利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼cxxc5a基因敲除品系

论文摘要

目的:CXXC5基因具有广泛表达性及进化保守性,在心脏中高表达,已被证实影响斑马鱼发育早期的心肌细胞增殖和心脏环化。基因编辑技术是一种精准而高效的基因工程方法,它可以通过对特定DNA片段的插入、敲除、修饰或替换等,实现对生物体中目标基因的编辑;CRISPR/Cas9是当今生命科学领域最具有发展前景的基因编辑技术。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了斑马鱼cxxc5a基因的基因敲除品系,以期利用该模型对cxxc5a基因影响心脏早期发育的具体机制进行进一步的探究。方法:首先通过在线分析,获取cxxc5a基因的完整序列和其他相关信息,并利用生物信息学软件在cxxc5a基因二号外显子上设计两个评分较高的打靶位点和打靶鉴定引物,采用“双靶位点敲除”的方式进行基因敲除。（1）打靶载体的构建:分别合成打靶用的gRNA引物和鉴定引物,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收纯化、体外转录等一系列操作,最终获得打靶用的高纯度gRNA和hCas9 mRNA。（2）显微注射:将构建好的高纯度打靶gRNA与hCas9mRNA按照一定的比例混合后,采用显微注射的方法注入野生斑马鱼一细胞期胚胎中。（3）敲除效果的检测与分析:注射后的F0代胚胎培养72 h,随机选取一定数量的胚胎提基因组,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、DNA回收纯化、连接pMD18-T载体、转化、克隆、提质粒、测序、序列比对等一系列工作进行打靶有效性分析。剩余胚胎继续培养4个月至性成熟后,剪取成年F0代斑马鱼尾提基因组,重复上述打靶有效性分析中涉及的实验操作步骤,最终筛选并获得有效敲除了cxxc5a基因的斑马鱼F0代嵌合突变体。（4）F1代基因敲除斑马鱼的筛选及研究:将上述的F0代嵌合突变体与野生型斑马鱼进行杂交,检测并分析获得的F1代斑马鱼胚胎;培养72 h后随机选取一定数量的胚胎提基因组,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等初步鉴定F0代斑马鱼的cxxc5a基因敲除是否有效遗传至F1代;继续将剩余的F1代胚胎培养至5个月性成熟后,剪取其尾部提基因组,检测分析,最终筛选敲除了cxxc5a基因且能够稳定遗传的斑马鱼F1代杂合突变体。结果:体外成功合成高纯度的打靶gRNA和hCas9 mRNA;显微注射后F0代胚胎打靶有效性分析的PCR产物凝胶电泳出现目的条带,进一步的测序和序列比对显示,F0代胚胎cxxc5a基因于两个靶位点间发生碱基序列缺失,胚胎内发生了预期的基因编辑;F0代成鱼嵌合突变体筛选的PCR产物凝胶电泳出现目的条带,进一步的测序和序列比对显示,部分F0代成年斑马鱼个体的cxxc5a基因发生移码缺失突变,成功获得F0代嵌合突变体;选择适宜的F1代胚胎,初步分析并鉴定该基因敲除品系是否遗传至F1代,不过其PCR产物的凝胶电泳结果显示未出现相应的目的条带;将F1代胚胎培养至性成熟后,继续筛选基因敲除稳定遗传的F1代杂合突变体,在目前已完成筛选的斑马鱼F1代个体中,其PCR产物的凝胶电泳结果也未出现目的条带,原因尚在分析中。其余F1代的筛选工作也正在进行中。目前还不能确定F0代基因敲除已经稳定遗传至F1代。结论:本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对斑马鱼的cxxc5a基因进行了有效的编辑,使之产生移码缺失突变,在胚胎整体水平上敲除了cxxc5a基因,得到了嵌合突变体,为后续的基因敲除纯合品系的构建奠定了重要基础。

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摘要

ABSTRACT

1 前言

1.1 模式生物斑马鱼

1.1.1 斑马鱼简介

1.1.2 斑马鱼在心脏发育研究中的独特优势

1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑技术

1.2.1 基因编辑技术的发展简介

1.2.2 CRISPR/Cas9 的作用机制

1.3 cxxc5a基因简介

1.4 本研究的意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验试剂

2.1.2 斑马鱼品系

2.1.3 主要质粒和菌株

2.1.4 实验仪器

2.1.5 生物信息学分析主要数据库和软件

2.2 实验方法

2.2.2 PCR产物的纯化回收

2.2.2.1 配制琼脂糖凝胶

2.2.2.2 目的DNA片段纯化回收

2.2.3 目的片段与载体连接

2.2.4 感受态细胞的制备（CaCl2法）

2.2.5 连接子的转化（热激法）

2.2.6 挑取单克隆菌落、摇菌和菌液PCR

2.2.7 质粒提取与测序

2.2.7.1 高纯度小提质粒

2.2.7.2 质粒测序

2.2.8 mRNA的转录合成

2.2.9 mRNA的纯化（RNeasy Mini试剂盒法）

2.2.10 斑马鱼的饲养和杂交

2.2.11 CRISPR/Cas9 基因编辑方法

2.2.11.1 CRISPR打靶位点设计

2.2.11.2 靶标序列g RNA的合成

2.2.11.3 Cas9 mRNA的合成与制备

2.2.11.4 斑马鱼胚胎显微注射及有效性检测

2.2.11.5 斑马鱼F0、F1 代基因型鉴定

2.2.12 提取斑马鱼基因组

3 结果与分析

3.1 cxxc5a基因的打靶位点设计

3.2 cxxc5a基因打靶g RNA和 Cas9 mRNA的获得

3.3 cxxc5a基因打靶有效性检测分析

3.4 CRISPR/Cas9 打靶cxxc5a的 F0 代突变体筛选

3.5 cxxc5a-CRISPR/Cas9打靶F1 代突变体的筛选

4 讨论

5 结论

参考文献

综述

参考文献

附录一中英文缩略词表

附录二攻读硕士期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王宏波

导师: 叶湘漓

关键词: 斑马鱼,基因敲除

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 湖南师范大学

分类号: Q78;R-332

总页数: 57

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