酰化修饰。其一级结构为:Ac-SDAAVDTSSEITTKDLKE KKEVVEEAEN。应用基因工程技术制备Tα1目前还存在两大困难,一是N-末端乙酰化修饰;二是小分子多肽的表达。蛋白质的N-末端乙酰化修饰是在N-末端乙酰转移酶(N-terminal acetyltransferase,NAT)的催化下,将乙酰辅酶A(AcCoA)的乙酰基(Acetyl,CH3CO-,分子量43.018Da)转移到蛋白质的N-末端氨基酸残基的氨基上。一个蛋白质能否被N-末端乙酰化修饰至少取决于两个因素,一是蛋白质的氨基酸序列,二是有无相应的NAT存在。为了解决Tα1的乙酰化修饰问题,我们首先将Tα1与大肠杆菌内源性乙酰化蛋白(L12、S5和S18)融合进行表达,分别称为A2融合蛋白(Tα1-Cys-L12)、A5融合蛋白(Tα1-Cys-S5)和A8融合蛋白(Tα1-Cys-S18)。Tα1位于融合蛋白的N端,其后有一个Cys残基。融合蛋白只含有一个Cys残基,可以利用CDAP进行特异性切割,获得完整的Tα1。这叁个融合蛋白基因克隆到载体pET22b上获得表达质粒pET-A2,pET-A5和pET-A8。在融合蛋白的C端增加了6个His残基,便于纯化。在表达纯化后,利用Q-TOF MS进行融合蛋白分子量分析,发现A2融合蛋白和A8融合蛋白均有部分存在乙酰化修饰。A5融合蛋白因难以纯化未进行分析。对A2融合蛋白进行胰蛋白酶消化,获得乙酰化的N端1-14肽段,对该肽段进行MS-MS测序,确证了乙酰化修饰发生在N端的第一个残基Ser上。从而证明Tα1融合蛋白可以在大肠杆菌内获得N-末端乙酰化修饰。在大肠杆菌内直接表达Tα1融合蛋白,只有部分融合蛋白获得了乙酰化修饰,还有一部分以非乙酰化修饰形式存在。如果要利用基因工程技术表达Tα1,使Tα1获得充分的N-末端乙酰化修饰是必要的。那么如何做到这一点呢?我们知道N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶催化的修饰过程。如果能找到修饰Tα1的相关NAT,提高该NAT的表达水平就有可能使表达Tα1融合蛋白完全乙酰化。根据这样的思路,采用Red重组技术敲除大肠杆菌内已知的NAT基因和推测的NAT基因,然后研究Tα1融合蛋白在各NAT基因敲除菌内表达后的修饰情况,寻找相关的NAT。我们成功地敲除了rimI、rimJ、rimL和yjaB四个基因。未能敲除yhhY、yjgM和yjhQ。为了方便以后利用天冬内酰胺酶或羟胺进行切割获得Tα1,构建了A22融合蛋白(Tα1-Gly-L12),这样融合蛋白中就有Asn-Gly肽键。同样也在融合蛋白的C端增加了6个His残基,便于纯化。发现在rimJ敲除菌内表达时,A22融合蛋白不存在乙酰化修饰形式。而在出发菌和其他叁个基因敲除菌内,A22融合蛋白都有乙酰化形式存在。这说明rimJ基因与Tα1融合蛋白的乙酰化修饰密切相关。为了进一步确证这一关系,我们进行了基因补救试验。将rimJ基因克隆到与pET22b相容的载体pACYCDeut-1中得到表达质粒pACYC-rimJ。将pET-A22与pACYC-rimJ共转化到rimJ敲除菌株内进行共表达,发现A22融合蛋白全部以乙酰化形式存在。这进一步说明,Tα1融合蛋白的乙酰化修饰是与rimJ基因直接相关的。又进一步,我们表达纯化了RimJ,以在rimJ敲除菌株内表达获得的非乙酰化的A22融合蛋白为酶底物,进行了体外乙酰化修饰研究。发现在AcCoA存在下,RimJ可以体外乙酰化修饰A22融合蛋白。同时没有AcCoA存在或RimJ存在时,A22融合蛋白不能发生乙酰化修饰。这说明,由AcCoA提供乙酰基团,RimJ具有催化Tα1融合蛋白进行乙酰化修饰的活性,不需要其他辅助亚基。这一点与真核来源的乙酰转移酶性质不同。真核NATs都是由两个以上不同亚基组成的。上述研究结果表明,Tα1融合蛋白在大肠杆菌中表达时可以获得N-末端乙酰化修饰,该修饰过程由大肠杆菌中修饰核糖体亚基蛋白S5的N-末端乙酰转移酶RimJ催化。而且与RimJ共表达,Tα1融合蛋白可以获得完全乙酰化修饰。Tα1难以直接进行胞内表达。采用融合表达需要对融合蛋白进行切割才能获得Tα1。根据Tα1结构特征,可以采用叁种方法进行切割获得完整的Tα1。一是CDAP诱导的X-Cys肽键特异性切割方法;二是利用天冬内酰胺酶特异性切割Asn-Gly肽键的方法;叁是Intein介导的N端切割方法。本文尝试了利用Intein介导切割获得Tα1的方法。本文选择了叁种不同来源的Intein,分别是SplDnaX Intein(136个氨基酸残基,来源于Spirulina platensis)、PhoPol II Intein(166个氨基酸残基,来源于Pyrococcus horikoshii)和MxeGyrA Intein(198个氨基酸残基,来源于Mycobacterium xenopi),构建了Tα1与Intein的融合蛋白的表达载体pET-AS、pET-AP和pET-AM。叁种融合蛋白AS、AP和AM的C端都带有(His)6标签。将重组菌BL21(DE3)/pET-AS/pACYC-rimJ、BL21(DE3)/pET-AP/pACYC-rimJ和BL21(DE3)/pET-AM/pACYC-rimJ接入含有氨苄、氯霉双抗的FML液体培养基中,37℃、200rpm振荡培养约12h。离心收集菌体,破菌,叁种融合蛋白都位于上清中。通过镍亲和层析柱纯化获得AS、AP和AM等融合蛋白。首先进行温度诱导水解切割研究。发现AS和AP两种融合蛋白可以在37℃以上时发生水解切割,尤其是55℃时孵育12h切割百分率达到50%以上。AM融合蛋白则不能发生水解切割,其在高温下易变性。但是AM融合蛋白很容易在巯基试剂诱导下发生硫解切割,尤其在低温切割百分率明显高于AS和AP两种融合蛋白。由于SplDnaX Intein的分子量较小,Tα1在其中所占的百分比最高,因而较容易获得高产量。因此,我们研究了利用DTT和β-ME诱导切割AS融合蛋白制备Tα1。在100 mmol/L DTT存在下,42℃孵育24 h,有90%左右的融合蛋白发生切割。每升培养液中的融合蛋白纯化后经DTT诱导切割可以获得56 mg纯度为73%的Tα1。应用串联质谱测定了Tα1全序列,表明其N-末端具有乙酰化修饰。因此,该方法具有实际应用潜力,值得进一步深入研究。综上所述,本文研究结果显示:1)Tα1融合蛋白(Tα1位于N端)在大肠杆菌中表达时有部分融合蛋白的N末端被乙酰化修饰,而且这种修饰与大肠杆菌内源性N-末端乙酰转移酶RimJ有关。2)与RimJ基因共表达,Tα1可以完全被乙酰化修饰。3)应用Intein介导的N端切割技术制备具有N-末端乙酰化修饰的Tα1具有发展潜力。
参考文献：
[1]. N～α-脱乙酰化重组人胸腺素α1工程菌的构建及表达产物分析[D]. 王思勤. 吉林大学. 2004
[2]. 胸腺素α1（Tα1）的生物合成研究[D]. 方宏清. 中国人民解放军军事医学科学院. 2009