尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）N-糖基化在胚胎滋养层细胞上皮—间充质转化（EMT）过程中的作用

论文摘要

背景与目的:胚胎植入需要三个过程,分别是定位、粘附、侵入到子宫内膜中,滋养层细胞的侵入以及上皮间充质转化（EMT）过程的发生是保证胚胎成功植入的必要条件。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）在胚胎植入过程中发挥重要作用,实验室前期研究表明具有侵入性的滋养层细胞中uPAR表达量升高,可以促进EMT过程的发生。N-糖基化是蛋白质翻译后的一种修饰方式,参与了许多重要的生理及病理过程,其中包括胚胎植入和肿瘤转移等。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPAR）是一种由GPI锚定于细胞膜表面的糖蛋白,含有5个N-糖基化位点,本研究拟探讨uPAR上N-糖基化修饰对于胚胎滋养层细胞EMT过程的影响,为研究胚胎植入提供新的思路。方法:1.利用Real-time PCR和Western blot检测转染uPAR过表达（uPAR-cDNA）及M1、M5突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）后的JAR细胞中uPAR的表达水平。通过Western blot,细胞免疫荧光,Transwell等方法检测uPAR N-糖基化修饰对于JAR细胞EMT的影响。2.利用免疫共沉淀,细胞免疫荧光和明胶酶谱,检测转入uPAR过表达（uPARcDNA）以及突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）后对uPAR与uPA的结合能力的影响。3.利用Western blot,细胞免疫荧光观察转染uPAR过表达（uPAR-cDNA）以及突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）后对其与整合素（integrinβ-1）相互作用能力的影响及其所介导的信号通路的激活情况,利用细胞免疫荧光对转染uPAR过表达（uPAR-cDNA）以及突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）的JAR细胞中对其细胞骨架形成的影响。4.利用细胞免疫荧光以及Western blot对转入uPAR过表达（uPAR-cDNA）以及突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）后的JAR细胞检测uPAR在细胞中的定位。结果:1.将三种质粒（uPAR-cDNA,uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）分别转染入JAR细胞中,通过Western blot、Real-time PCR、免疫荧光等技术检测,结果显示uPARcDNA转染组的E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达量下降,N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）表达量上升,Transwell结果显示,uPAR-cDNA转染组发生迁移及侵袭的细胞数增多。而转染突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）后的两组细胞,其发生迁移侵袭的细胞数明显下降,且与未处理组相比并无明显差异。2.转染uPAR过表达（uPAR-cDNA）以及突变质粒（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）的JAR细胞影响uPAR与uPA的结合能力。通过Western blot,细胞免疫荧光以及明胶酶谱方法检测发现与uPAR-cDNA转染组结合的uPA增多,而转染入突变质粒的JAR细胞,虽然uPAR表达增加,但是与JAR细胞结合的uPA并未增加。3.通过免疫共沉淀结果显示,uPAR-cDNA转染组与integrinβ-1的相互作用较未处理组增强,转入uPAR-MUT1质粒的突变组与integrinβ-1的相互作用与未处理组相比并无明显变化,而转入uPAR-MUT5质粒的突变组与integrinβ-1的相互作用较转入uPAR-MUT1质粒的突变组与integrinβ-1的相互作用明显减弱,细胞免疫荧光结果显示,uPAR-cDNA转染组与integrinβ-1的荧光定位明显增多,且转入5个糖基化位点突变质粒的JAR与转入1个糖基化突变位点质粒的JAR细胞相比,与integrinβ-1的荧光定位明显减少。Western blot结果显示uPAR-cDNA转染组的p-FAK,p-P130Cas,DOCK180以及Rac的表达量较未处理组增加。而uPAR-MUT1,uPAR-MUT5突变组其下游信号分子的表达量与未处理组相比并无明显变化。免疫荧光结果进一步验证了uPAR-cDNA转染组的细胞骨架较未处理组出现了伪足,而uPAR-MUT1,uPAR-MUT5突变组的细胞骨架形态与未处理相比并未出现明显变化。4.细胞免疫荧光结果显示uPAR-cDNA转染组、uPAR-MUT1突变组的uPAR在细胞膜上定位,但uPAR-MUT5突变组的uPAR的定位发生了改变,其定位停留在了胞浆中。分别提取膜蛋白和胞浆蛋白,进行Western blot检测,可以进一步确定uPAR-MUT5突变组的uPAR定位停留在胞浆中。结论:1.uPAR-cDNA促进滋养层细胞EMT的发生,而突变（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）对滋养层细胞EMT行为的影响与未处理组相比并未见显著差异。2.uPAR-cDNA与uPA的结合能力增强,与uPAR-cDNA转染组相比较,uPAR N-糖基化位点的突变（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）减弱其与uPA的结合能力,减少MMP-2,MMP-9的分泌,从而降低滋养层细胞的迁移侵袭能力。3.uPAR-cDNA与integrinβ-1之间的相互作用增强,而uPAR N-糖基化位点的突变（uPAR-MUT1,uPAR-MUT5）与integrinβ-1的相互作用减弱,抑制下游FAK信号通路的激活,进而抑制滋养层细胞的迁移能力。4.uPAR N-糖基化位点的突变影响uPAR在细胞膜上的定位。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙嘉琪

导师: 燕秋

关键词: 糖基化,滋养层细胞

来源: 大连医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 大连医科大学

分类号: R339.22

DOI: 10.26994/d.cnki.gdlyu.2019.000129

总页数: 51

文件大小: 3924K

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