首页> 正文

香鳞毛蕨MYC2基因的克隆及功能分析

2020-12-08阅读(236)

香鳞毛蕨MYC2基因的克隆及功能分析

论文摘要

香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans（L.）Schott]是生长在高寒地区的一种鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物,在民间,用香鳞毛蕨叶片来治疗皮肤病已具有几十年的历史,香鳞毛蕨作为一种野生药用资源植物,具有重要的应用前景。近年来研究表明,香鳞毛蕨中具有酚类、萜类等多种化合物。本实验室前期的工作已经证明,香鳞毛蕨的萜类代谢产物具有抑菌和抗肿瘤等功效。但目前关于蕨类植物的萜类代谢途径还未见报道。因此,对香鳞毛蕨及其萜类代谢通路的研究具有重大意义。植物中萜类物质的生物合成在很大程度上受到昆虫或微生物诱导。生产实践中,经常采用外源施加茉莉酸类物质,来模拟昆虫与真菌病害以诱导植物的间接防御反应来研究萜类代谢产物的积累。MYC2是植物响应茉莉酸类代谢通路中重要的转录因子,在调控植物体积累萜类物质等次生代谢产物和诱导植物防御反应中具有重要的作用。因此,本研究以茉莉酸类激素JAs作为外源激素处理香鳞毛蕨叶片,调控香鳞毛蕨MYC2转录因子的表达,并通过香鳞毛蕨MYC2在拟南芥中的异源表达来探究香鳞毛蕨萜类代谢途径。本文主要的试验结果如下:1.从试验室之前获得的香鳞毛蕨全株系转录组数据库中找到注释为MYC2基因的片段。从4个基因片段中筛选出一个作为香鳞毛蕨MYC2基因的核心片段。基于核心片段序列,通过RACE技术,克隆获得基因全长3130bp,开放阅读框2496bp,将其命名为DfMYC2,在NCBI上的基因登录号为MK193871。2.选取香鳞毛蕨根、根状茎、叶柄及叶片对DfMYC2基因进行表达量分析,结果显示其在叶片中表达量最高,叶柄表达量其次,在根和根状茎中表达量最低。之后选用MeJA对香鳞毛蕨进行外源处理,结果显示,香鳞毛蕨MYC2基因在MeJA处理后随时间变化表达量先升高后降低。3.运用生物信息学技术分析并预测香鳞毛蕨MYC2蛋白的一级结构、二级结构、三级结构等信息。结果发现香鳞毛蕨MYC2蛋白编码831个氨基酸,包含三种二级结构类型,存在信号肽,属于分泌型蛋白,不存在卷曲结构和信号肽。4.构建植物表达载体对拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型植株（哥伦比亚生态型Col-0）进行遗传转化,获得DfMYC2基因过表达植株,观察其表型,发现过表达植株要比同期的野生型植株生长更茂盛,说明DfMYC2基因表达能够促进拟南芥植株的生长;过表达植株叶柄上的表皮毛数量明显多于野生型植株,且在过表达拟南芥植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表达量升高,证明DfMYC2基因在拟南芥中同样能够促进倍半萜合酶基因的表达。5.通过CRISPR/Cas9技术获得拟南芥AtMYC2基因缺失型植株,对其进行筛选并观察表型。结果显示AtMYC2基因缺失型植株要比同期的野生型拟南芥生长更慢且叶柄上的表皮毛数量明显减少,且缺失型植株中倍半萜合酶基因TPS11和TPS21表达量明显降低,说明AtMYC2基因不仅影响拟南芥植株生长和表皮毛发育,还影响倍半萜合酶基因的表达。6.将DfMYC2基因转入到AtMYC2缺失型纯合体,获得DfMYC2互补AtMYC2缺失型拟南芥。结果发现,互补型植株TPS11和TPS21基因表达量比缺失型植株略有升高,但比野生型低,植株大小和表皮毛数量与野生型植株没有明显差异,说明DfMYC2基因和AtMYC2基因在植物生长、表皮毛发育和影响倍半萜代谢积累的相关功能上有相似之处。7.将DfMYC2基因转入到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中进行亚细胞定位分析,结果发现DfMYC2基因主要在细胞核中表达。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 引言
  •   1.1 香鳞毛蕨研究进展
  •     1.1.1 香鳞毛蕨植物形态与生境特殊性
  •     1.1.2 香鳞毛蕨的化学成分研究
  •     1.1.3 香鳞毛蕨的药用价值
  •   1.2 转录因子MYC2 研究进展
  •     1.2.1 转录因子简介
  •     1.2.2 转录因子MYC2 的表达调控
  •     1.2.3 转录因子MYC2 与萜类代谢
  •   1.3 植物萜类化合物研究进展
  •     1.3.1 萜类化合物简介
  •     1.3.2 植物萜类代谢过程
  •     1.3.3 香鳞毛蕨萜类化合物研究进展
  •   1.4 本研究目的意义及技术路线
  •     1.4.1 研究目的意义
  •     1.4.2 技术路线
  • 2 材料与方法
  •   2.1 试验材料
  •   2.2 主要试剂与仪器
  •   2.3 香鳞毛蕨MYC2 基因的克隆
  •     2.3.1 总RNA的提取
  •     2.3.2 cDNA的合成
  •     2.3.3 香鳞毛蕨MYC2 基因核心片段的获得
  •     2.3.4 香鳞毛蕨MYC2 基因cDNA5'端片段的获得（5'-RACE）
  •     2.3.5 香鳞毛蕨MYC2 基因cDNA3'端片段的获得（3'-RACE）
  •     2.3.6 香鳞毛蕨MYC2 基因全长的获得
  •     2.3.7 DfMYC2 基因开放阅读框架（ORF）的克隆
  •   2.4 DfMYC2 基因的生物信息学分析
  •   2.5 DfMYC2 基因的特异性表达
  •     2.5.1 香鳞毛蕨不同部位材料的制备
  •     2.5.2 香鳞毛蕨MeJA处理材料的制备
  •     2.5.3 香鳞毛蕨MYC2 基因实时荧光定量PCR分析
  •   2.6 DfMYC2 基因的异源表达及功能分析
  •     2.6.1 DfMYC2 基因植物表达载体的构建
  •     2.6.2 DfMYC2 基因的遗传转化
  •     2.6.3 转基因拟南芥的PCR鉴定
  •     2.6.4 DfMYC2 基因过表达植株表型观察
  •   2.7 AtMYC2 基因的敲除
  •     2.7.1 AtMYC2 基因植物表达载体的构建
  •     2.7.2 AtMYC2 缺失型植株的获得
  •     2.7.3 AtMYC2 缺失型植株的PCR鉴定
  •     2.7.4 AtMYC2 缺失型植株的表型观察
  •   2.8 DfMYC2 基因对AtMYC2 缺失型植株的转化
  •   2.9 倍半萜合酶基因TPS11和TPS21 片段获得
  •   2.10 DfMYC2 基因的亚细胞定位
  • 3 结果与分析
  •   3.1 香鳞毛蕨MYC2 基因的筛选、克隆及生物信息学分析
  •     3.1.1 总RNA的提取
  •     3.1.2 香鳞毛蕨MYC2 基因5'端和3'端片段的克隆（5'、3'RACE）
  •     3.1.3 香鳞毛蕨MYC2 基因全长的获得
  •     3.1.4 DfMYC2 基因开放阅读框架的克隆
  •     3.1.5 DfMYC2 基因cDNA序列同源性分析
  •     3.1.6 DfMYC2 基因的蛋白序列分析及同源模建
  •   3.2 DfMYC2 基因实时荧光定量PCR分析
  •     3.2.1 DfMYC2 基因的相对表达
  •   3.3 DfMYC2 过表达型拟南芥的构建
  •     3.3.1 表达载体和目的基因的双酶切、连接及验证
  •     3.3.2 DfMYC2 过表达纯合体拟南芥的获得
  •     3.3.3 转基因拟南芥的PCR鉴定
  •   3.4 AtMYC2 缺失型拟南芥的获得与鉴定
  •   3.5 DfMYC2 互补AtMYC2 缺失型拟南芥的获得与鉴定
  •   3.6 不同类型拟南芥表型观察
  •   3.7 4种类型拟南芥TPS11和TPS21 基因相对表达量比较
  •   3.8 DfMYC2 亚细胞定位
  • 4 讨论
  •   4.1 香鳞毛蕨转录因子MYC2 的选择
  •   4.2 DfMYC2 基因的表达分析
  •   4.3 DfMYC2 基因的生物信息学分析及亚细胞定位
  •   4.4 DfMYC2 基因与AtMYC2 基因的相关性
  • 5 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的学术论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵宗宝

    导师: 常缨

    关键词: 香鳞毛蕨,表达分析

    来源: 东北农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 东北农业大学

    分类号: Q943.2;S567.239

    总页数: 71

    文件大小: 4408K

    下载量: 137

    相关论文文献

    • [1].香鳞毛蕨有效部位乳膏对犬小孢子菌的影响[J]. 中成药 2020(05)
    • [2].香鳞毛蕨叶片光合作用日变化特征[J]. 北方园艺 2018(15)
    • [3].香鳞毛蕨有效部位的止痒和抗过敏作用[J]. 中成药 2016(11)
    • [4].五大连池香鳞毛蕨矿泉浴片的制备工艺研究[J]. 黑龙江科学 2015(04)
    • [5].香鳞毛蕨研究进展[J]. 安徽农业科学 2014(04)
    • [6].香鳞毛蕨抑菌特性比较研究[J]. 东北农业大学学报 2012(03)
    • [7].疏羽香鳞毛蕨配子体发育的研究[J]. 东北农业大学学报 2009(10)
    • [8].香鳞毛蕨化学成分及其体外抗浅部真菌活性研究[J]. 天然产物研究与开发 2019(10)
    • [9].基于转录组分析香鳞毛蕨乙醇提取物抑制红色毛癣菌的机制研究[J]. 广东药科大学学报 2019(02)
    • [10].香鳞毛蕨有效部位乳膏对糠秕马拉色菌所致豚鼠感染模型的影响[J]. 中国实验方剂学杂志 2017(04)
    • [11].香鳞毛蕨DfMYC2基因的克隆及表达分析[J]. 华中农业大学学报 2019(04)
    • [12].香鳞毛蕨苷提取物E对人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响[J]. 现代生物医学进展 2019(12)
    • [13].一测多评法测定香鳞毛蕨有效部位中10种间苯三酚类成分[J]. 中草药 2019(08)
    • [14].高效液相色谱法测定香鳞毛蕨中芸香苷及槲皮素含量的研究[J]. 北方园艺 2013(04)
    • [15].香鳞毛蕨对脂多糖诱导的人真皮微血管内皮细胞增殖及mRNA表达的影响[J]. 医学研究杂志 2017(12)
    • [16].香鳞毛蕨提取物对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损的影响[J]. 中国中医药信息杂志 2017(05)
    • [17].香鳞毛蕨国内外研究进展[J]. 北方园艺 2009(04)
    • [18].香鳞毛蕨化学成分及其治疗皮肤病药理作用的研究进展[J]. 时珍国医国药 2013(01)
    • [19].香鳞毛蕨有效部位及药理作用的研究进展[J]. 今日药学 2009(10)
    • [20].香鳞毛蕨提取工艺的正交优化设计[J]. 北方园艺 2011(04)
    • [21].香鳞毛蕨有效部位体外抗犬小孢子菌作用及其机制研究[J]. 广东药科大学学报 2018(06)
    • [22].香鳞毛蕨治疗48例难治性手足癣的疗效观察[J]. 现代药物与临床 2013(01)
    • [23].香鳞毛蕨镇痛作用研究[J]. 齐齐哈尔医学院学报 2008(20)
    • [24].药用植物香鳞毛蕨群落生态位特征分析[J]. 东北农业大学学报 2013(07)
    • [25].香鳞毛蕨种质资源遗传多样性的AFLP分析[J]. 中草药 2010(06)
    • [26].香鳞毛蕨化学成分研究[J]. 中药材 2009(08)
    • [27].香鳞毛蕨的化学成分及药理作用研究进展[J]. 中国药房 2017(10)
    • [28].香鳞毛蕨提取液对镰孢菌抑菌活性的研究[J]. 中国马铃薯 2017(01)
    • [29].香鳞毛蕨18S rRNA基因片段的克隆与序列分析[J]. 时珍国医国药 2016(10)
    • [30].香鳞毛蕨有效部位对红色毛癣菌体外抗真菌的作用[J]. 广东药学院学报 2016(01)

    标签：;  ;  

    香鳞毛蕨MYC2基因的克隆及功能分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6