论文摘要
木质纤维素类生物质资源是地球上最为丰富的可再生资源,在大宗生物基产品的生产中有广阔的应用前景。有效利用生物质资源不仅可以解决人类社会面临的日益严重的能源危机,还可以变废为宝解决由于焚烧秸秆带来的环境污染问题。我国作为农业大国,提高生物质能源在新能源领域的占有率,既符合可持续发展的战略要求,也是生态文明建设的迫切需求。里氏木霉是降解生物质的模式真菌,也是纤维素酶的主要工业生产菌株。近几十年来,人们通过对纤维素酶理化性质的研究,初步解析了里氏木霉纤维素酶系在降解纤维素过程中的协同作用机制,并通过合理优化里氏木霉酶系组成大幅提升了纤维素的水解效率。进一步提高里氏木霉纤维素酶的生产能力,从而降低纤维素酶使用成本是推动生物燃料乙醇及其他大宗生物基化学品工业化生产的前提。近些年的研究表明,里氏木霉纤维素酶基因的表达受到光信号和胞外营养信号的调控,深入解析这些信号通路机制并对其加以有效整合是提高其纤维素酶生产能力的关键。虽然人们已经鉴定到多种参与里氏木霉纤维素酶基因表达的转录调控因子,但这些因子调控纤维素酶基因表达的精确机制目前还不是十分清楚。因此,系统阐述里氏木霉纤维素酶表达调控的分子网络机制,并在此基础上提出有效的菌株遗传改造策略可为实现上述目标提供新的思路。本论文中我们在里氏木霉基因组中鉴定了转录调控复合物Cyc8-Tup1（又名Ssn6-Tup1）,并围绕该复合物在里氏木霉纤维素酶基因表达调控过程中的功能展开研究。主要研究成果如下:1建立了响应外源铜离子的RNAi系统,并利用该系统对里氏木霉多个基因的生理功能进行了表征。通过同源重组介导的基因敲除对靶基因功能进行表征是里氏木霉中通用的遗传操作手段,但实际操作过程中,某些对菌体基本生长或者生孢过程极为重要的基因敲除效率低下甚至不能被敲除。因此,我们实验室开发了一套依赖于可控启动子tcu1的遗传操作系统:响应铜离子的启动子替换系统（copper-responsive promoter replacement system）。在启动子替换系统中,添加铜离子可以抑制靶基因的表达实现基因敲低。在不添加铜离子的情况下可以过表达靶基因。为避免靶基因过表达对菌体遗传操作可能带来的不利影响,我们进一步构建了响应铜离子的RNA干扰（RNA interference,RNAi）系统（copper-controlled RNA interference system）。该体系在不添加外源铜离子时,可以借助内源性的RNAi机制降低靶基因的表达,而在添加铜离子的情况下可以关闭RNAi过程,从而模拟基因回补。这两套系统均依赖于铜离子对tcu1启动子表达能力的严谨控制。为了验证响应铜离子的RNAi系统的有效性,我们对里氏木霉组成型表达的基因pyr4,诱导型表达的基因cel7a和xyr1,以及利用同源重组难以敲除的基因fab1均进行了基因敲低,更重要的是整合该体系的菌株在添加铜离子后相关表型得到显著恢复,进而也可排除因发卡RNA（hairpin RNA,hpRNA）表达盒随机整合进入基因组而带来的负面影响。这充分说明响应铜离子的RNAi系统在表征里氏木霉靶基因功能时的实用性和可行性。2 Cyc8-Tup1复合物与转录激活因子Xyr1以互相依赖的方式介导里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达。蛋白免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,CoIP）实验表明,里氏木霉Cyc8和Tup1在体内可以形成稳定存在的复合物。我们采用响应铜离子的启动子替换系统和RNAi系统分别对里氏木霉tup1和cyc8基因进行基因敲低。结果发现,Cyc8或Tup1的表达下调严重影响了里氏木霉纤维素酶基因的诱导表达,这与Cyc8-Tup1复合物大多参与基因转录抑制截然相反,从而暗示里氏木霉Cyc8-Tup1复合物可能在纤维素酶基因表达过程中发挥重要的激活功能。另外该复合物在里氏木霉分生孢子形成过程中也发挥了至关重要的作用。染色体免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验表明,Cyc8-Tup1 可以被募集到纤维素酶基因启动子上,从而直接调控纤维素酶基因的转录,并且该复合物在启动子上的募集依赖于转录激活因子Xyr1（xylanase regulator 1）。此外,cyc8和tup1基因敲低也会导致诱导条件下纤维素酶基因启动子区核小体解聚受阻,从而可能抑制转录起始复合物PIC（Preinitiation complex）的组装形成。过表达Xyr1并不能恢复cyc8或者tup1敲低菌株纤维素酶表达能力低下的表型,且Xyr1在纤维素酶基因启动上的结合也依赖于Cyc8-Tup1的存在。而同时过表达Xyr1和Tup1后可以大幅度提高纤维素酶的产量,进一步说明了 Xyr1和Tup1之间存在协同调控机制。综上可以说明,Cyc8-Tup1复合物与转录因子Xyr1以互相依赖的方式介导里氏木霉纤维素酶基因的表达。3 Tup1是一个全局性的调控因子,在里氏木霉中敲低tup1不能解除碳代谢阻遏。我们采用RNA-Seq方法对里氏木霉基因组（10239个基因）中Tup1的调控靶点进行了全面的分析。总体来看,在葡萄糖条件下Tup1抑制里氏木霉基因组中2207（占整个基因组基因的21.6%）个基因,激活1641（16%）个基因。在纤维素诱导条件下,Tup1抑制里氏木霉基因组中1988（19.4%）个基因,激活1961（19.2%）个基因,这说明Tup1是一个全局性的调控因子。但与酿酒酵母中Tup1介导特定诱导型基因（如蔗糖酶）的碳代谢阻遏（carbon catabolite repression,CCR）过程不一样,里氏木霉中tup1的敲低并没有导致葡萄糖条件下大多（半）纤维素酶基因的大幅上调。这表明里氏木霉中Tup1与碳代谢阻遏无关或者除Tup1外仍有其他调控机制参与了里氏木霉的CCR。与葡萄糖条件下相比,在纤维素诱导条件下里氏木霉基因组中分别有1017个基因上调（Induction-up）和1993个基因下调（Induction-down）,而tup1的敲低会导致诱导上调基因集中的408个基因下调（占Induction-up基因集的40%）和诱导下调基因集中的461（占Induction-down基因集的23%）的基因上调。这些诱导基因集中（包括Induction-up和Induction-down）,约50%受Tup1调控的基因同时也会受到Xyr1的调控,而这其中包含了大部分与生物质降解相关的纤维素酶和半纤维素酶。由此可知在诱导条件下,Tup1与转录激活因子Xyr1的调控模式有一定程度的重叠。4在里氏木霉中鉴定了酿酒酵母Cti6的类似蛋白Clp1,证明了Clp1参与里氏木霉纤维素酶基因的表达调控和分生孢子形成。在酿酒酵母中,Cti6（Cyc8-Tup1 interacting protein 6）是一个包含PHD（plant homeodomain）结构域且能够与Cyc8发生直接相互作用的蛋白。我们通过生物信息学分析可知里氏木霉中有一个类Cti6蛋白Tr 27020,但它们之间的序列一致性较低,因此将其命名为Clp1（Cti6 like protein 1）。Clp1含有两个保守的结构域PHD和UIM（ubiquitin interacting motif）,但是酿酒酵母Cti6只包含PHD结构域。敲除clp1后,里氏木霉分生孢子形成和纤维素酶基因的表达均严重受阻。在△clp1菌株中过表达Xyr1后可以在很大程度上拯救纤维素酶的表达,表达水平甚至高于对照菌株,说明Xyr1的过表达可以绕过Clp1而激活纤维素酶基因的表达。细胞定位分析表明,Clp1是一个细胞核蛋白,且其PHD和UIM结构域缺失均不影响Clp1的核定位,但是PHD突变会导致Clp1在细胞核内的定位形态异常。与UIM缺失不同,PHD突变株纤维素酶的表达能力和分生孢子形成能力均显著降低。这说明PHD结构域在Clp1参与纤维素酶基因表达和分生孢子形成过程中起到了至关重要的作用。ChIP实验表明Clp1也可以被募集到纤维素酶基因启动子上调控转录,并且这种募集是依赖于纤维素诱导条件的。5鉴定了调控xyr1表达的转录因子Rxe1,并证明Rxe1参与里氏木霉纤维素酶的表达和分生孢子形成过程。Cyc8-Tup1是真核生物中高度保守的基因转录调控复合物。研究表明该复合物参与多种细胞生理学过程。因此我们推测里氏木霉Cyc8-Tup1复合物除被募集到纤维素酶基因启动子上直接调控纤维素酶基因的转录外,也可能会通过其他途径参与纤维素酶基因的表达。我们通过比较分析野生型和tup1敲低菌株的RNA-Seq数据得知,里氏木霉C2H2类型转录因子Tr108357在纤维素条件下的表达水平要远高于葡萄糖条件下的表达水平,且tup1敲低导致其在诱导条件下的表达水平显著下调。此外,我们在前期工作中,通过酵母单杂交实验发现该转录因子可以结合xyr1的启动子,遂将其命名为Rxel（Regulator 1 of xyr1 expression）。为了表征rxe1在里氏木霉中的生理功能,我们反复多次敲除rxe1基因却没有成功,因此我们使用响应铜离子的RNAi系统对rxe1基因进行了条件性敲低。结果表明,Rxe1敲低严重降低了xyr 和纤维素酶基因的表达,且基本消除了里氏木霉分生孢子的形成。在rxe1基因敲低菌株中进行Xyr1的组成型表达,纤维素酶基因的诱导表达可得以恢复至甚至超过对照菌株的产酶水平,但是Xyr1组成型表达不能恢复rxe1敲低菌孢子形成缺陷的表型。以上结果说明Rxe1可能通过调控xyr1的表达而进一步控制纤维素酶基因的表达。综上,我们在里氏木霉中鉴定了一个新的调控因子Rxe1,该转录因子不仅可以调控xyr1和纤维素酶基因的表达,而且还可以控制里氏木霉孢子形成过程。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 王磊
导师: 刘巍峰
关键词: 里氏木霉,纤维素酶
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅱ辑
专业: 生物学,新能源
单位: 山东大学
分类号: TK6;Q78
总页数: 188
文件大小: 15153K
下载量: 240
相关论文文献
- [1].澳新拟批准两种来自转基因里氏木霉的酶制剂作为加工助剂[J]. 食品与生物技术学报 2020(04)
- [2].利用重组里氏木霉高效降解秸秆的研究[J]. 高校化学工程学报 2018(06)
- [3].重组里氏木霉产漆酶及其对染料金橙Ⅱ的脱色[J]. 浙江大学学报(工学版) 2014(10)
- [4].里氏木霉发酵培养基的响应面法优化[J]. 湖北农业科学 2018(24)
- [5].多靶向沉默里氏木霉碳代谢阻遏物对纤维素酶活性和表达的调控研究[J]. 微生物学报 2019(04)
- [6].重组里氏木霉产漆酶及其在含活性艳蓝KN-R印染废水脱色中的应用[J]. 高校化学工程学报 2018(03)
- [7].小分子海洋抗菌肽鲎素Ⅰ里氏木霉表达系统构建[J]. 江苏农业科学 2018(14)
- [8].高产纤维素酶里氏木霉菌株诱变选育及其发酵条件优化[J]. 饲料博览 2019(06)
- [9].澳新拟批准来自里氏木霉转基因菌株的木聚糖酶作为加工助剂[J]. 食品与机械 2019(01)
- [10].不同碳源条件下里氏木霉的分泌蛋白比较分析[J]. 生物化工 2018(05)
- [11].响应面对里氏木霉产纤维素酶液体发酵条件的优化[J]. 湖北农业科学 2015(15)
- [12].响应面法优化油茶粕培养里氏木霉酶系活力条件及发酵工艺研究[J]. 中国粮油学报 2018(10)
- [13].欧盟评估来自一种转基因里氏木霉的α-淀粉酶的安全性[J]. 食品与机械 2019(01)
- [14].白腐真菌粗酶液对里氏木霉发酵玉米秸秆的影响[J]. 食品科技 2019(02)
- [15].全基因组预测里氏木霉QM6a的碳水化合物活性酶类蛋白[J]. 西南农业学报 2018(04)
- [16].利用RNAi抑制cre1基因转录提高里氏木霉表达纤维素酶[J]. 食品工业科技 2016(11)
- [17].重组里氏木霉液体深层发酵产中性内切-β-葡聚糖酶[J]. 高校化学工程学报 2014(02)
- [18].里氏木霉几丁质酶表达及其水解产物组成与结构分析[J]. 中国生物工程杂志 2018(10)
- [19].里氏木霉β-葡萄糖苷酶的研究进展[J]. 海峡药学 2012(11)
- [20].里氏木霉β-葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究[J]. 中国粮油学报 2009(03)
- [21].里氏木霉利用玉米秸秆形成类胡敏酸（HAL）的特异性研究[J]. 农业环境科学学报 2019(09)
- [22].欧盟批准两种里氏木霉产酶作为猪饲料添加剂[J]. 粮食与饲料工业 2016(07)
- [23].里氏木霉RutC-30产纤维素酶条件优化研究[J]. 安徽农业科学 2012(08)
- [24].里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展[J]. 生物技术通报 2011(05)
- [25].里氏木霉Rut—30产纤维素酶发酵条件的优化[J]. 中南林业科技大学学报 2010(09)
- [26].利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a[J]. 江苏农业科学 2018(21)
- [27].农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究[J]. 东北农业大学学报 2011(07)
- [28].里氏木霉Cel5A基因优化及其在毕赤酵母中的高效表达[J]. 生物工程学报 2016(10)
- [29].里氏木霉组成型表达siRNA干扰cre1基因对纤维素酶表达的调控作用[J]. 微生物学杂志 2018(01)
- [30].不同发酵来源的木聚糖酶对芙蓉鲫幼鱼消化酶及部分血液指标的影响[J]. 中国饲料 2016(09)