刘安[1]2016年在《PD-1/PD-L1通路小分子抑制剂的发现》文中研究说明近年来,在肿瘤治疗领域,人们越来越多地致力于利用自身免疫系统来抵御肿瘤,这种通过调动机体免疫系统,抑制和杀伤肿瘤细胞的方法称为肿瘤免疫治疗。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向,其中包括细胞免疫疗法、肿瘤疫苗,以及免疫检查点抑制剂等研究热点,并已取得了很多具有应用前景的研究成果。免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下,免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,然而,机体在受到肿瘤侵袭时,免疫检查点的激活可抑制自身免疫,有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。目前,已批准上市两个免疫检查点——CTLA-4和PD-1——的靶向药物。程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是一种诱导表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞等表面的共刺激分子,两个天然配体分别为PD-L1和PD-L2,表达于肿瘤细胞和抗原递呈细胞。激活PD-1/PD-L通路对已活化的T细胞有反向调控作用,降低T细胞活性,甚至诱导其凋亡。反之,阻断PD-1/PD-L通路可以增强T细胞活性以达到肿瘤免疫治疗的效果。因此,研究PD-1/PD-L信号通路调节T细胞活性的机制对肿瘤发生和发展,自身免疫性疾病和慢性病毒感染均具有重要的生物学意义。目前,针对PD-1/PD-L1,FDA已批准上市3个单克隆抗体(Opdivo、Keytruda、Tecentriq),主要适应症为黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、肾细胞癌,以及膀胱癌等,均取得了较好的疗效,能够明显延长患者的总生存期,副作用相对化疗药物较小。无论是针对PD-1,还是PD-L1,尽管单克隆抗体药物研究是一个热门课题,但是,关于小分子抑制剂的研究报道却很少,甚至尚未有进入临床阶段的小分子抑制剂。然而,PD-1/PD-L通路小分子抑制剂的研究具有巨大的潜在应用价值,因为小分子抑制剂不仅可以克服单克隆抗体药物所具有的免疫源性副作用和成药性方面的不足,而且还可以降低生产成本,节约治疗费用。为此,本论文的工作将以PD-1/PD-L1通路为靶,借助计算机辅助药物设计,采用有机合成等手段,构建具有潜在应用前景的先导化合物。确定上述研究目标之后,本论文的工作将面临3个难点:(1)基于蛋白-蛋白相互作用(PPI)的结合位点。因为PPI界面具有开放性、动态性和广泛性等特点,为设计小分子化合物带来巨大的困难,致使以PPI为靶,设计小分子药物成为本领域公认的一大挑战。(2)研究之初,尚未有公开的、在分子水平进行活性评价的体系,无法对虚拟筛选出的化合物进行及时、快速的评价。(3)针对PD-1/PD-L1通路,尚无小分子抑制剂的研究报道,致使发现具有活性的小分子抑制剂处于一个从无到有的状态。针对以上问题,开展了以下研究工作:1.以鼠源PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现因尚未有人源PD-1/PD-L1复合晶体的报道,研究初期阶段,本论文选择鼠源PD-1与人源PD-L1的复合晶体(PDB code:3BIK)为出发点,采用分子对接与虚拟筛选进行基于受体结构的计算机辅助药物设计,对自有小分子数据库,以及Maybridge数据库等进行优化,筛选出若干小分子化合物进行生物活性评价,确定适合结构改造的先导化合物str149,以二甲氨基苯甲酸酯为母核,设计合成了13个衍生物,其中2个化合物活性高于str149。通过分析以上小分子化合物的构-效关系,探索了此类化合物结合靶蛋白的机制,对后续研究起到示范作用。目前尚无分子水平的PD-1/PD-L1小分子抑制剂活性评价体系的报道,如何在分子水平上评价小分子抑制剂的活性是一个重要的问题。为此,本论文建立了正反2种ELISA模型,即―包被PD-1重组蛋白‖和―包被PD-L1重组蛋白‖,验证了模型的可靠性,使之成为快速检测小分子抑制剂活性的实验平台。在自建的ELISA检测模型上获得的实验数据,与后期使用的HTRF模型上获得的实验数据具备一致性,ELISA检测模型的结果较HTRF模型的结果整体上低10%左右,这是由于ELISA体系自身的局限性所致。综上所述,自建的ELISA检测模型与HTRF检测模型形成相互印证,最大限度地排除了单一检测方法可能导致的假阳性小分子的存在,确保所筛选的先导化合物的可靠性。因此,本论文所建立的―计算机设计-小分子化合物的合成-生物活性评价‖体系,为快速筛选小分子抑制剂奠定了基础。2.以人源PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现2015年12月,人源PD-1/PD-L1复合晶体结构(PDB code:4ZQK)首次见诸报道,对比人源和鼠源复合晶体中的PD-1蛋白,分析处于PD-1/PD-L1相互作用表面不同的氨基酸,本论文对人源PD-1进行分子对接,着重对Maybridge数据库以及FDA库进行化合物活性筛选,共选出150个化合物在HTRF检测模型上进行活性评价。其中活性较好的化合物RH02220和RJC04089,在100?M下对PD-1/PD-L1的抑制率超过50%。为此,我们以RH02220和RJC04089为模板,进行相似性搜索,得到36个相似度达70~95%的化合物,再次进行活性评价,最终选择活性较优、结构合理的化合物RJC04089和XBX00144作为结构改造的先导化合物。如前所述,PD-1/PD-L1复合晶体为靶的小分子化合物设计,由于活性位点为PPI模式,致使计算机设计和筛选先导化合物的难度很大。充分了解蛋白表面活性位点是此项研究的重要工作,有助于发现先导化合物。因此,我们针对PD-L1与PD-1作用的关键氨基酸121-125,设计了13条五肽小分子,探索了5个氨基酸残基在PD-1/PD-L1结合时的作用关系,从蛋白质结合角度为发现先导化合物做了基础性的研究工作。3.以人源PD-L1与化合物复合晶体为靶的小分子抑制剂的发现2016年4月,活性小分子(BMS-202)与h PD-L1的复合晶体(PDB code:5J89)首次见诸报道,揭示了该类抑制剂干扰PD-1/PD-L1结合的机制是诱导PD-L1二聚化,占据PD-L1与PD-1结合的活性表面,从而抑制PD-L1与PD-1结合。该机制为设计小分子抑制剂提供了一个全新的视角。有别于前2种模型中小分子的结合位点是在蛋白结构表面,该复合晶体中,PD-L1是在BMS-202的诱导下形成二聚体,两个PD-L1组成了一个管道式活性口袋,有利于结合小分子。在此模型下筛选出的小分子抑制剂具有较高的活性。本论文采用该方法对自有化合物库进行筛选,在100?M条件下,抑制率达到50%的化合物超过10个,在333?M条件下,化合物str5730可以达到完全抑制。细胞水平结合实验同样显示,在200?M下,str5730对PD-1/PD-L1结合有明显的抑制作用,且抑制率与化合物浓度之间呈依赖性关系,由此确定str5730为结构改造的先导化合物。在本课题研究期间,关于PD-1/PD-L1蛋白晶体的报道有2次重大突破,每一次更加精确的蛋白结合信息的报道,均为本论文的小分子结构设计带来更好的结果。利用GOLD、SYBYL、DS以及Autodock等计算机辅助设计软件,选择不同的条件,对自有库10000+个化合物,Maybridge商业库56000+个化合物以及FDA药物库进行分子对接、虚拟筛选及结合自由能评价,综合上述信息,选择部分化合物进行蛋白水平的活性筛选,而后在细胞水平上,对优选化合物进行活性评价,最后得到活性较好的小分子——str5730,可作为PD-1/PD-L1为靶的先导化合物。总之,针对PD-1/PD-L1通路,随着对蛋白晶体活性构象了解的不断加深,以及化合物数据库的不断丰富,立足计算机辅助药物设计的策略,将会发现更多的PD-1/PD-L1通路小分子抑制剂,以达到小分子免疫治疗的目的。
贺加贝[2]2016年在《NSCLC患者血浆和肿瘤组织中PD-1、PD-L1的表达水平和临床意义的研究》文中指出肺癌是目前世界上导致肿瘤相关死亡的最常见病因,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占绝大部分。尽管化疗、放疗方案不断发展,针对不同基因突变类型的分子靶向药物也不断推出,NSCLC患者的预后仍不容乐观,5年生存率几乎低于15%,新的治疗方法亟待研发。肿瘤作为一种慢性的、多基因、炎症促进性疾病,其产生及进展的机制十分复杂。越来越多的证据表明,肿瘤的生长伴随着特殊的肿瘤微环境形成,并且能通过若干方法来逃避免疫监视、打乱免疫调定点,从而躲避机体免疫系统的消灭。肿瘤本身包含许的基因和表观的改变,这些改变能够产生可能被免疫系统识别的肿瘤抗原,从而触发机体的T细胞免疫应答。无论肿瘤在什么部位,免疫系统T细胞首先识别肿瘤细胞作为非正常组织,然后产生大量的能移动并侵入肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL),从而特异性的结合并杀死肿瘤细胞。在正常组织中,免疫调定点之间存在着一种平衡,使T细胞免疫反应保持在合适的强度和范围内,从而能够最小程度地损害正常组织避免自身免疫性疾病的发生。然而,肿瘤能够利用许多通路上调穿过细胞表面的分子的负向调控信号,从而抑制T细胞活性或者诱导其凋亡进而促进肿瘤进展和转移。越来越多的基础和临床试验表明利用抗体阻断调定点通路的免疫治疗方法,能够恢复机体的肿瘤抑制和促进抗肿瘤活性,从而达到治疗肿瘤的目的。近年来,通过对肿瘤免疫耐受和逃逸机制的广泛而深入的研究发现,参与机体免疫调节的协同刺激分子的表达异常在肿瘤的免疫逃逸中扮演着重要角色。近几年,CD28/B7协同刺激分子家族成员不断扩大,程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡因子1配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)作为C D28/B7协同刺激分子超家族的新成员,可以介导负性协同刺激信号,能有效抑制T、B细胞的功能和增殖,同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌,该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫逃逸、肿瘤微环境形成中起到了重要的作用,和肿瘤的发生和发展密切相关。阻断PD-1/PD-L1通路能够抑制肿瘤微环境的形成并且增强内源性的抗肿瘤免疫应答。目前处于临床试验阶段的PD-1/PD-L1抑制剂有很多,具体的实验方案也不尽相同,很多问题处于探索阶段。不过在2015年3月,PD-1抑制剂nivolumab已经率先被FDA批准为治疗在经铂为基础化疗期间或化疗后发生疾病进展的转移性鳞性非小细胞肺癌。有研究显示,肿瘤组织中PD-L1的表达或许与NSCLC患者接受免疫治疗的有效性相关,也与NSCLC患者的不良预后和高侵袭性密切相关,但是这个观点目前仍存在一些争论。随着研究的不断深入,协同刺激分子已经被证实能够分别以细胞膜型和可溶性分子两种形式存在。据临床研究显示,许多可溶性协同刺激分子的表达水平同样具有诊断或疾病预后判断的价值,而且其可溶性的特点也便于临床应用。目前,因缺乏统一有效的检测方法,国内外对可溶性PD-1、PD-L1(s PD-1、s PD-L1)的研究报道较少,其在健康人机体内以及肿瘤患者尤其是肺癌患者体内表达水平是否存在有统计学意义的差异,其生物学意义在临床应用前景如何尚无深入研究,值得进一步探讨。因此在NSCLC患者体内,s PD-1、s PD-L1的表达水平如何?这两种可溶性协同刺激分子与其细胞模型分子的表达强度之间有什么样的关系,与患者临床特征和预后有什么样的关系,PD-1/PD-L1通路与其他小分子蛋白之间的关系?为解答这一系列问题,我们设计了该研究,包括叁部分内容:第一部分:用酶联免疫吸附试验方法检测(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)88例可手术NSCLC患者术前血浆中s PD-1和s PD-L1的表达水平,同时以40名健康志愿者的表达水平为对照。单独或联合分析这些指标与患者临床病理特征和预后的关系。结果显示:血浆s PD-1和s PD-L1表达水平显着高于健康志愿者。生存分析结果表明s PD-L1血浆含量、s PD-L1/s PD-1的比值对患者的生存情况具有显着影响,是患者的独立预后因素:s PD-L1>3.4ng/m L的患者的OS为61.73个月,明显高于s PD-L1≤3.4ng/m L时患者的45.87个月;s PD-L1/s PD-1比值>1.7925时,患者的平均OS为65.10个月,明显高于比值低者的54.44个月。第二部分:应用免疫组化方法(Immunohistochemistry,IHC)检测217例可手术的NSCLC患者术后肿瘤组织中肿瘤细胞以及肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)中PD-1和PD-L1的表达水平,采用多种统计方法对结果进行统计,并单独和联合分析这些指标与患者临床病理特征和预后的关系。结果显示:两者均表达于细胞浆和细胞膜,肿瘤组织中癌细胞的PD-L1的表达水平与NSCLC患者的性别和组织病理学类型有关,TILs的PD-L1表达水平与肿瘤的分化程度相关;肿瘤组织中癌细胞的PD-1表达水平与肿瘤的组织病理学类型和分化程度有关;TILs的PD-1表达水平与患者的性别、组织学类型以及肿瘤的直径相关。肿瘤组织中癌细胞的PD-L1表达水平与癌细胞的PD-1表达水平呈正相关;肿瘤组织中癌细胞的PD-L1表达水平与肿瘤组织中TILs的PD-L1表达水平有显着正相关关系;肿瘤组织中TILs的PD-L1表达水平与TILs的PD-1表达水平有显着正相关关系。NSCLC患者肿瘤组织中癌细胞和TILs的PD-1、PD-L1表达水平在独立和联合分析时均与NSCLC患者的预后无关。第叁部分:针对淋巴结转移阳性的患者,应用IHC方法检测了同一患者术后肿瘤组织及其转移淋巴结中的肿瘤细胞以及TILs中PD-1和PD-L1的表达水平,对结果进行统计分析,验证两者之间是否存在一致性。PD-1和PD-L1的表达水平受很多其他蛋白因子的影响,本课题通过IHC和ELISA两种方法分别检测了VEGF-C在肿瘤组织和血浆中的含量,分析其表达水平与PD-1和PD-L1之间的关系。结果显示:同一患者术后肿瘤组织及其转移淋巴结中的肿瘤细胞以及TILs中,对应转移淋巴结标本内TILs的PD-L1表达水平与肿瘤组织标本中TILs的PD-L1表达水平有显着正相关关系。肿瘤组织中VEGF-C的表达情况与患者的组织类型有关:腺癌的VEGF-C免疫组化得分明显低于鳞癌;血浆中VEGF-C的含量是NSCLC患者预后相关的独立因素。NSCLC患者血浆中PD-L1含量与VEGF-C的含量呈负相关;血浆中PD-1含量与癌组织PD-1表达水平呈负相关;癌组织PD-L1表达水平与VEGF-C的血浆含量呈负相关;TILs的PD-L1、PD-1表达水平均与VEGF-C的血浆含量呈负相关;TILs的PD-L1表达水平与VEGF-C免疫组化得分呈正相关。本文发现与健康志愿者相比,NSCLC患者血浆中PD-L1和PD-1的表达水平失衡,即二者比值增加,并且生存分析提示该比值增加为患者的不良预后因素。因此检测患者外周血和肿瘤组织中的PD-1和PD-L1表达情况,不仅为预后评估、风险分层等诸多方面提供信息,也为个体化的免疫治疗拓宽了思考方向。
宋洋[3]2015年在《病理组织和外周血中PD-L1和PD-1表达对侵袭性非霍奇金淋巴瘤患者预后影响的实验研究》文中进行了进一步梳理背景非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)发病率占所有肿瘤的3%-5%；虽然单克隆抗体、小分子靶向药物等新药的应用提高了患者的生存率,但许多患者仍因疾病复发或原发耐药导致治疗失败；且目前T细胞淋巴瘤(T-NHL)尚无标准的一线治疗方案。对NHL发病机制的深入认识是探索新治疗策略关键。程序性细胞死亡配体1 (programmed cell death legend 1, PD-L1/CD274)程序性细胞死亡受体1 (programmed cell death-1, PD-1/CD279)通路作为免疫负调控通路,参与了抑制性肿瘤微环境的形成,使肿瘤细胞获得免疫逃逸；但其在NHL病理过程中的作用研究较少,尚未见PD-L1/PD-1表达对T-NHL预后影响的报导。本课题通过研究病理组织和外周血中PD-L1和PD-1表达对患者临床特征和预后影响,探讨PD-L1/PD-1通路在侵袭性非霍奇金淋巴瘤病理机制中的作用。目的1、明确病理组织PD-L1和PD-1表达对弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者临床特征和预后的影响。2、明确病理组织PD-L1和PD-1表达对T-NHL患者临床特征和预后的影响。3、明确外周血可溶性PD-L1和PD-1水平对侵袭性B-NHL患者床特征和预后的影响。方法利用免疫组织化学染色技术,回顾性分析我院新诊断的60例DLBCL(2013年4月至2014年12月)和104例T-NHL(2011年1月至2014年12月)患者病理组织中PD-L1和PD-1的表达,研究其与患者临床特征和预后的相关性。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)法,前瞻性研究我院2014年1月至2015年12月新诊断侵袭性B-NHL患者血浆中可溶性PD-L1 (sPD-L1)和PD-1 (sPD-1)水平,分析外周血sPD-L1和sPD-1水平对患者临床特征和预后的影响；并比较其与病理组织PD-L1和PD-1表达的相关性。结果1、部分DLBCL患者病理组织中存在PD-L1和PD-1表达。PD-L1膜表达于肿瘤细胞和及部分浸润的非肿瘤细胞,而PD-1主要膜表达于浸润的淋巴细胞。PD-L1阳性(PD-L1+细胞/所有细胞>30%)患者20例(33%)；PD-1阳性(PD-1+细胞／所有细胞>5%)患者30例(50%)。PD-L1阳性与non-GCB亚型(P=0.028),低CR率(P=0.023)相关；PD-L1阳性患者PFS (P=0.004)和OS(P=0.021)低于PD-L1阴性患者。而PD-1阳性未能影响患者预后(P=0.310)。2、T-NHL患者病理组织中存在PD-L1高表达。PD-L1阳性患者65例(62%),显着高于DLBCL患者阳性率(P<0.000)；而PD-1阳性患者29例(28%),低于DLBCL患者的阳性率(P<0.000)。病理组织中PD-L1和PD-1的表达呈负相关(P=0.032)。PD-L1阳性与B症状(P=0.002)、高IPI (P=0.008)、高PIT评分(P=0.008),以及ENKTCL亚型(P=0.025)相关。PD-L1阳性患者PFS (P=0.002)和OS(P=0.001)显着低于PD-L1阴性患者。而PD-1阳性患者OS倾向于较好(P=0.067)。3、侵袭性B-NHL患者血浆sPD-L1显着高于健康对照者(中位值3.79 ng/ml对0.73ng/ml,P<0.0001);但sPD-1水平与健康对照者相比无显着差异(P=0.105)。sPD-L1升高与大肿块(P=0.022)和低CR率(P=0.041)相关。高sPD-L1 (>4.57 ng/ml)患者的OS差(P=0.006)。但B-NHL患者血浆sPD-L1与病理组织中PD-L1表达未见相关性(P=0.060)。结论1、病理组织PD-L1高表达是DLBCL患者预后不良的危险因素,其有可能作为DLBCL危险分层指标和潜在治疗靶点。2、T-NHL患者病理组织PD-L1表达显着高于DLBCL患者,且与预后不良相关PD-L1高表达可能是T-NHL患者临床更具侵袭性和预后不良的原因之一。4、外周血sPD-L1升高的侵袭性B-NHL患者预后不良；sPD-L1水平变化与治疗反应相关。sPD-L1有可能作为B-NHL患者预后评估和病情监测的生物学标志。
刘一琦[4]2016年在《多端柔性直流输电系统控制策略的研究》文中认为稳定的直流电压与合理的负荷功率分配是多端柔性直流输电(Voltage Source Converter Multi-Terminal Direct Current,VSC-MTDC)系统控制的核心问题,该系统优于传统的双端直流输电(High Voltage Direct Current,HVDC)系统,可以实现多电源供电和多负载受电的灵活运行,更适用于能源互联网和可再生能源并网,降低弃光、弃风的比率等。同时,在VSC-MTDC系统中,模块化多电平变换器(Modular Multilevel Converter,MMC)的应用更为广泛,MMC自身结构简单,扩容能力强,可克服大容量输电引起的内部半导体器件容量受限等问题,也正因为MMC内部模块数较多,调制策略的研究对其安全稳定运行具有重要的意义。为此,本文对VSC-MTDC系统的控制方法进行了深入的研究,并且围绕系统电能变换这一重要环节对MMC的建模和调制技术进行了详细的分析。具体内容包括以下几个方面:首先,论文针对VSC-MTDC系统的放射状和网状结构,提出了一种基于下垂控制的改进功率分配方法。该方法在传统下垂控制的基础上,考虑了电压波动和功率分配两个因素,在对目标变换器进行控制时,引入了直流母线电压和输出功率作为比较值,通过比例积分控制器获取两个补偿分量。同时利用低带宽通信技术采集控制信号,最终实现了系统变换器输出侧的直流母线电压的提升,以及在线路电阻随输电线路长度不同取值不同的情况下负荷功率的合理分配。最后验证了该控制方法在不同的柔性直流输电系统网络结构中的稳定性。其次,论文针对VSC-MTDC系统,在改进型下垂控制的基础上,提出了一种最优的负荷功率分配方法。通过对系统π型等效输电线路损耗的分析,基于最优功率流动策略对VSC-MTDC系统的直流电压和功率分配进行优化,得到最小损耗时的各个端口的输出电压,再结合下垂控制中参考输出电压的公式,计算出最优的比例系数来分配系统的功率。最后分析了线路参数和通信延迟对系统的影响,确定了控制系统的稳定性。论文分析了MMC的过调制问题。通过对MMC的广义建模可知,基频分量的幅值反映了变换器的调制比,因此需要减小MMC调制比的最大值从而避免过调制。本文提出了一种调制方法,在调制比中插入补偿分量以便于降低MMC调制比中的基频分量,结合MMC子模块电容参数的设计和变换器的运行范围,分析了调制比中抑制环流的补偿分量与电容电压纹波之间的数量关系,最终得到了MMC最大调制比的取值范围。该方法有效地抑制了系统环流,避免了过调制现象的发生,有利于MMC系统的稳定运行。最后,论文针对VSC-MTDC系统,详细分析了交流侧单相接地故障的控制问题。提出一种通用控制方法,通过采用信号延迟消除法对并网电流进行正负序分解,推导了在不同运行模式下产生的电流参考值,利用比例谐振控制器控制并网电流。同时,针对多电平VSC-MTDC系统,通过理论分析最终得到了MMC的直流侧等效阻抗模型,并进一步讨论了调制比中补偿分量以及MMC子模块电容等参数和等效阻抗模型的相关性。根据MMC直流侧等效阻抗模型,分析了MMC-MTDC系统一端发生故障后,直流侧电压波动传递到另一端的过程,讨论了输电系统中不同参数对波动传递的影响。
侯颖[5]2016年在《重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究》文中提出α-苯丙酮酸(PPA)是一种多功能有机酸,广泛应用于制药、食品、化学工业。传统的化学制备法环境污染严重,微生物发酵法产量低。对于生物转化法,一般采用D-氨基酸氧化酶(D-AAO)催化D-苯丙氨酸合成PPA,反应过程中生成毒性副产物过氧化氢。来自Proteus.sp的L-氨基酸脱氨酶(L-AADs)可特异性催化L-苯丙氨酸(PLA)氧化脱氨基合成PPA,不生成过氧化氢且PLA比D-苯丙氨酸价格便宜。本论文中,在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达了来自Proteus mirabilis KCTC 2566的膜结合L-氨基酸脱氨酶(L-AAD),构建的重组菌株生长态和静止态两阶段全细胞转化PLA合成PPA。主要结果如下:(1)在E.coli BL21(DE3)中过量表达来自Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD,对诱导条件进行了优化,提高了L-AAD表达量。对L-AAD纯化步骤(去垢剂种类、是否超高速离心、缓冲液成分)进行了优化,最终L-AAD纯化了52倍,整体得率13%,比酶活0.94±0.01μmol PPA·min~(-1)·mg蛋白~(-1)。然后利用纯酶L-AAD一步法转化PLA合成PPA,并对转化条件进行了优化。最优纯酶转化条件(0.2 mg·m L~(-1) L-AAD,3.0g·L~(-1) PLA,5 mmol·L~(-1) FAD,p H 7.4,35°C)下,转化2.5 h,PPA产量为2.6±0.1g·L~(-1),转化率为86.7%,合成效率为1.0 g·L~(-1)·h~(-1)。(2)通过两阶段全细胞转化(生长态细胞转化和静止态细胞转化),利用重组E.coli转化PLA合成PPA。首先,对摇瓶生长态细胞转化条件进行了优化(PLA浓度10g·L~(-1),温度35°C),并建立了两阶段温度控制策略(即前12 h,20°C低温诱导,然后向系统中添加PLA,并提高温度至35°C,直到反应结束),转化16 h,PPA产量为7.2±0.4 g·L~(-1),PLA转化率为72.0%。然后对静止态细胞转化条件进行了优化(4 g·L~(-1)PLA,1.2 g·L~(-1)细胞催化剂,p H 7.4,40°C),转化6 h,PPA产量为3.3±0.2 g·L~(-1),PLA转化率为82.5%。分别从PPA产量、底物转化率、合成效率、稳定性、是否需要外加辅酶、可重复使用性这些方面,比较了酶转化和全细胞转化。(3)对3 L罐上两阶段全细胞转化条件进行了优化。生长态细胞转化最优PLA浓度为30 g·L~(-1),反应6 h,达到最大PPA产量21.5±1.3 g·L~(-1),底物转化率71.7%。然后对静止态细胞转化条件进行了优化(搅拌转速500 rpm,通气量1.5 vvm,PLA浓度15 g·L~(-1)),3 h内底物转化率100%。结合影响罐上静止态细胞转化过程的叁个主要因素(细胞失活、底物抑制、产物抑制),构建了静止态细胞转化的动力学模型。经过验证,模型能够较精确地预测实验结果。(4)针对全细胞催化剂的副反应及L-AAD活性低的问题,结合PPA降解途径改造和L-AAD分子改造,提高了全细胞催化能力和PPA产量。首先,敲除了叁种催化PPA降解的氨基酸转氨酶,静止态细胞转化PPA产量从3.3±0.2 g·L~(-1)提高到3.9±0.1g·L~(-1),底物转化率达到97.5%。然后通过易错PCR结合定点饱和突变提高全细胞催化性能。叁点突变体D165K/F263M/L336M有最高的静止态细胞转化PPA产量10.0±0.4g·L~(-1),底物转化率为100%,是野生型的3倍。改造菌株摇瓶生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为19.8±2.3 g·L~(-1)和10.0±0.2 g·L~(-1);3 L罐上生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为45.1±2.1 g·L~(-1)和30.0±1.2 g·L~(-1)。(5)通过代谢改造加强E.coli FAD合成和再生系统提高全细胞活性。首先,向培养基中额外添加FAD,PPA产量提高,证明辅酶浓度是L-AAD催化的限制性步骤。然后过量表达和微调FAD合成途径关键基因(rib H、rib C、rib F),提高转化初始胞内FAD浓度,静止态细胞转化PPA产量提高了90%(19.4±1.1 g·L~(-1))。然后构建了FADH2/FAD再生系统,表达了甲酸脱氢酶和NADH氧化酶,加强了FADH2/FAD再生速率。重组菌株摇瓶生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为57.1±2.3 g·L~(-1)和34.4±1.1 g·L~(-1);3 L罐上生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为75.3±4.3 g·L~(-1)和58.4±3.2 g·L~(-1)。
陈吉翠[6]2017年在《长链非编码RNA U90926在3T3-L1前脂肪细胞分化中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理肥胖症是体内的脂肪组织过度蓄积所导致的一种疾病。研究证实,肥胖症是许多慢性疾病的主要危险因素,可以增加糖尿病、心血管疾病和癌症的发病率。近几年内肥胖症有急剧增长的趋势,尤其在发达国家,也包括经济迅速增长的发展中国家。研究肥胖发生、发展的机制可为人类防治肥胖、提高生活质量提供有价值的理论依据。肥胖症通常可表现为脂肪细胞数量增多和/或体积增大。因此,脂肪细胞和肥胖症的发生发展密切相关。从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞生成的过程称为成脂分化,而此过程对脂肪组织蓄积和肥胖的形成至关重要。因而,脂肪细胞的分化过程及相关的调控机制已经成为研究肥胖及相关疾病的核心。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt)的RNA分子,通常具有polyA尾巴,并且具有以下几个特点:1)表达丰度低于蛋白质编码基因;2)物种间保守性差;3)缺乏开放阅读框(open reading frames,ORFs)从而无编码蛋白质的能力;4)组织特异性表达。由于对其功能认识的不充分,在20世纪90年代,lncRNA 一度被认为是转录过程中的"噪音",是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物。随着分子生物学实验技术的发展,近年来,lncRNA与多种复杂疾病发生之间的关系逐渐受到关注。研究显示,lncRNA可以在多种生物学过程中发挥丰富多样的调控作用,比如可以调控mRNA的降解、X染色体失活、剪接调控、转录激活、染色质重塑等,通过以上作用方式最终参与到细胞增殖、分化、凋亡,物质代谢,肿瘤发生等过程中。也有文献报道,lncRNA可以调控前脂肪细胞的分化,这为人们研究肥胖的发病机制乃至预防和治疗肥胖症提供了新的思路。本课题研究内容分为以下两个部分:第一部分长链非编码RNAU90926(IncRNAU90926)在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的变化及其与肥胖症的关联研究目的:探讨lncRNAU90926在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程中的表达变化及其与肥胖症的关联研究内容:1.以3T3-L1前脂肪细胞为模型,用脂肪细胞分化诱导剂诱导其分化。用油红O鉴定脂滴形成,并在分化的第0、2、4、13天收集细胞做包含编码基因和非编码基因的全转录组图谱分析,即microarray分析,寻找差异表达基因。收集诱导分化不同时间(第0、4、8、12天)的脂肪细胞并提取RNA,用qPCR技术验证microarray分析所得结果。2.采用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization,FISH)实验检测长链非编码RNAU90926(lncRNAU90926)在3T3-L1前脂肪细胞中的亚细胞定位。3.肥胖动物模型的建立:选用6周龄雄性C57BL/6J小鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠为实验材料。适应性喂养一周之后,C57BL/6J小鼠随机分为3组,一组给予基础饲料(脂肪含量5%)喂养,另两组给予高脂饲料(脂肪含量20%)喂养,其中一组高脂饮食的小鼠用来做为ob/ob小鼠和db/db小鼠的对照。ob/ob小鼠和db/db小鼠喂养高脂饲料以期快速达到肥胖状态,每周称动物体重一次,4周之后,ob/ob小鼠和db/db小鼠体重增长超过对照组小鼠体重的30%,造模成功;另一组高脂饮食的C57BL/6J小鼠亦每周称重一次,直至体重超过基础饲料喂养的C57BL/6J小鼠体重的30%,此时即造模成功。造模成功之后,深度麻醉处死小鼠,提取其皮下脂肪组织和内脏脂肪组织(肾周脂肪和附睾脂肪),同时提取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸、棕色脂肪组织进行下述相关检测:1)取小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸、棕色脂肪组织和附睾脂肪组织提取RNA进行实时荧光定量核酸扩增实验,分析lncRNAU90926在不同组织间的表达差异。2)取肥胖小鼠和各自对照小鼠皮下脂肪和内脏脂肪组织,提取RNA,检测 lncRNAU90926、PPARy2(peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2,过氧化物酶体增殖物激活受体γ2)、FABP4(fatty acid binding protein 4,脂肪酸结合蛋白4)和AdipoQ(adiponectin,脂联素)在不同肥胖动物中的mRNA表达变化。研究结果:1.3T3-L1前脂肪细胞经过诱导能分化成为成熟脂肪细胞,油红O染色可以看到大量的脂滴聚积。分化不同天数细胞的microarray结果显示,随着3T3-L1前脂肪细胞的分化,lncRNAU90926的表达呈逐渐下降趋势。收集分化过程中的细胞提取RNA进行qPCR验证,其结果与microarray实验相一致。2.FISH实验表明,lncRNAU90926主要分布于3T3-L1前脂肪细胞胞质中,同时细胞核中也有少量lncRNAU90926存在。3.经过4周喂养,ob/ob小鼠和db/db小鼠体重增长超过对照组小鼠30%,造模成功;经过12周喂养,高脂饮食的C57BL/6J小鼠体重超过基础饲料喂养的C57BL/6J小鼠体重的30%,亦造模成功。4.对小鼠包括附睾脂肪在内的8个脏器组织提取RNA,qPCR扩增lncRNA U90926,结果显示lncRNAU90926主要存在但不局限于白色脂肪组织中,在其他组织也有表达,但其表达丰度较低。5.分别提取各组小鼠皮下、肾周和附睾脂肪组织,分离获得成熟脂肪细胞,检测lncRNAU90926表达,结果表明无论是高脂喂养肥胖小鼠还是ob/ob和db/db肥胖小鼠,其脂肪组织中lncRNAU90926含量均显着低于各自对照组小鼠。而各肥胖组小鼠脂肪组织中PPARγ2、FABP4和AdipoQ的表达量均明显高于对照组小鼠。研究结论:1.3T3-L1前脂肪细胞分化过程中lncRNAU90926的表达量逐渐降低。2.lncRNAU90926主要分布于小鼠白色脂肪组织中,且在脂肪细胞中绝大部分定位于细胞质。3.lncRNA U90926在肥胖小鼠中表达低于对照小鼠,即lncRNA U90926与肥胖负相关。第二部分长链非编码RNA U90926(IncRNA U90926)对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其相关机制研究研究目的:研究lncRNAU90926对3T3-L1前脂肪细胞分化过程的影响及其相关机制研究内容:1.用过表达lncRNAU90926的慢病毒和对照病毒分别感染3T3-L1前脂肪细胞,经嘌呤霉素筛选建立稳定过表达lncRNAU90926的3T3-L1细胞克隆和对照细胞,诱导分化,以油红O鉴定脂滴聚积,收集分化第0、6天的细胞提取RNA,鉴定 PPARy2、FABP4 和 AdipoQ 的表达。收集分化第 0、2、4、6、8、10、12天的细胞进行Western Blotting实验,检测PPARγ2和FABP4的蛋白表达变化。2.设计靶向抑制小鼠lncRNA U90926基因的shRNA序列,构建重组慢病毒载体GV118-U90926-shRNA(以GV118-CON为对照)并包装慢病毒。用适宜滴度的慢病毒感染小鼠3T3-L1前脂肪细胞,鉴定并诱导其分化,用油红O染色鉴定脂肪细胞分化程度,并收集分化第0、12天的细胞提取RNA,检测PPARγ2、FABP4、C/EBPα(CCAAT/enhancer binding protein α,CCAAT/增强子结合蛋白αα)和AdipoQ的表达。收集分化过程中第0、2、4、6天的细胞进行Western Blotting实验,检测PPARy和FABP4的蛋白水平变化。3.用双荧光素酶实验检测lncRNAU90926对转录因子C/EBPα,C/EBPβ和PPAR γ2 转录活性的影响。检索 NCBI(National Center for Biotechnology Information)和Ensemble数据库,查找小鼠lncRNA U90926基因序列以及C/EBPα,C/EBPβ和PPARγ2基因的启动子序列,用基因体外重组的方法构建过表达lncRNA U90926的载体以及C/EBPα,C/EBPβ和PPARγ2包含全长及部分截短片段启动子的报告基因,共转染Hela细胞之后,检测荧光素酶活性以判断 lncRNA U90926 对 C/EBPα,C/EBPβ 和 PPARγ2 转录活性的作用。研究结果:1.分别用过表达lncRNAU90926的慢病毒和对照病毒感染3T3-L1前脂肪细胞,经过嘌呤霉素筛选,扩增,得到稳定过表达lncRNAU90926的细胞株,经过qPCR检测发现过表达细胞株(OV)lncRNAU90926比对照细胞株(NC)显着升高,选出3对克隆进行后续实验。分别对两组细胞(OV及NC)进行诱导分化,于分化不同时期进行油红O染色,染色结果显示,过表达组细胞脂滴聚积能力明显低于对照组。分别收取两组细胞在分化的第0及12天的RNA并进行qPCR检测,实验结果表明,过表达组前脂肪细胞(即第0天的细胞)中PPARγ2和FABP4 mRNA水平与对照组相比表达显着降低,成熟脂肪细胞(即分化第12天的细胞)中PPARγ2、FABP4和AdipoQ的表达亦明显低于对照组细胞。对两组细胞分化不同时期收取的蛋白进行Western Blotting分析,发现两组细胞中PPARγ和FABP4蛋白表达均随分化逐渐升高,但过表达组中二者蛋白表达显着低于对照组。2.分别用3条靶向lncRNAU90926的shRNA序列的慢病毒及对照病毒感染3T3-L1前脂肪细胞,用感染后的细胞群体进行实验观察,选择一条lncRNA U90926敲低效率最高的shRNA病毒用于建立稳转细胞株,即敲低组细胞(KD),同时筛选用对照病毒感染所得到的对照组细胞(CON)。分别对敲低组(KD)和对照组(CON)细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定分化程度,结果显示敲低组脂滴聚积明显高于对照组。分别收取两组细胞分化至第0、6天的RNA进行qPCR分析,实验结果表明,未分化前(第0天),敲低组细胞中PPARγ2、FABP4和AdipoQ mRNA水平比对照组高,分化6天时敲低组细胞中PPARγ2、FABP4、C/EBPα和AdipoQ的表达亦明显高于对照组细胞。分别收取两组细胞在诱导分化的第0、2、4、6天的样品提取蛋白进行Western Blotting分析,发现两组细胞中PPARγ和FABP4蛋白表达均随分化逐渐升高,但敲低组细胞中二者表达明显高于对照组细胞。3.荧光素酶实验分析表明,在Hela细胞中过表达lncRNAU90926对C/EBPα和C/EBPβ的转录活性没有影响,但可以降低PPARγ2全长启动子转录活性的50%,进一步进行PPARγ 2启动子截短分析之后发现,人为去除PPARγ2启动子-2000bp到-1500bp的片段之后,过表达lncRNA U90926失去抑制PPARγ2全长启动子转录活性的能力。研究结论:1.在小鼠3T3-L1前脂肪细胞中过表达lncRNAU90926可以抑制其分化。2.敲低lncRNAU90926可以促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化。3.lncRNAU90926可以抑制PPARy2启动子的转录活性,从而抑制3T3-L1前脂肪细胞分化。4.lncRNA U90926还可能通过其它未知的方式去改变PPARy2在mRNA及蛋白的表达水平,最终改变前脂肪细胞的成脂分化。
陈明台[7]2016年在《长非编码RNA lnc-MC及RBP-ZFP36L1在单核／巨噬细胞分化中的功能及其机制研究》文中研究说明造血是由造血干细胞经过一系列增殖、分化最后形成各种成熟血细胞的过程。这个过程涉及由转录因子、细胞因子和非编码RNA等组成的复杂调控网络。单核/巨噬细胞属于白细胞,也是一类非常重要的固有免疫细胞,同时也在启动适应性免疫应答方面发挥着重要作用。单核/巨噬细胞分化是整个造血链系发育的一部分,也受到一个复杂调控网络的精细调控。它的分化发育异常与急性髓系白血病的发生发展以及机体系统紊乱等众多生理病理过程密切相关。长非编码RNA (lncRNAs)是一类长度大于200nt,不编码蛋白的RNA分子。越来越多的研究表明lncRNAs可以在染色质重塑、转录以及转录后等多个层面调控基因的表达,参与调节众多生物学过程。然而,lncRNAs在造血领域的研究还处于起步阶段,有关lncRNAs在单核/巨噬细胞分化中的功能和机制还鲜有报道。RNA结合蛋白(RBPs)是一类可以在体内结合单链或双链RNA的蛋白分子,通过特定的RNA结构域识别并结合RNA,参与RNA的剪切成熟、运输、定位、翻译、降解等众多RNA代谢过程。研究表明,RBPs介导的转录后调控在哺乳动物发育以及疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。然而,RBPs在单核/巨噬细胞分化中的功能和机制也还鲜有报道。在本课题中,我们通过生物信息学分析以及实验验证,鉴定了一条参与单核/巨噬细胞分化的长非编码RNA (lnc-MC),也筛选到了一个介导单核/巨噬细胞分化的RNA结合蛋白ZFP36L1。通过分析白细胞里的RNA-Seq数据以及ChlPBase中的PU.1-ChIP-Seq数据,我们筛选到了390个可能受到PU.1调控又在白细胞中表达的lncRNAs。结合它们在白细胞中的表达丰度以及物种保守性和编码潜能预测分析,我们把研究集中在了lnc-MC上。Lnc-MC,又名lnc-TRIP10/TCONS 00026873/XLOC 012931,在基因组上的位置为Chr19：6656385-6662832,有两个外显子；缺乏长而有效的开放阅读框,更倾向于是一条非编码RNA；只在灵长类动物中比较保守,其它物种不保守。Lnc-MC在佛波酯(PMA)诱导THP-1和HL-60以及体外诱导脐带血来源的CD34+造血干/祖细胞(HSPCs)向单核/巨噬细胞分化过程中表达逐渐上调。敲低和过表达实验证明lnc-MC可以促进人单核／巨噬细胞分化。染色质免疫沉淀以及单核分化关键转录因子PU.1敲低和过表达实验证明在单核／巨噬细胞分化过程中,PU.1可以结合于lnc-MC基因上游1826bp位点,转录激活lnc-MC的表达。我们也曾证明PU.1抑制ri-miR-199-2转录,导致miR-199a-5p减少,而miR-199a-5p可以通过靶向ACVR1B介导的TGF-β信号通路来抑制单核／巨噬细胞分化。通过RNA荧光原位杂交以及胞质胞核RNA分别抽提并PCR实验发现lnc-MC主要定位于细胞质中,提示其可能主要作为一类转录后调控因子参与单核／巨噬细胞分化。我们通过RNAHybrid预测分析以及实验证明lnc-MC可以和miR-199a-5p相互作用,相互抑制表达并降低可利用性。然而,在单核/巨噬细胞分化过程中,PU.1调节的lnc-MC上调和miR-199a-5p下调使lnc-MC在二者相互竞争中处于优势,从而减弱了miR-199a-5p对于ACVR1B的抑制作用,促进分化。因此,我们的研究揭示了一个新的由lncRNA参与的造血调控机制,即PU.1转录调控的两个非编码RNA, lnc-MC和microRNA-199a-5p,在转录后相互拮抗,通过调节ACVR1B介导的TGF-p信号通路参与单核/巨噬细胞分化。通过分析108例急性髓系白血病(AML)病例芯片以及体外诱导髓系分化芯片资料,我们筛选到了23个既在AML病例中又在体外诱导髓系分化中差异表达的RBPs,最后我们把研究集中在ZFP36L1上。芯片分析结果表明,ZFP36L1在绝大多数AML病例芯片中表达下调,而在体外诱导HSCs向单核系分化的芯片中表达逐渐上调。实验验证发现,ZFP36L1在初诊AML病例中的表达与正常对照相比明显下调,在PMA诱导THP-1和HL-60以及体外诱导脐带血来源的CD34+ HSPCs向单核／巨噬细胞分化过程中表达逐渐上调,与芯片结果一致。敲低和过表达实验证明ZFP36L1可以促进单核／巨噬细胞分化。据文献报道,ZFP36L1属于锌指蛋白家族成员,可以结合于mRNA 3'UTR的富含AU的元件(ARE),在转录后水平负调控基因的表达。因此,为了寻找ZFP36L1下游的靶基因,我们参考AREsite数据库结合芯片分析,最终筛选到了CDK6作为一个潜在的靶点。报告基因实验以及RNA免疫沉淀实验表明,ZFP36L1可以结合于CDK6 mRNA 3'UTR的ARE元件,导致CDK6mRNA的降解以及蛋白表达水平降低。在CD34+ HSPCs中通过慢病毒介导的过表达实验证明了CDK6可以抑制单核／巨噬细胞分化。最后我们又通过ZFP36L1—CDK6的rescue实验,进一步证明了ZFP36L1是通过抑制CDK6的表达来促进单核／巨噬细胞分化的。总之,我们的研究结果揭示了一个由ZFP36L1—CDK6介导的单核／巨噬细胞分化调节通路,同时也为AML的治疗提供了一个潜在的靶点。
陈典兵[8]2017年在《基于稀疏表示的目标跟踪技术研究》文中提出随着计算机计算能力的提高以及计算机视觉技术与人们生活的关系日益密切,计算机视觉的研究获得了越来越多的国内外学者的关注。目标跟踪技术是计算机视觉领域的研究热点之一,其被广泛应用于军事装备中的导引技术、城市安全的视频监控、交通系统中的智能交通以及游戏娱乐中的体感游戏等领域中。虽然目前目标跟踪技术在多个领域都有广泛的应用,大量的算法的提出也使得目标跟踪技术的研究取得了可观的进步,但是由于实际场景中的多种多样的复杂因素,如背景混杂、光照剧烈变化、快速运动与运动模糊以及遮挡等,设计一个鲁棒性好,实时性强的目标跟踪算法仍然是具有重大研究意义。因此,本文基于目标跟踪技术的研究,尝试解决目标跟踪中的一些关键问题,并从目标的表观模型的改进出发,取得了以下几个创新点:1)提出一种基于残差矩阵估计的稀疏表示跟踪算法。目前已有的基于稀疏表示表观模型的跟踪算法,多数采用稀疏表示系数作为目标的表示模型,并且构建的观测模型也只采用表示系数作为各个候选粒子的评估,忽略了表示残差所包含的信息,因此,本文将目标的残差矩阵列向量化为残差向量,并引入稀疏表示模型中,构建了包含残差向量的稀疏表示模型,该模型首先利用L1范数分别约束目标利用字典表示的系数和相应的残差向量,利用L2范数约束表示重构与目标之间的距离。其次为了求解各个候选粒子表示模型中的表示系数与相应的表示残差向量,本文采用一种循环迭代的方法,该方法分别固定两个待求解变量中的一个去求解另一个,从而可以有效求解表示系数与表示残差向量的近似最优解。然后本文利用所求的表示系数与表示残差向量构建各个粒子的观测模型,根据模型评分从候选粒子中选择当前时刻的目标。最后,为了使得算法具有持久稳定的跟踪效果,本文将字典模板与选定目标之间的距离作为模板评分依据,并根据模板的评分分成叁种情况选择性的更新字典。实验结果表明,本文提出的基于残差矩阵估计的稀疏表示跟踪算法相比于多个主流算法具有更好的鲁棒性。2)提出一种改进的残差矩阵估计的稀疏表示跟踪算法。基于残差矩阵估计的稀疏表示跟踪算法对于遮挡问题的鲁棒性较低,因此对于某些出现严重遮挡问题的场景不适用,因此,本文在残差矩阵估计的稀疏表示跟踪算法的基础上,对算法的表示模型与观测模型进行改进,使得算法对于遮挡问题的处理能力获得提升。首先,本文仍然采用残差矩阵估计稀疏跟踪算法的优化模型求解各个候选粒子的表示系数与相应的残差向量,当求得每个粒子的残差向量后,本文利用前一帧选定目标的残差向量对当前帧中各个粒子的表示残差向量进行筛选,使得前后帧之间的残差向量在非零元素位置上具有一致性。其次,本文采用各个候选粒子的重构误差与连续两帧之间的表示残差向量间的距离值作为粒子观测模型的构建依据,然后依据模型的评分选出当前时刻的跟踪结果。在字典更新部分,本文采用字典模板中各个模板用于表示所有候选粒子的被使用次数作为评分因素之一,并结合残差矩阵稀疏表示跟踪算法中的字典模板与选定目标间的距离构建各个字典模板最终的评分公式,然后根据评分排序顺序采用四种不同的情况对字典进行更新。实验结果表明,本文提出的改进算法相对于原残差矩阵估计算法对于遮挡问题的处理能力有所提升,并且本文算法与多个主流算法相比,具有更好的鲁棒性。3)提出一种基于PCA子空间的稀疏表示跟踪算法。子空间跟踪算法对于光照、目标姿态等变化鲁棒性较高,然而对遮挡等问题较为敏感。而稀疏表示对于遮挡问题的鲁棒性较高,因此,本文提出一种基于PCA子空间的稀疏表示跟踪算法。首先,该算法在PCA子空间内学习目标的空间表示基向量,并利用空间基向量、空间均值以及表示残差向量构建目标的表示模型,利用L1范数分别约束表示残差向量以及目标相对于空间基向量的表示系数,利用L2范数约束表示重构与目标之间的误差。其次,为了求解表示系数与表示残差向量,该算法采用循环迭代的方法,将复杂的表示模型分解成两步求解,分别为固定表示系数求解表示残差向量与固定表残差向量求解系数,通过这种方式可以有效求解表示系数与表示残差向量的近似最优解。然后在粒子评估步骤,该算法利用各个粒子的重构误差以及相应表示残差向量的L1范数函数值作为粒子评分依据,构建了各个粒子的观测模型。最后,为了保证字典对于目标的自适应,本章算法依据表示残差向量非零元素与预先设定阈值的比较结果确定多种更新情况,从而在跟踪过程中灵活的搜集用于学习子空间正交基的目标数据。待收集一定跟踪帧数的目标数据就通过增量主成分分析的方法学习目标新的子空间基向量与空间均值。实验结果表明,本文算法能够适应跟踪过程中的光照、遮挡、姿态变化以及背景混杂等问题,相比于多个对比算法,本文算法具有更好的鲁棒性。
王宝石[9]2016年在《黑曲霉发酵生产柠檬酸的关键节点解析及对策》文中认为柠檬酸(2-羟基丙烷-1,2,3-叁羧酸,citric acid)来源于叁羧酸循环的中间代谢,是一种非常重要的平台化合物,也是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸。黑曲霉发酵淀粉质原料合成柠檬酸是当前的主要生产方式。尽管已成为发酵工业中最重要的大宗发酵产品之一,柠檬酸在其生产过程中仍存在着淀粉质原料液化缺乏科学评价标准、种子培养过程繁琐且不稳定、原料利用不完全及发酵模式能效低等在发酵工业中非常具有代表性的问题。本论文通过解析黑曲霉糖化酶催化效率-糊精分子量之间的关系,建立了基于糊精分子量特征的淀粉质原料液化效果评价方法;依据黑曲霉生理学特性及形态学特征,研究超声预处理孢子及菌丝球分散技术,从而构建了种子循环培养工艺;集成分割发酵技术与菌丝球分散技术策略,建立了分割循环发酵工艺;运用阶段添加糖化酶的手段,保障了葡萄糖供应与消耗速率的匹配,实现了柠檬酸产量及原料利用率的提升。主要研究结果如下:(1)建立了基于糊精分子量特征评价淀粉质原料液化的方法。采用乙醇分级沉淀方法制备分子量分布集中的糊精样品;发酵菌种黑曲霉培养液经分离纯化,获得了电泳纯糖化酶的叁个同工酶(Glucoamylase,GM),其中GM I,GM II,GM III亚基分子量分别为30 kDa,50 kDa,100 kDa。基于黑曲霉糖化酶催化与糊精分子量构效关系,建立了基于糊精分子量特征评价淀粉质原料液化水平的方法。液化糊精组分Mw为1.9 kDa时,Km值最小即糖化酶与糊精亲和力最高,液化组分Mw集中在1.4~1.9 kDa范围内,有助于提升后期糖化效率。进一步地,精细化调控了淀粉质原料液化组分,与基于DE值的传统液化评价效果相比,液化糊精更易被糖化酶作用;液化组分用于柠檬酸发酵,柠檬酸合成速率与总糖消耗速率明显改善,发酵周期缩短9 h,残总糖降低10.8%,发酵产率提高21.1%。(2)超声波预处理孢子,促进了孢子水分渗透,加快孢子萌发。依据黑曲霉孢子萌发的生理特性,超声波预处理孢子促进孢子水分渗透,诱导孢子快速萌发,缩短种子培养时间,应用于发酵可使产率提高8.13%。在发酵罐水平上系统研究其整个生命过程中生理学特性及生长动力学参数,发现黑曲霉分泌糖化酶能力能够直观反映种子细胞活力,可以作为移种的特征指标,能有效避免基于种龄的传统移种方式引起发酵菌种活力波动的问题。组合超声波诱导孢子萌发与糖化酶活力表征的移种策略,显着提升了移入发酵的菌种活力,缩短产酸调整期,发酵产率提升11.76%,总发酵时间缩短7.9 h。(3)基于菌丝球分散技术构建了种子循环培养工艺。针对种子传统培养周期长的问题,提出采用菌丝球替代传统孢子接种工艺,有效避免了种子传统培养模式繁琐的问题(批量培养孢子制备超过30 d);在此基础上,采用菌丝球分散技术,突破了种子连续培养中菌丝体结构引起活力下降的瓶颈,构建了种子循环培养工艺,种子循环培养八批次,种子仍然维持较高的活力;循环培养的种子以分散形态接种发酵明显优于菌丝球形态,连续培养八批次,发酵过程稳定,柠檬酸平均产量比菌丝球形态接种提高了26.5%,甚至比初始对照组提高2.5%。(4)集成菌丝球分散技术与分割发酵策略构建了分割循环发酵工艺。分割发酵策略实现菌体生长与柠檬酸合成有效分离,在菌丝球形态的分割循环发酵过程中,菌丝体形态特征限制了菌体生长与柠檬酸积累,通过菌丝球分散技术有效控制分割循环发酵过程中菌丝体形态特征,连续发酵六批次,发酵菌丝球形态稳定,柠檬酸产量由70.3 g·L~(–1)提高至97.0 g·L~(–1),但仍低于对照组;进一步地,在优化的分割发酵条件下(分割比例2/10(v·v–1),限制性氮源供应量15 g·L~(–1),分割时机24 h),分割循环发酵十批次,发酵过程稳定且柠檬酸产量比对照提高了1.26%,总糖消耗量降低10.01%,显着提高了柠檬酸生产效率。(5)阶段添加糖化酶策略,保障了柠檬酸合成期葡萄糖供应速率,改善柠檬酸合成效率。针对发酵残总糖偏高的问题,解析了商品糖化酶与黑曲霉自身分泌的糖化酶pH耐受性,发现商品糖化酶在低pH条件下稳定性更高;提出在发酵开始前预加商品糖化酶糖化2 h(60°C)再进行正常发酵方式,发酵残总糖下降10.4%,生产强度提升了0.11 g·L~(–1)·h~(–1),但发酵初始高浓度葡萄糖抑制细胞生长,发酵中后期糖化酶活力损失严重;进一步地,在发酵过程添加糖化酶,运用阶段添加糖化酶手段,有效补偿了发酵过程中因pH急剧下降导致的酶活力损失,保障葡萄糖供应速率,发酵产率提升13.3%,发酵残糖降低31.3%,简化了后期发酵产物分离与提取工艺。
钟春燕[10]2016年在《菌群及巨噬细胞脂质分解在血脂调节中的作用与机制》文中研究指明研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)是中老年最常见的心血管疾病,其主要病理基础为动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)。随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,AS发病率呈现出逐年升高的趋势。众多流行病学研究显示,血脂代谢紊乱和炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展中起到了重要的作用,尤其是血液中低密度脂蛋白-胆固醇(Low Density LipoproteinCholesterol,LDL-C)的升高已证实为动脉粥样硬化发生发展的独立危险因素。调控血脂水平的机制极其复杂,除了常见的遗传及环境因素外,近几年研究发现,菌群在代谢性心血管疾病中起到了重要作用,干预菌群能够预防、甚至临床治愈代谢性心血管病,但菌群是否通过改变血脂代谢来影响心血管疾病的发生发展目前尚不明确,仍需要进一步研究。体内胆固醇平衡是由叁条主要代谢通路控制,包括自身合成,胆汁粪便排出以及肠道吸收。肠道胆固醇吸收是尼曼匹克C1样蛋白1(Niemann-Pick C1-Like1,NPC1L1)蛋白介导的主动吸收过程,我们的前期研究证实,NPC1L1基因敲除小鼠不仅有肠道胆固醇吸收缺陷,而且粪便量也明显减少。菌群是粪便的重要组成部分,提示肠道菌群可能参与了NPC1L1基因调节体内胆固醇代谢的过程,但具体机制尚不清楚。早期动脉粥样硬化的重要特征是巨噬细胞来源的泡沫细胞在血管内皮下的沉积。泡沫细胞的主要成分是胆固醇酯和甘油叁酯,CGI-58(Comparative gene identification-58)是细胞内脂质分解的激活因子,主要通过激活脂肪甘油叁酯水解酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)的活性促进细胞内脂质分解。我们前期研究发现,CGI-58缺失的巨噬细胞类似泡沫细胞,有大量的甘油叁酯(Triglyceride,TG)和胆固醇酯沉积,并呈现促炎表型,但CGI-58导致的脂质紊乱和炎性改变是否对动脉粥样硬化发生发展产生影响目前尚无定论。考虑到泡沫细胞与炎症反应是动脉粥样硬化发生的病理基础,因此,研究巨噬细胞CGI-58与动脉粥样硬化发生发展的相互关系至关重要。研究目的1.探讨菌群对体内胆固醇代谢平衡调节的影响及其在NPC1L1调节胆固醇吸收中的作用及相关机制,筛选与肠道胆固醇吸收相关的肠道菌群为今后进一步研究打下基础。2.建立巨噬细胞特异性CGI-58敲除的动脉粥样硬化模型,在动脉粥样硬化模型基础上探讨巨噬细胞CGI-58对脂质代谢及炎症反应的影响及作用机制。研究内容与方法1.肠道菌群与小鼠体内胆固醇代谢的相关性及可能的作用机制1.1无菌(Germ-free,GF)小鼠是现阶段研究肠道菌群与疾病相关性的一个必要模型,本研究第一部分动物模型选用无菌小鼠和普通无特殊病原体(Specific pathogen-free,SPF)小鼠,并按照在Western Diet中混合或者未混合胆固醇吸收抑制剂依折麦布(Ezetimibe)作为分组标准随机分为SPF+WD饮食组,SPF+WD饮食+Ezetimibe组,GF+WD饮食组,GF+WD饮食+Ezetimibe组。1.2[14C]-cholesterol和[3H]-Sitosterol的同比例混合溶液被灌胃进入小鼠体内,运用双同位素标记法检测各组小鼠粪便中上述同位素的dpm计数,计算出各组小鼠胆固醇肠道吸收率的改变。将5-Cholestene,β-Coprostanl,α-Cholestanone,Cholesterol等胆固醇及其相关甾醇作为标准品,运用气象色谱检测等方法观察计算各组小鼠粪便中胆固醇相关甾醇排出量的情况。1.3选取多种可靠的检测试剂盒,采用萃取技术、酶学分析、ELISA等方法观察小鼠体内血液及组织中生化学指标及胆固醇、甘油叁酯、胆汁酸代谢的改变。1.4选定相应的引物序列及抗体,运用Q-PCR、免疫印迹等检测方法检测与胆固醇、胆汁酸代谢相关基因m RNA及蛋白的表达,探索菌群的有无及胆固醇吸收抑制剂的参与对胆固醇及胆汁酸代谢可能的作用机制。1.5联合华大基因测序,选用宏基因组检测方法,筛选出可能的与肠道胆固醇吸收相关的肠道菌群菌属。2.探索巨噬细胞脂质分解在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用2.1从条件性巨噬细胞CGI-58敲除和野生小鼠体内分离出腹腔及骨髓巨噬细胞,用动脉粥样硬化危险因子对细胞进行干预,观察这些危险因子对巨噬细胞CGI-58表达的影响及其与CGI-58相互作用对泡沫细胞形成的调控。2.2建立巨噬细胞特异性CGI-58敲除的动脉粥样硬化模型,在西方饮食的作用下,进行体内实验,观察动脉粥样硬化模型下巨噬细胞CGI-58敲除小鼠与未敲除小鼠血液学指标及其在动脉粥样硬化发生发展中的作用。研究结果1.肠道菌群可以通过调节小鼠宿主基因表达水平从而减少体内胆固醇丢失1.1各组小鼠西方饮食和Ezetimibe共同作用后,无菌小鼠较同处理条件的SPF小鼠结肠重量明显增加(P<0.01),但其体重、腹腔脂肪、皮下脂肪却显着减少(P<0.05)。Ezetimibe的使用加速了这种改变。同时发现,Ezetimibe喂养后,SPF小鼠粪便量降低,无菌鼠却无同样改变(P<0.01)。1.2双同位素检测和气象色谱检测结果发现,同样处理条件下,无菌小鼠与SPF小鼠相比较,肠道胆固醇吸收率明显降低(P<0.05),粪便中胆固醇及其细菌代谢产物排出量明显增加(P<0.05)。Ezetimibe在无菌小鼠中抑制胆固醇吸收和促进粪便胆固醇排泄的作用更强。1.3通过对胆汁中的胆固醇、磷脂及胆汁酸的检测发现,GF与SPF小鼠相比较,胆汁中的胆固醇含量降低(P<0.05)。在Ezetimibe处理下,胆汁胆固醇进一步降低,但两组间没有显着变化。1.4运用ELISA和酶学检测方法测量了不同处理小鼠血液及肝脏中的胆固醇、甘油叁酯及磷脂等脂质相关指标,发现GF小鼠血浆内的脂质含量均低于SPF小鼠(P<0.05),相较于SPF小鼠组,ezetimibe处理能够更明显的降低GF小鼠组内的胆固醇及甘油叁酯的含量(P<0.05)。肝脏脂质相关指标研究结果提示,相较于SPF小鼠,GF小鼠肝脏中的游离胆固醇,总胆固醇,胆固醇酯,甘油叁酯以及磷脂含量显着降低(P<0.05)。Ezetimibe处理后能显着降低SPF小鼠和GF小鼠肝脏中的脂质含量,且GF小鼠反应更为明显(P<0.05)。1.5在GF小鼠空肠内,与脂肪生成相关的基因如SREBP-1C,FAS以及SCD-1等表达均较SPF小鼠低(P<0.05)。与胆汁酸激活相关的基因如FXR,OST-β以及FGF-15在GF小鼠肠道内表达明显下调(P<0.05)。另外,与脂蛋白代谢和转运相关的基因,如:HDL受体SR-BI在GF小鼠空肠内较SPF小鼠表达明显增加(P<0.01),ezetimibe的处理进一步降低其表达水平;LDL受体在未用ezetimibe处理时SPF小鼠和GF小鼠小肠内未见明显的m RNA改变,但ezetimibe处理后,其m RNA水平在两组小鼠内表达均增加(P<0.05)。同时,与胆固醇转运及吸收相关的蛋白也有相应改变,ABCA1和NPC1L1的m RNA和蛋白水平在GF小鼠内均降低(P<0.05);ABCG5和ABCG8的m RNA和蛋白水平在GF小鼠内均显着升高(P<0.05)。Ezetimibe处理后除了降低了ABCA1的表达外,上述基因表达均为发生明显改变。1.6与SPF小鼠相比,GF小鼠肝脏中与胆固醇合成的酶,如HMG-Co A,HMGCR,HMGCS以及FPPS的m RNA表达均上调(P<0.05)。Ezetimibe处理进一步升高这些基因在SPF小鼠和GF小鼠中的表达(P<0.05)。GF小鼠中感受细胞内胆固醇水平的核受体LXR的靶基因,如ABCA1,SREBP-1C以及SCD-1与SPF小鼠相比较均表达下调(P<0.05),Ezetimibe处理后GF小鼠上述基因表达下调更明显(P<0.05)。同时,脂蛋白受体基因如SR-BI和LDLR的m RNA及蛋白表达水平在GF小鼠肝脏中明显增加(P<0.05)。另外,在GF小鼠肝脏中,与胆酸代谢的相关基因如FXR m RNA表达下调(P<0.05);CYP7A1和CYP7B1 m RNA表达上调(P<0.05),CYP7A1蛋白表达也明显增加。1.7宏基因组测序结果显示,NPC1L1基因敲除介导的肠道胆固醇吸收抑制在高脂饮食条件下能够显着改变肠道菌群的组成。2.巨噬细胞脂质分解在动脉粥样硬化发生发展中的作用研究2.1 ox-LDL刺激下THP-1细胞中CGI-58蛋白表达明显下调,同时,ox-LDL刺激原代巨噬细胞后,腹腔和骨髓巨噬细胞内CGI-58的表达也明显下降,以腹腔巨噬细胞改变更为明显。对小鼠腹腔巨噬细胞进行荧光染色后发现,空白刺激情况下巨噬细胞CGI-58敲除后较未敲除组脂滴聚集增多,ox-LDL刺激下,未敲除CGI-58的细胞脂滴聚集增加,巨噬细胞CGI-58敲除后,脂滴聚集更为明显。2.2通过条件性基因打靶技术建立了巨噬细胞CGI-58和Apo E敲除小鼠模型,其基因型为Apo E-/-CGI-58f/f/Cre+(DKO)。DKO小鼠与对照鼠相比,体重增加和生育能力正常。通过检测血浆中胆固醇及脂质代谢相关指标,我们发现,西方饮食饲喂6周后,DKO小鼠相较对照组(Apo E-/-CGI-58f/f)小鼠血浆胆固醇和甘油叁酯含量明显增高(P<0.01)。初步结果显示,DKO主动脉斑块数量较对照组有所增加。2.3 DKO相较Apo E-/-和WT小鼠糖耐量降低(P<0.05),胰岛素抵抗明显增加(P<0.05),提示巨噬细胞CGI-58可能也参与了全身血糖代谢调节,但与动脉粥样硬化的关系有待进一步研究。结论1.肠道菌群可能是体内胆固醇平衡调节的重要组成部分。2.肠道菌群可以通过调节相关基因表达,增加肠道胆固醇重吸收,有效的防止体内胆固醇的大量流失。3.厚壁菌门和拟杆菌门细菌的改变可能与NPC1L1调节胆固醇代谢相关。4.动脉粥样硬化危险因子ox-LDL能够降低巨噬细胞内的CGI-58表达,同时巨噬细胞CGI-58可能参与了动脉粥样硬化危险因子刺激的泡沫细胞形成的调控。5.巨噬细胞相关的脂质分解对血脂水平有明显调控作用。
参考文献：
[1]. PD-1/PD-L1通路小分子抑制剂的发现[D]. 刘安. 吉林大学. 2016
[2]. NSCLC患者血浆和肿瘤组织中PD-1、PD-L1的表达水平和临床意义的研究[D]. 贺加贝. 北京市结核病胸部肿瘤研究所. 2016
[3]. 病理组织和外周血中PD-L1和PD-1表达对侵袭性非霍奇金淋巴瘤患者预后影响的实验研究[D]. 宋洋. 北京协和医学院. 2015
[4]. 多端柔性直流输电系统控制策略的研究[D]. 刘一琦. 哈尔滨工业大学. 2016
[5]. 重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究[D]. 侯颖. 江南大学. 2016
[6]. 长链非编码RNA U90926在3T3-L1前脂肪细胞分化中的作用及其机制研究[D]. 陈吉翠. 山东大学. 2017
[7]. 长非编码RNA lnc-MC及RBP-ZFP36L1在单核／巨噬细胞分化中的功能及其机制研究[D]. 陈明台. 北京协和医学院. 2016
[8]. 基于稀疏表示的目标跟踪技术研究[D]. 陈典兵. 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所. 2017
[9]. 黑曲霉发酵生产柠檬酸的关键节点解析及对策[D]. 王宝石. 江南大学. 2016
[10]. 菌群及巨噬细胞脂质分解在血脂调节中的作用与机制[D]. 钟春燕. 第叁军医大学. 2016
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