导读:本文包含了酵母双杂合体系论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,酵母,病毒,体系,乙型肝炎,肝炎,酵母菌。
酵母双杂合体系论文文献综述
李丹,王小众,陈治新,黄月红,于皆平[1]（2004）在《酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白》一文中研究指出背景与目的:乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)X蛋白是一个广义反式作用因子,同原发性肝癌的发生发展密切相关,由于其功能同蛋白-蛋白间相互作用有关,故本研究利用酵母双杂合体系筛选并鉴定HBVX蛋白结合蛋白。方法:聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)法扩增HBVX基因序列,酵母双杂合体系3构建饵质粒pAS2-1-X,进行序列测定后转化入酵母菌AH109,以Westernblot法验证X-BD融合蛋白在酵母细胞中的正确表达。pAS2-1-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、β-半乳糖苷酶活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,检索其同源序列。结果:成功构建了pAS2-1-X饵质粒,Westernblot证实转化的酵母细胞能正确表达X-BD融合蛋白,pAS2-1-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,β-半乳糖苷酶活性测定、分离实验及交合实验后筛选出1个阳性克隆,其cDNA插入片段与Fis基因高度同源。结论:通过酵母双杂合体系筛选出一个在酵母细胞内能与X蛋白结合的Fis蛋白。(本文来源于《癌症》期刊2004年05期）
郭大玮[2]（2004）在《自体乙酰化诱饵蛋白酵母双杂合筛选体系的建立》一文中研究指出以DNA为模板的细胞核活动如：转录、复制、重组和修复都发生于染色体中。 而染色体结构与核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4密切相关。染色体的基本单位─核小体由两个分子的H2A、H2B、H3、H4与其外围缠绕的约150bpDNA片段组成。核小体的形成还需要组蛋白－组蛋白之间，组蛋白－DNA之间的结合反应，这些反应主要发生于核心组蛋白中心结构域，即：组蛋白折迭区域。所有核心组蛋白N’末端为“活动尾”，这些“活动尾”突出于核小体之外而无固定构像。同时敲除酵母细胞组蛋白H3和H4基因或H2A和H2B基因将导致细胞死于G2/M期。许多翻译后的修饰可以发生在组蛋白尾，这些修饰包括：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛蛋白化等。组蛋白呈高度碱性，上述修饰可改变组蛋白的荷电情况；这样会对紧凑型结构的染色体产生较大影响。通常，呈紧凑型结构的染色体不易与蛋白因子结合并阻止蛋白因子与DNA的后续反应。乙酰化后的组蛋白尾与基因组DNA反应的Km值远远高于非乙酰化组蛋白尾。亦即：乙酰化组蛋白与DNA反应减弱，从而有利于蛋白因子与DNA结合,寻找到相对应的DNA元件。通常，高水平乙酰化组蛋白有利于转录激活，低水平乙酰化组蛋白导致转录抑制／沉默。已知乙酰化组蛋白可以结合蛋白中高度保守序列─bromodomain,含bromodomain的蛋白大都为转录激活蛋白因子。甲基化组蛋白可以结合chromodomain,这一结构域常见于转录抑制蛋白因子中。除乙酰化外，其它组蛋白修饰如：磷酸化、甲基化和泛酸化也与特异性基因转录调节有关。此外，不同的组蛋白修饰之间相互作用,如:组蛋白H3S10磷酸化可以促进H4K14的乙酰化,H4R3甲基化可增强H4K8乙酰化等。上述证据倾向于支持这种观点：每种组蛋白修饰可以被其它蛋白或蛋白结构域所解读，从而引发不同的生物学过程。2000年, David Allis 首次提出了”组蛋白密码”假说，该假说认为不同形式修饰的组蛋白可以作为特定的信号被蛋白因子识别，这些蛋白因子在包含相应组蛋白修饰的基因组区域实施其功能。到目前为止，所有与修饰后组蛋白结合的蛋白鉴定仅限于生物化学方<WP=8>法，而在基因组范围内的筛选工作还很少，有报道在细胞内表达异源性的蛋白激酶，用双杂合试验进行翻译后修饰特异性结合蛋白的筛选。如：在酵母中表达酪氨酸激酶或在大肠杆菌中表达哺乳动物丝氨酸／苏氨酸激酶，以使底物磷酸化后再用双杂合试验来进行筛选。由于磷酸化过程依赖于传统的酶－底物反应（反式作用），如果外源性的酶难以从宿主细胞中众多的蛋白中识别特异蛋白底物则接下来的筛选可能失败。因此，为提高底物磷酸化的效率，增加“诱饵”蛋白的特异性就必须过量表达激酶，而这样可使宿主细胞中蛋白被不当修饰导致细胞生长停滞。为使细胞内酵母双杂合试验“诱饵”蛋白能特异地、持续修饰，我们将Gcn5 HAT结构域和组蛋白H3尾相连，这样酶与底物的物理性连接可能使“自体催化”现象发生在一个蛋白分子内而产生高效率的乙酰化修饰。我们将组蛋白H3尾（1-59位氨基酸）与Gcn5(18-252位氨基酸)野生型相连,再连接Gal4DNA结合结构域和HA；用无HAT 活性的Gcn5 变异体作为对照。将含有上述融合蛋白ORF的质粒和载体对照分别转入酵母细胞中(PJ69-4α)，用抗HA和抗组蛋白H3K9/K14乙酰化抗体检测酵母全细胞提取液中人工融合蛋白的工作情况。结果显示与Gcn5 野生型相连的组蛋白H3/H4被乙酰化,而与变异体Gcn5 F221A连接的组蛋白H3却无乙酰化。这个现象在其它嵌合蛋白中也得到了印证，如将GST 取代HA,质粒在大肠杆菌中表达，也得到同样结果。重要的是，用抗非乙酰化H3抗体检测在酵母细胞中表达的融合蛋白，与Gcn5野生型相连接的组蛋白H3的信号很弱,表明Gcn5野生型自体催化效率很高。这些结果说明以下问题：1、Gcn5在融合蛋白中,尽管有Gal4 DBD和HA的存在,仍然能够催化其连接的底物。如此，其它HAT也有可能在类似的融合蛋白中起作用。2、Gcn5在融合蛋白中仍具有底物特异性。3、对于Gcn5 HAT催化活性丧失的变异型(F221A)，尽管连接了底物，但仍然不能行使转乙酰基的功能；因此，这一重组体可以用来作为阴性对照以排除与组蛋白乙酰化无关的反应。4、尽管在酵母细胞内有多种HAT,其中至少两种HAT可以乙酰化组蛋白H3；但没有一种HAT可以催化融合蛋白内的组蛋白H3。其中的原因可能是正常情况下细胞内的HAT被转录因子结合到特异的DNA位置，因此内源性<WP=9>的HAT催化融合蛋白中组蛋白H3乙酰化的可能性甚小。5、酵母细胞内至少有5种确定的组蛋白脱乙酰化酶(HDACs)以及数种HDAC同源酶,而本试验的结果表明在上述酶同时存在的情况下,融合蛋白的乙酰化作用占主导地位。总之，对于酵母细胞双杂合筛选试验，融合蛋白GAL4DBD-H3-Gcn5 wt-HA可以作为高特异性、高催化效率的自体催化“诱饵”蛋白；含有Gcn5 野生型的融合蛋白可以用来检测乙酰化结合蛋白，而含有Gcn5F221A的融合蛋白可以筛除与组蛋白乙酰化无关的反应。我们还构建了GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA和GAL4DBD-H4-Gcn5 F221A-HA重组体,试验表明: GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA 融合蛋白有自体乙酰化现象(H4K8)而 GAL4DBD-H4-Gcn5F221A-HA则无。为检测融合蛋白能否用于酵母双杂合?(本文来源于《山西医科大学》期刊2004-05-01）
李丹[3]（2002）在《酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S_1相关蛋白的研究》一文中研究指出目的 利用酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前 S1 (pre S1 )蛋白相关蛋白 ,以利于探讨前 S1 蛋白在乙型肝炎病毒的入胞机制。 方法 以 HBV DNA阳性血清为模板通过PCR法扩增含 Eco R 与 Pst 酶切位点的 pre S1 基因序列 ,p AS2 - 1载体及 pre S1 基因 PCR产物经双酶切并连接 ,转化到大肠杆菌 JM10 5 ,对重组质粒 p AS2 - 1- pre S1 进行序列测定。乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌 AH 10 9,以Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。将p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞 ,通过选择性培养、L ac Z活性测定筛选阳性菌落 ,分离实验及交合实验排除假阳性 ,PCR扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定 ,结果提交 NCBI的 BL AST应用程序 ,在Gene Bank 数据库查询其同源序列。 结果 重组质粒p AS2 - 1- pre S1 经序列测定含有完整的 pre S1 基因片段 ,Western Blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的pre S1 - BD蛋白 ,p AS2 - 1- pre S1 及正常成人肝细胞 c DNA文库共转化酵母细胞后 ,在 5× 10 6 转化子中 ,经选择性培养共长出 97个菌落 ,17个为 L ac Z阳性菌落 ,分离实验及交合试验筛选出 1个阳性菌落 ,PCR扩增产物经 Gen Bank数据库查询与人类初期多肽相关复合体 α(本文来源于《福建医科大学学报》期刊2002年03期）
李丹[4]（2002）在《酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S1相关蛋白的研究》一文中研究指出目的：利用酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S1(preS1)蛋白相关蛋白，以利于探讨前S1蛋白在乙型肝炎病毒的入胞机制。 方法：以HBVDNA阳性血清为模板通过PCR法扩增含EcoRI与PstI酶切位点的pres1基因序列，pAS2-1载体及pres1基因PCR产物经双酶切并连接，转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒pAS2-1-pres1进行序列测定。乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌AH109，以Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。将pAS2-1-pres1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞，通过选择性培养、LacZ活性测定筛选阳性菌落，分离实验及交合实验排除假阳性，PCR扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定，结果提交NCBI的BLAST应用程序，在GeneBank数据库查询其同源序列。 结果：重组质粒pAS2-1-pres1经序列测定含有完整的pres1基因片段，Western Blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的pres1-BD融合蛋白，pAS2-1-pres1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后，在5×10~6转化子中，经选择性培养共长出97个菌落，17个为LacZ阳性菌落，分离实验及交合试验筛选出1个阳性菌落，PCR扩增产物经GenBank数据库查询与人类初期多肽相关复合体a亚单位(Homo sapiensnascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide NACA)同源。 结论：成功构建了 pASZ刁个 真核表达载体，并通过酵母双杂合体系筛选体内与 presl相互作用的蛋白 NACA。(本文来源于《福建医科大学》期刊2002-04-01）
梁庆华,蒋栋,谢尧,高建恩,范涛[5]（2000）在《酵母双杂合体系研究丙型肝炎病毒进入肝细胞的受体》一文中研究指出目的 :用酵母双杂合体系筛选肝细胞cDNA文库 ,寻找与丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus ,HCV)胞膜蛋白 2 (E2 )相作用蛋白的基因 ,探讨HCV与肝细胞的相互作用 ,寻找HCV进入细胞的受体。方法 :以HCVE2蛋白胞外区片段 ,构建酵母双杂合体系中“饵”载体 ,从成人肝细胞cDNA文库筛选与HCVE2相作用蛋白的基因。结果 :筛出的阳性克隆基因序列分析后 ,经GenBank查询 ,与人的apoCⅢ同源 ,同源性为 98%。 结论 :HCVE2蛋白能与人的apoCⅢ在酵母双杂合体系中结合 ,但其相互作用与HCV进入细胞间的关系待进一步研究(本文来源于《北京医科大学学报》期刊2000年06期）
梁庆华,谢尧,蒋栋,陶其敏[6]（2000）在《酵母双杂合体系验证与丙型肝炎病毒E2蛋白相作用的蛋白》一文中研究指出丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)是导致经血液传播非甲非乙型肝炎的主要病原,具有很强的宿主特异性,这有碍ＨＣＶ的体外培养及对病毒生活周期的研究,而其宿主特异性又决定于病毒入胞水平。因此,对ＨＣＶ的入胞机制的研究就尤为关键。ＨＣＶＥ2是ＨＣＶ病毒表面蛋白的主要组成部分(本文来源于《中华医学杂志》期刊2000年11期）
酵母双杂合体系论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
以DNA为模板的细胞核活动如：转录、复制、重组和修复都发生于染色体中。 而染色体结构与核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4密切相关。染色体的基本单位─核小体由两个分子的H2A、H2B、H3、H4与其外围缠绕的约150bpDNA片段组成。核小体的形成还需要组蛋白－组蛋白之间，组蛋白－DNA之间的结合反应，这些反应主要发生于核心组蛋白中心结构域，即：组蛋白折迭区域。所有核心组蛋白N’末端为“活动尾”，这些“活动尾”突出于核小体之外而无固定构像。同时敲除酵母细胞组蛋白H3和H4基因或H2A和H2B基因将导致细胞死于G2/M期。许多翻译后的修饰可以发生在组蛋白尾，这些修饰包括：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛蛋白化等。组蛋白呈高度碱性，上述修饰可改变组蛋白的荷电情况；这样会对紧凑型结构的染色体产生较大影响。通常，呈紧凑型结构的染色体不易与蛋白因子结合并阻止蛋白因子与DNA的后续反应。乙酰化后的组蛋白尾与基因组DNA反应的Km值远远高于非乙酰化组蛋白尾。亦即：乙酰化组蛋白与DNA反应减弱，从而有利于蛋白因子与DNA结合,寻找到相对应的DNA元件。通常，高水平乙酰化组蛋白有利于转录激活，低水平乙酰化组蛋白导致转录抑制／沉默。已知乙酰化组蛋白可以结合蛋白中高度保守序列─bromodomain,含bromodomain的蛋白大都为转录激活蛋白因子。甲基化组蛋白可以结合chromodomain,这一结构域常见于转录抑制蛋白因子中。除乙酰化外，其它组蛋白修饰如：磷酸化、甲基化和泛酸化也与特异性基因转录调节有关。此外，不同的组蛋白修饰之间相互作用,如:组蛋白H3S10磷酸化可以促进H4K14的乙酰化,H4R3甲基化可增强H4K8乙酰化等。上述证据倾向于支持这种观点：每种组蛋白修饰可以被其它蛋白或蛋白结构域所解读，从而引发不同的生物学过程。2000年, David Allis 首次提出了”组蛋白密码”假说，该假说认为不同形式修饰的组蛋白可以作为特定的信号被蛋白因子识别，这些蛋白因子在包含相应组蛋白修饰的基因组区域实施其功能。到目前为止，所有与修饰后组蛋白结合的蛋白鉴定仅限于生物化学方<WP=8>法，而在基因组范围内的筛选工作还很少，有报道在细胞内表达异源性的蛋白激酶，用双杂合试验进行翻译后修饰特异性结合蛋白的筛选。如：在酵母中表达酪氨酸激酶或在大肠杆菌中表达哺乳动物丝氨酸／苏氨酸激酶，以使底物磷酸化后再用双杂合试验来进行筛选。由于磷酸化过程依赖于传统的酶－底物反应（反式作用），如果外源性的酶难以从宿主细胞中众多的蛋白中识别特异蛋白底物则接下来的筛选可能失败。因此，为提高底物磷酸化的效率，增加“诱饵”蛋白的特异性就必须过量表达激酶，而这样可使宿主细胞中蛋白被不当修饰导致细胞生长停滞。为使细胞内酵母双杂合试验“诱饵”蛋白能特异地、持续修饰，我们将Gcn5 HAT结构域和组蛋白H3尾相连，这样酶与底物的物理性连接可能使“自体催化”现象发生在一个蛋白分子内而产生高效率的乙酰化修饰。我们将组蛋白H3尾（1-59位氨基酸）与Gcn5(18-252位氨基酸)野生型相连,再连接Gal4DNA结合结构域和HA；用无HAT 活性的Gcn5 变异体作为对照。将含有上述融合蛋白ORF的质粒和载体对照分别转入酵母细胞中(PJ69-4α)，用抗HA和抗组蛋白H3K9/K14乙酰化抗体检测酵母全细胞提取液中人工融合蛋白的工作情况。结果显示与Gcn5 野生型相连的组蛋白H3/H4被乙酰化,而与变异体Gcn5 F221A连接的组蛋白H3却无乙酰化。这个现象在其它嵌合蛋白中也得到了印证，如将GST 取代HA,质粒在大肠杆菌中表达，也得到同样结果。重要的是，用抗非乙酰化H3抗体检测在酵母细胞中表达的融合蛋白，与Gcn5野生型相连接的组蛋白H3的信号很弱,表明Gcn5野生型自体催化效率很高。这些结果说明以下问题：1、Gcn5在融合蛋白中,尽管有Gal4 DBD和HA的存在,仍然能够催化其连接的底物。如此，其它HAT也有可能在类似的融合蛋白中起作用。2、Gcn5在融合蛋白中仍具有底物特异性。3、对于Gcn5 HAT催化活性丧失的变异型(F221A)，尽管连接了底物，但仍然不能行使转乙酰基的功能；因此，这一重组体可以用来作为阴性对照以排除与组蛋白乙酰化无关的反应。4、尽管在酵母细胞内有多种HAT,其中至少两种HAT可以乙酰化组蛋白H3；但没有一种HAT可以催化融合蛋白内的组蛋白H3。其中的原因可能是正常情况下细胞内的HAT被转录因子结合到特异的DNA位置，因此内源性<WP=9>的HAT催化融合蛋白中组蛋白H3乙酰化的可能性甚小。5、酵母细胞内至少有5种确定的组蛋白脱乙酰化酶(HDACs)以及数种HDAC同源酶,而本试验的结果表明在上述酶同时存在的情况下,融合蛋白的乙酰化作用占主导地位。总之，对于酵母细胞双杂合筛选试验，融合蛋白GAL4DBD-H3-Gcn5 wt-HA可以作为高特异性、高催化效率的自体催化“诱饵”蛋白；含有Gcn5 野生型的融合蛋白可以用来检测乙酰化结合蛋白，而含有Gcn5F221A的融合蛋白可以筛除与组蛋白乙酰化无关的反应。我们还构建了GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA和GAL4DBD-H4-Gcn5 F221A-HA重组体,试验表明: GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA 融合蛋白有自体乙酰化现象(H4K8)而 GAL4DBD-H4-Gcn5F221A-HA则无。为检测融合蛋白能否用于酵母双杂合?
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
酵母双杂合体系论文参考文献
[1].李丹,王小众,陈治新,黄月红,于皆平.酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白[J].癌症.2004
[2].郭大玮.自体乙酰化诱饵蛋白酵母双杂合筛选体系的建立[D].山西医科大学.2004
[3].李丹.酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S_1相关蛋白的研究[J].福建医科大学学报.2002
[4].李丹.酵母双杂合体系筛选乙型肝炎病毒前S1相关蛋白的研究[D].福建医科大学.2002
[5].梁庆华,蒋栋,谢尧,高建恩,范涛.酵母双杂合体系研究丙型肝炎病毒进入肝细胞的受体[J].北京医科大学学报.2000
[6].梁庆华,谢尧,蒋栋,陶其敏.酵母双杂合体系验证与丙型肝炎病毒E2蛋白相作用的蛋白[J].中华医学杂志.2000
论文知识图
