王芳[1]2003年在《紫杉醇和喜树碱及其衍生物的抗侵袭转移机理研究》文中研究表明Taxol与CPT及其衍生物是临床上常用的抗肿瘤药物，对多种难治性实体瘤有效，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤等。近年来发现这两者药物还有抑制肿瘤转移的作用。本文对其抗肿瘤侵袭转移的机理进行了比较研究，主要结果如下： 第一部分 紫杉醇(Taxol)和喜树碱(Camptothecin，CPT)及其衍生物的抗侵袭转移机理研究 一、Taxol与CPT类的抗粘附、抗侵袭、抑制Ⅳ型胶原酶分泌作用 研究表明，0.1nM、10nM Taxol对小鼠黑色素瘤B16F10细胞与FN的粘附抑制率分别为28％和42％(P＜0.05)；0.1nM、10nM Taxol对其与LN的粘附抑制率为32％和39％(P＜0.05)；0.1nM CPT对B16F10与FN的粘附率没有明显影响，10nM CPT对其与FN的粘附抑制率为37％(P＜0.05)；0.1nM CPT对B16F10与LN的粘附率没有明显影响，10nM CPT对其与LN的粘附抑制率为13％(P＜0.05)。说明Taxol和CPT都能抑制B16F10细胞与FN或LN的粘附作用，同样浓度下，Taxol的抑制粘附作用比CPT稍强。 在B16F10细胞迁移运动的实验中，对照组运动细胞百分率为48±0.17％，经0.01μM Taxol或CPT处理12h后B16F10运动细胞的百分率分别下降为22±0.17％和29±0.16％，与对照组相比有显着性差异(p＜0.05)(图7)。对照组细胞运动速率为0.29±0.05μm／min，Taxol或CPT处理12h后细胞运动速率分别为0.24±0.02μm／min、0.25±0.03μm／min，与对照组相比有显着性差别(p＜0.05)。说明Taxol和CPT都能抑制B16F10细胞的迁移运动能力。 在人纤维肉瘤HT1080细胞分泌Ⅳ型胶原酶的实验中，0.01μM、1μm Taxol作用24h后，对HT1080细胞分泌MMP9的抑制率分别为75.1％和97.6％，对MMP2的抑制率分别为9.4％和94.0％；0.01μM、1μM CPT作用24h后对MMP9的抑制率分别为73.9％和89.7％，对MMP2分泌的抑制率分别为14.7％和94.0％。说明Taxol和CPT都能抑制HT1080细胞分泌MMP2或MMP9。 在小鼠黑色素瘤高转移株B16BL6细胞的侵袭实验中，0.001μM、0.01μM、0.1μMTaxol的侵袭抑制率分别为25％、55％、77％，能够明显抑制B16BL6细胞侵袭；而0.001μM、0.01μM、0.1μM CPT对B16BL6细胞的侵袭能力没有明显抑制。 二、Taxol与CPT类的血管生成抑制作用 MTT法结果显示Taxol、Topotecan(TPT)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin，10-HCPT)都能明显抑制HUVEC的增殖，其IC_(50)值分别为3.4、4.5、6.5nM，而CPT-11与之相比，对HUVEC增殖的抑制作用较弱，其IC_(50)值为110nM。
彭丽云, 刘森, 朱名毅[2]2015年在《生物碱抗肿瘤转移机制的研究进展》文中指出肿瘤转移和肿瘤耐药是导致肿瘤患者复发、预后差和死亡的主要原因,而且肿瘤转移还会增加肿瘤的抗药性。目前,国内外西医治疗肿瘤转移的方法有抗血管生成治疗、基因治疗、免疫治疗等,但是依然难以消灭转移癌细胞。生物碱是中草药中抗肿瘤的主要活性成分,大部分生物碱都有一定的抗肿瘤作用。近年来国内外学者从中药中分离得到了一批具有抗肿瘤转移活性的生物碱,弥补了现代医学抗肿瘤转移治疗的不足,成为防治肿瘤转移的一个有效方法,现将对这些研究成果作一
刘红岩, 雷小虹, 韩锐[3]1998年在《几种植物来源不同作用机制的抗癌药抗侵袭作用》文中研究指明用细胞培养法和癌细胞侵袭实验，观察几种植物来源不同作用机理的抗癌药如紫杉醇、叁尖杉酯碱、高叁尖杉酯碱及喜树碱［１］，对黑色素瘤高转移株Ｂ１６ＢＬ６细胞及人纤维肉瘤细胞ＨＴ１０８０的细胞毒作用和抗侵袭作用。结果表明紫杉醇、叁尖杉酯碱、高叁尖杉酯碱及喜树碱对Ｂ１６ＢＬ６和ＨＴ１０８０细胞增殖均有很强的抑制作用。紫杉醇、叁尖杉酯碱及高叁尖杉酯碱对Ｂ１６ＢＬ６细胞侵袭和运动也有明显的抑制作用，而喜树碱在同样浓度下对Ｂ１６ＢＬ６细胞侵袭和运动均无明显抑制。
薛霞[4]2011年在《Riccardin D靶向DNA拓扑异构酶Ⅱ的抗肿瘤作用研究》文中研究表明研究背景拓扑异构酶是一种真核生物生存所必需的核酶,可介导DNA单链或双链的瞬时断裂和再连接,在DNA复制、转录、重组及染色体分离等多个环节发挥重要作用。根据其诱导DNA断裂方式的不同,分为拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ,以拓扑异构酶为靶点的抗癌作用成为化疗药物研究的一个重要方向。临床上许多抗肿瘤药物以拓扑异构酶为作用靶点,取得了一定临床疗效。但在应用过程中仍出现一些问题：多药耐药性的产生,因长期使用拓扑异构酶毒剂而出现的继发性急性髓样白血病以及心脏毒性。因此,开发安全,高效,低毒以及可逆转多药耐药的以拓扑异构酶为靶点的化疗药物意义重大。RiccardinD是从苔藓类植物Dumortiera hirsuta分离所得的一种新型的大环双联卞类化合物。前期研究表明,RiccardinD可以抑制真菌被膜的形成,它的类似物羽苔素E可以逆转真菌耐药和肿瘤耐药,另一类似物地钱素C可以通过诱导微管解聚进而导致细胞凋亡最终发挥抗肿瘤作用,还可将肿瘤细胞阻滞在G2/M期抑制其增殖。本研究是基于前期研究结果推测RiccardinD可能会具有抗肿瘤及逆转多药耐药作用。试验方法1. RiccardinD对白血病细胞凋亡作用研究选用人慢性骨髓性白血病细胞株K562及人急性粒细胞白血病细胞株HL60,MTT法检测不同浓度riccardinD对白血病细胞增殖的抑制作用,Hoechst33258, FITC-Annexin V双染法及DNA Ladder检测riccardinD对白血病细胞凋亡的影响Western blotting检测riccardinD对凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-9, cleaved PARP9表达的影响。RT-PCR检测riccardinD对细胞凋亡抑制因子Bcl-2与细胞凋亡促进因子Bax-a比值的影响。最后检测线粒体和死亡受体介导的两条凋亡通路中的关键分子Cytochrome c及Caspase-8分析riccardinD可能介导的凋亡通路。2. RiccardinD对拓扑异构酶Ⅱ活性的影响以pBR322 DNA为作用底物,etoposide为阳性对照,检测riccardinD对拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ活性的影响。将riccardinD作用于K562细胞后,提取其拓扑异构酶Ⅱ,检测riccardinD对细胞内拓扑异构酶Ⅱ活性的影响。实时定量RT-PCR检测riccardin D对DNA拓扑异构酶Ⅱα基因表达的影响。SPR分析进一步检测riccardinD与拓扑异构酶Ⅱα间的结合能力。选用拓扑异构酶Ⅱα缺陷型细胞株HL60/MX2及构建拓扑异构酶Ⅱα高表达细胞系K562/TopoIIa检测riccardinD对两种细胞增殖的影响。3. RiccardinD对非小细胞肺癌生长的影响体外法,选取非小细胞肺癌细胞H460及A549,采用MTT, Hoechst33258及FITC-Annexin V双染法检测riccardinD对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响。另外,划痕试验、重组基底膜侵袭与转移及明胶酶活性测定试验检测riccardinD对非小细胞肺癌细胞侵袭及转移能力的影响。体内法,以H460细胞接种裸鼠腋下,待肿瘤长至100mm3-300mm3开始尾静脉注射给予riccardinD,叁天一次,给药叁周。给药结束后,取瘤组织称重,计算抑瘤率。取瘤块进行Western blotting及TUNEL试验检测riccardinD体内抑瘤作用及对肿瘤组织内凋亡蛋白Caspase-3, Caspase-9,cleaved PARP及侵袭转移相关蛋白MMP-2, MMP-9, VEGF及Erk1/2的影响。4. RiccardinD对肿瘤多药耐药的影响选用两株耐药株K562/A02及H460/RT,分别是阿霉素和紫杉醇耐药株。采用MTT法检测riccardinD单用,阿霉素与riccardinD合用,紫杉醇和riccardinD合用后对耐药细胞的抑制作用,计算合用后药物逆转倍数。以逆转作用较强的紫杉醇和riccardinD合用组进行裸鼠试验,以H460/RT细胞接种裸鼠腋下,待肿瘤生长至100mm3-300mm3时给予riccardinD和紫杉醇。给药结束,取瘤组织称重,计算抑瘤率。取瘤组织检测凋亡蛋白及耐药蛋白表达。另外,检测riccardinD对K562/A02细胞凋亡蛋白,耐药蛋白及基因表达水平的影响。试验结果1. RiccardinD诱导白血病细胞凋亡MTT结果显示,以riccardin D(10μM-60μM)分别与K562,HL60细胞孵育24h,48h,72h,最高抑制率90.6%。Hoechst33258结果显示,10μM,20μM和30μM riccardin D明显诱导细胞凋亡,孵育48h,细胞核染色质浓染,固缩或集聚核膜周边、或呈块状碎裂改变。FITC-Annexin V双染结果显示,10μM riccardinD处理K562细胞24h凋亡率为25.55%,HL60凋亡率为27.56%。DNA Ladder结果显示,riccardin D处理后产生明显DNA梯状片段。Western blot结果显示,10μM-40μM riccardin D显着增加K562和HL60细胞的Caspase-3, Caspase-9, cleaved PARP蛋白表达水平。RT-PCR显示,riccardin D可显着降低Bcl-2 mRNA水平,增加Bax-a mRNA水平,Bcl-2/Bax-a比值明显降低。此外,10μM-40μM riccardin D可显着增加K562细胞内Cytochrome c释放,而对procaspase-8蛋白表达水平无明显影响。2. Riccardin D靶向拓扑异构酶Ⅱ诱导凋亡拓扑异构酶活性检测显示,riccardin D对拓扑异构酶Ⅰ活性无明显影响,而200μM-800μM riccardin D体外可明显抑制拓扑异构酶Ⅱ活性,呈现浓度剂量依赖关系,而且riccardin D对拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用明显强于阳性对照etoposide。Riccardin D孵育后的K562细胞内拓扑异构酶Ⅱ活性显着降低。实时定量RT-PCR检测结果表明,riccardin D显着降低K562细胞内DNA拓扑异构酶ⅡαmRNA水平。以SPR技术分析显示,riccardin D与拓扑异构酶Ⅱ高度结合,结合常数KD为2.68E-06。进一步实验,riccardin D对高表达拓扑异构酶Ⅱ细胞抑制作用显着,而对拓扑异构酶Ⅱ缺陷型细胞株HL60/MX2抑制作用较弱,说明riccardin D可能通过靶向拓扑异构酶Ⅱ产生抗癌作用。3.Riccardin D对非小细胞肺癌抑制作用MTT, Hoechst33258, FITC-Annexin V双染及Western blot试验结果均显示,riccardin D显着抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡及增加凋亡蛋白表达水平。划痕试验结果表明,5μM-10μM riccardin D抑制A549细胞向无细胞划痕区迁移。Transwell侵袭试验显示,riccardin D抑制A549细胞穿透人工基底膜,当riccardin D浓度为5μM, 10μM,20μM时,抑制率分别为40.7%,56.5%,65.4%。明胶酶谱结果显示,2.5μM,5μM,10μM riccardin D显着抑制A549和H460细胞培养液中MMP-2, MMP-9活性。裸鼠移植瘤试验显示,riccardinD明显抑制肿瘤组织生长,20mg/kg时抑制率为44.5%,且裸鼠体重下降不明显。进一步检查肿瘤组织,显示TUNEL阳性染色水平增加,凋亡率为36.9%。4. Riccardin D逆转多药耐药作用以10μM riccardin D与阿霉素联合处理K562/A02可逆转阿霉素耐药,其逆转倍数为2.31。以10μM riccardin D与紫杉醇联合处理H460/RT可逆转紫杉醇耐药,逆转倍数为8.42。Riccardin D与紫杉醇联合处理接种H460/RT的裸鼠,riccardinD,紫杉醇单用组抑瘤率分别为46.8%和48.1%。而riccardin D与紫杉醇合用组肿瘤抑制率为57.3%。与单用组比较,合用组较单用组抑瘤率升高,且凋亡蛋白表达水平明显升高,而耐药蛋白表达水平显着降低。电泳结果显示,riccardin D降低K562/A02细胞内P-gp蛋白及Mdrl基因表达水平。试验结论Riccardin D具有较强的抗癌活性,显示抗侵袭转移活性和逆转多药耐药活性,抑制接种裸鼠的人肺癌H460肿瘤生长。其机制可能通过靶向拓扑异构酶Ⅱ,从而产生对拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制作用,启动线粒体介导的凋亡通路,诱导肿瘤细胞凋亡。
佚名[5]2004年在《肿瘤药理与化疗》文中研究指明5-氟尿嘧啶纳米微球抗肿瘤作用的实验研究姜文奇李苏王安训管忠震中山大学肿瘤防治中心内科目的:研究载5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)的聚乙二醇.聚谷氨酸苄酯PEG-PBLG)纳米微球对口腔鳞癌及结肠癌的体内抗瘤作用。方法采用超透析法制备-FU/PEG-PBLG纳米胶束,透射电镜观察纳米微球的形态,应用5-FU/PEG-PBLG纳米微球治疗口腔鳞癌或结肠癌裸鼠移植瘤,观察移植瘤的生长状态及组织病理学改变。结果5-FU/PEG-PBLG纳米微球为核-壳型结构,大小约230 nm;于对照组比较,
韩鹏[6]2009年在《胆管癌药物的筛选及作用机理的研究》文中研究表明胆管癌是一种难以治愈的恶性肿瘤。对于胆管癌的治疗，根治性手术是目前唯一有效的办法。但是，胆管癌的早期症状不明显、发现困难，一旦发现多数已进入晚期，很难通过手术方法切除，因此，寻找其他非手术方法治疗胆管癌就变得十分必要。目前临床应用的药物对胆管癌敏感性欠佳，而且存在明显毒副作用。因此，探索更敏感、有效的药物，提高胆管癌药物治疗的疗效就变得十分必要。本论文以体外培养的人胆管癌QBC939细胞为药物筛选模型，选用叶下珠、珠子草、冬青、白英、长春花、叁尖杉六种药用植物提取物、淡水贝类河蚬提取物、天然产物化合物、缩氨基硫脲类化合物及常见化疗药物，应用MTT测定法，从天然和化学合成物质中筛选具有抗胆管癌效应的药物。结果表明：珠子草和叶下珠的乙酸乙酯和正丁醇提取物、白英的水提物、长春花总碱、河蚬乙酸乙酯提取物、槲皮素、鞣酸、2-氯苯甲醛缩氨基硫脲和2，4-二氯苯甲醛缩氨基硫脲、叁苯氧胺等具有体外抗胆管癌细胞增殖的活性。与胆管癌临床中常用的化疗药物5-氟尿嘧啶和顺铂相比，叁苯氧胺表现出了更强的抑制胆管癌细胞的作用。因此，本研究选择叁苯氧胺(TAM)进行下一步的深入研究，探讨叁苯氧胺体外抗胆管癌作用的机理。通过MTT法、细胞形态观察法、流式细胞术、DNA ladder等方法研究表明：TAM呈时间和剂量依赖性抑制胆管癌QBC939细胞的增殖、使细胞形态发生明显变化、使细胞周期阻滞于G_0／G_1期、且显着诱导细胞凋亡；通过Western blot等方法研究表明：TAM对Cyclin D1、ERα、C-Myc蛋白表达的抑制、Caspase-3／Caspase-9信号通路的激活、Bax和p53蛋白表达的上调，是TAM发挥抗胆管癌作用的部分机制。为了进一步的探讨TAM抗胆管癌作用的分子机制和药物作用靶点，我们首次应用蛋白质组学技术研究了叁苯氧胺对人胆管癌QBC939细胞全蛋白表达谱的影响。最终成功鉴定出热休克蛋白、细胞骨架蛋白、膜联蛋白和代谢相关酶等差异表达的蛋白点。结合这些蛋白的功能，全面系统地分析了叁苯氧胺抗胆管癌作用的可能的分子机制。为胆管癌的药物治疗提供了新的线索，为叁苯氧胺在临床上应用于胆管癌的治疗提供了基础理论支持，也为叁苯氧胺抗胆管癌作用新靶点的阐明提供了新的思路和线索。
于涛[7]2017年在《基于清热解毒功效的二甲双胍对前列腺癌细胞迁移的抑制作用及其机制研究》文中研究指明一、背景据Global Burden of Disease Cancer Collaboration于2016年底在JAMA Oncology报道的数据显示,前列腺癌已经成为全球男性人群中最常见的恶性肿瘤,2015年约有160万例。我国全国肿瘤登记中心(NCCR)主任陈万青教授等发表在CA:A Cancer Journal for Clininicians期刊上的数据显示,2015年我国约有2.66万人死于前列腺癌,同时新增发病人数约达到6.03万;在我国虽然男性发病率最高的是肺癌和消化道癌(包括食道癌、胃癌和肝癌),但近10年来肺癌的发病率较为稳定,食道癌、胃癌和肝癌的发病率都有所下降,而前列腺癌的发病率和死亡率却都在持续上升。在原发性前列腺癌早期阶段,五年相对生存率接近100%,但是发生远端转移之后,相对生存率骤降至28%。《素问·宣明五气篇》中提到“肾主骨”,《素问·阴阳应象大论》也指出“肾生骨髓”,肾精化生为阴血以滋养骨髓和骨质,使骨质生长坚实;若肾有疽毒产生,则随血入髓伤骨。然肾主生殖,作为肾系统病变的前列腺癌,其远端转移最易发生在骨,约占91.1%。由于前列腺癌转移到骨或其他器官,到目前为止还是难以治愈的,所以死亡率很高。因此,找到有效的方法来抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭,阻止其转移到其他器官,遏止痈疽之毒扩散,将是至关重要的。熏倒牛(Biebersteinia heterostemon Maxim.)和山羊豆(Galega officinalis L.)中的主要活性成分是山羊豆碱,但是由于山羊豆碱毒性较大,随后据其发挥降糖作用的分子结构,进一步合成一系列衍生物,通过药效和毒性筛选,最后获得了毒性小的双胍类衍生物,即二甲双胍。二甲双胍具有良好的降糖效果,这继承了山羊豆(在中世纪欧洲曾被用作缓解糖尿病病症)的优点,如今已经成为治疗2型糖尿病的一线药物。而从中医角度来说,消渴症阴虚为本、燥热为标,反映了二甲双胍具有清热而防阴津亏损之功效。熏倒牛是我国一种古老草药,它在《吾叁卷香》和《晶珠本草》中都有记载,称其“花序和幼果”入药,性味苦寒,可治“痈疽疔疮”,有清热解毒及散肿止痛之效。二甲双胍继承了熏倒牛清热解毒之功效,显现出其消除痈疽和对热毒性肿瘤的潜在疗效,尤其是近年来多项流行病学研究和越来越多的证据表明二甲双胍能够降低包括前列腺癌在内的多种癌症风险,提高癌症患者的生存率。我们的前期研究表明二甲双胍能够通过诱导细胞周期阻滞和凋亡来抑制涎腺癌体外生长,通过体外和体内实验证明了二甲双胍能够靶向c-myc癌基因来抑制前列腺癌生长。细胞迁移是癌转移的关键步骤,推测二甲双胍有可能通过不依赖它对癌细胞增殖和凋亡的调控,而直接抑制前列腺癌的转移。已有报道二甲双胍可以通过抑制mtor和雄性激素受体等信号通路来抑制前列腺癌的生长。但是,对二甲双胍的抗癌特性还知之甚少,二甲双胍对前列腺癌细胞迁移的直接作用分子机制尚待研究。二、目的研究二甲双胍对前列腺癌细胞迁移的影响及其特异性分子机制,以便为精准抑制前列腺癌的转移找到特异性的靶点,进一步支持和加快推进二甲双胍作为清热解毒药物单独(单味药)或联合(配伍组方)用药治疗前列腺癌。叁、方法1.利用细胞划痕实验检测二甲双胍对两种转移性前列腺癌细胞迁移的影响我们选取了两种不同的转移性前列腺癌细胞系(成骨性的c4-2b和溶骨性的pc-3),用二甲双胍处理24h(pc-3)或48h(c4-2b),同时利用细胞划痕实验检测二甲双胍处理对细胞迁移的情况。2.二甲双胍对前列腺癌细胞中suv39h1基因表达调控的研究2.1利用实时定量pcr检测二甲双胍处理后两种前列腺癌细胞(pc-3和c4-2b)中的suv39h1mrna水平;2.2利用放线菌素d实验,验证二甲双胍对suv39h1mrna水平的调控是通过抑制suv39h1的转录过程还是通过促进其mrna降解实现的;2.3利用放线菌酮实验,验证二甲双胍对suv39h1的调控是直接的还是间接的;2.4利用免疫印迹实验,检测二甲双胍处理24、48和72h后前列腺癌细胞中suv39h1的蛋白水平。3.建立稳定过表达细胞系,研究suv39h1基因过表达对前列腺癌细胞c4-2b迁移能力的影响3.1稳定过表达suv39h1或suv39h1Δset细胞系的建立;3.2利用免疫印迹实验和细胞免疫荧光实验检测二甲双胍处理对过表达细胞系中suv39h1表达的影响;3.3利用细胞划痕实验检测suv39h1和suv39h1Δset过表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响;3.4利用结晶紫染色,检测suv39h1和suv39h1Δset过表达对前列腺癌细胞增殖的影响。4.采用前列腺癌组织微阵列(tissuemicroarray,tma)检测suv39h1和h3k9me2/3的蛋白水平利用免疫组织化学染色,检测人正常前列腺组织和不同分期前列腺癌组织中suv39h1和h3k9me2/3的蛋白水平。5.利用crispr-cas9技术敲除和稳定转染重新表达的方法,研究suv39h1对前列腺癌细胞迁移的调控作用5.1利用crispr-cas9技术敲除前列腺癌细胞pc-3中suv39h1基因,建立稳定表达的细胞系;5.2利用细胞划痕实验和transwell实验,检测suv39h1基因敲除对前列腺癌细胞pc-3细胞迁移能力的影响;5.3利用结晶紫染色,检测suv39h1基因敲除对前列腺癌细胞pc-3增殖的影响;5.4利用细胞划痕实验,检测二甲双胍对pc-3wt细胞和suv39h1敲除细胞迁移能力的抑制作用差异;5.5在suv39h1敲除细胞系的基础上,通过稳定转染分别携带人suv39h1和suv39h1Δset基因的逆转录病毒,实现suv39h1和suv39h1Δset基因的重新表达;5.6利用细胞划痕实验,检测suv39h1和suv39h1Δset基因的重新表达对敲除细胞迁移能力的影响。6.通过转录组测序,分析suv39h1基因敲除对前列腺癌细胞中基因表达和信号通路的影响6.1提取pc-3wt和suv39h1敲除细胞(ko1)总rna,进行转录组测序;6.2对转录组测序数据进行基因差异表达分析和生物学通路分析;6.3利用免疫印迹实验,验证suv39h1敲除对整合蛋白αv和β1表达水平的影响。7.fak(黏着斑激酶)及其磷酸化p-fak(y397)水平的检测利用免疫印迹实验,检测suv39h1敲除、重表达和二甲双胍处理的细胞中的fak及其磷酸化p-fak(y397)水平。8.抑制性转录因子的挖掘针对转录组测序的数据和encode项目的tfbschip-seq数据,利用r编程语言进行挖掘,结合功能分析,进而获得目的抑制性转录因子。四、结果1.二甲双胍对前列腺癌细胞迁移和suv39h1基因表达的影响1.1二甲双胍抑制前列腺癌细胞的迁移。利用细胞划痕实验,我们发现二甲双胍处理后,两种前列腺癌细胞系pc-3和c4-2b的细胞迁移能力都显着下降,分别降低了26%和59%。1.2二甲双胍抑制前列腺癌细胞中suv39h1的表达。利用实时定量pcr检测发现,二甲双胍处理48h,pc-3和c4-2b细胞中suv39h1的mrna和蛋白水平都明显降低。利用放线菌素d和放线菌酮实验显示,二甲双胍对suv39h1表达的调控是通过间接抑制suv39h1的转录实现的。2.suv39h1过表达对前列腺癌细胞迁移的影响以及临床相关性研究2.1suv39h1过表达促进了c4-2b前列腺癌细胞的迁移。通过稳定转染的方式,我们利用前列腺癌细胞系c4-2b,建立了稳定过表达suv39h1或suv39h1Δset的细胞系。利用细胞划痕实验,我们发现suv39h1过表达细胞的迁移能力显着提高,而suv39h1Δset过表达细胞的迁移能力没有显着变化;并且细胞增殖实验显示,suv39h1或suv39h1Δset过表达并未影响细胞的增殖能力。2.2suv39h1的表达水平与人前列腺癌的发展转移具有显着的临床相关性。对前列腺癌组织微阵列免疫组织化学染色后,我们发现suv39h1和h3k9me2/3水平与患者前列腺癌的发展和分期显着正相关;尤其在转移性前列腺癌组织中,suv39h1和h3k9me2/3都异常高表达。3.suv39h1基因敲除和重新表达对前列腺癌细胞迁移的影响3.1suv39h1敲除导致pc-3细胞迁移能力降低。利用crispr-cas9技术,我们将前列腺癌细胞系pc-3的suv39h1基因敲除,建立了两株独立的suv39h1敲除细胞系。对这两株敲除细胞系的细胞迁移检测发现,suv39h1的敲除显着降低了pc-3细胞的迁移能力。而这两株suv39h1敲除细胞系的增殖能力未发生显着变化。另外,利用细胞划痕实验对二甲双胍处理的pc-3wt和ko细胞迁移进行了检测,结果显示二甲双胍对suv39h1敲除细胞迁移的抑制作用变得不再显着。3.2suv39h1的重新表达使敲除细胞的迁移能力得到恢复。利用稳定转染的方式,我们在suv39h1敲除细胞系(ko1)中重新表达suv39h1或suv39h1Δset。根据transwell实验结果显示,suv39h1的重新表达使敲除细胞的迁移能力得到恢复,而suv39h1Δset的重新表达并未显着提高敲除细胞的迁移能力。4.suv39h1调控前列腺癌细胞迁移的分子机制研究4.1suv39h1调控整合素-fak信号通路。对转录组测序数据进行差异基因表达分析和生物学通路影响分析,我们发现与细胞运动和迁移有关的细胞粘附分子(celladhesionmolecules,cams)和ecm-受体交互作用(ecm-receptorinteraction)都在受suv39h1敲除影响最大的10个生物学通路之中,并发现其中的itgav和itgb1转录水平明显下调,经免疫印迹实验验证,其编码的整合蛋白αv和β1水平在敲除细胞和二甲双胍处理的细胞中也都显着降低。同时,整合素的直接下游分子黏着斑激酶(focaladhesionkinase,fak),在第397个酪氨酸(y397)的磷酸化水平在敲除细胞和二甲双胍处理细胞中都显着降低,并且在重表达细胞系中也与suv39h1的表达水平变化相一致。4.2抑制性转录因子介导了suv39h1对itgav和itgb1的表达调控。通过生物学分析结合功能分析挖掘,最后得到了6个介导suv39h1对itgav和itgb1调控的抑制性转录因子。五、结论本研究首次揭示了SUV39H1调控前列腺癌细胞运动迁移的分子机制;证明了SUV39H1通过整合素-FAK信号通路介导了清热解毒药二甲双胍对前列腺癌细胞迁移的抑制作用。该研究表明SUV39H1是抑制前列腺癌细胞迁移和侵袭的新靶标。
王玉玲[8]2004年在《抗肿瘤药物的合成及活性研究》文中进行了进一步梳理姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，姜黄为常用传统中药，它以其低毒高效的优点将成为一种很有发展前景的抗癌药。本论文分别用香草醛、对羟基苯甲醛、茴香醛、萘醛、肉桂醛、对甲酰基苯甲酸甲酯、对甲酰基苯甲酸和戊二酮为原料在催化剂及氧化硼作用下，对七个姜黄素类化合物进行了合成，化合物A1，7-双(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1，6-庚烯-3，5-二酮；化合物B1，7-双(4-羟基苯基)-1，6-庚烯-3，5-二酮；化合物C1，7-双(4-甲氧基苯基)-1，6-庚烯-3，5-二酮；化合物D1，7-双萘基-1，6-庚烯-3，5-二酮；化合物E1，11双苯基-1，3，8，10-十一烯-5，7-二酮；化合物F1，7-双(4-甲酸甲酯苯基)-1，6-庚烯-3，5-二酮；化合物G1，7-双(4-甲酸苯基)-1，6-庚烯-3，5-二酮。主要的合成方法为香草醛和2，4-戊二酮的硼化合物为原料，在叁甲基硼及正丁胺的催化作用下80℃反应3hr合成目标产物，产率很高，且产品很纯。产品纯化后进行了红外、核磁等表征，证明是目标产物，并通过MTT法绘制药物作用下的生长曲线考察药物对细胞的生长抑制情况；Hoechst染色法从形态学上观察化合物诱导HeLa细胞调亡的形态；DNA凝胶电泳法从生化学上观察是否出现凋亡典型的DNA梯带。并研究它们之间的构效关系。
王胜正[9]2014年在《抗真菌和抗肿瘤先导结构的发现和优化研究》文中认为先导化合物的发现和优化是新药研发的重要环节。本论文运用了多种策略来发现和优化抗真菌和抗肿瘤先导结构，主要包括：(1)通过基于结构的药物设计技术优化本实验室发现的高活性唑类抗真菌先导结构；(2)通过基于细胞的表型筛选技术发现咔啉类抗真菌先导结构，对其结构优化发现全新作用机制的抗真菌新化学实体；(3)通过药物结构优化技术，系统完成了传统中药有效成分吴茱萸碱的构效关系和药理活性研究，发现高活性抗肿瘤候选分子；(4)通过有机小分子催化的不对称串联反应技术，发展了叁项含硫骨架合成新方法，构建得到类药性分子库，并筛选发现具有广谱抗肿瘤活性的全新先导结构。一、新型抗真菌先导结构的设计、合成与活性研究(一)抗真菌靶标CYP51的同源模建和唑类先导结构的优化设计真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是抗真菌药物的重要靶点，其抑制剂唑类抗真菌药物已经广泛应用于临床。但由于真菌CYP51是跨膜蛋白，提取纯化比较困难，目前还没有晶体结构报道。本研究首次以人CYP51为模板，同源模建了白念珠菌CYP51(CA-CYP51)的叁维模型，并进行了分子动力学优化。对CA-CYP51模建结构的准确度进行了系统的计算评价，包括蛋白的Pro-check、Profiles-3D、分子对接验证和富集性试验测试。结果表明，所建立的模型具有较高的精确性，可以用于指导新型唑类抗真菌药物的合理设计。本课题组前期发现含有N-甲基侧链的唑类化合物表现出优秀的体外抗真菌活性。在此基础上，通过基于结构的药物设计技术对其进行了结构优化和构效关系研究，主要考察了含氮侧链上不同的取代基团对抗真菌活性的影响，设计合成了25个新化合物。构效关系表明，N上的取代基团以氢原子和甲基为最优，并且取代基团会影响侧链在CYP51活性位点中的伸展，进而影响抗真菌活性。其中化合物A1和A14较对照药氟康唑相比，表现出相当或更优的体外抗真菌活性。通过分子对接阐明了目标化合物与CA-CYP51的作用模式，并合理解释了构效关系，为进一步合理设计新型唑类抗真菌药物提供了有价值的信息。(二)咔啉类抗真菌先导结构的发现、优化和生物活性研究基于细胞表型或者功能的筛选是发现先导结构的重要途径。与针对具体靶点的分子水平筛选不同的是，细胞水平筛选不仅能够直接发现具有药理活性的分子，而且有可能发现全新结构类型和全新作用机制的先导结构，对新靶点和新药的发现具有重要作用。本研究中对课题组内部化合物库进行了体外抗真菌细胞水平的筛选，发现具有β-咔啉骨架结构的化合物表现出广谱的抗真菌活性。进一步对其进行结构优化，设计合成了27个新化合物。体外抗真菌测试表明，部分化合物的抗真菌活性优于先导结构。其中化合物C27活性最优，与对照药氟康唑相当。对其进行了深入的药理学评价，发现化合物C27对氟康唑敏感菌和耐药菌都具有杀真菌活性，能够有效抑制真菌生物被膜和真菌菌丝的形成，而氟康唑无此效应。协同抗真菌实验表明，化合物C27与氟康唑具有很好的协同抗真菌效果。采用透射电镜和GC-MS方法对C27的抗真菌作用机制进行了初步研究，发现该类化合物具有与氟康唑不同的作用机制，可能干扰了真菌细胞壁的生物合成途径。上述结果表明，对咔啉类抗真菌化合物进行深入研究，对于解决真菌的耐药性问题具有重要意义。二、新型吴茱萸碱衍生物的设计、合成和抗肿瘤活性研究天然产物一直是抗肿瘤新药研发的重要来源。在前期工作中，本课题组通过基于结构的虚拟筛选，首次报道了天然产物吴茱萸碱是拓扑异构酶的抑制剂。但它的体外抗肿瘤活性还比较低，分子作用靶点还不明确，有待深入的研究。本研究对吴茱萸碱进行了系统的结构修饰，考察了引入取代基和改变分子骨架对抗肿瘤活性的影响，总共设计合成了139个新型吴茱萸碱衍生物，并在分子、细胞和动物水平进行了药理活性测试。结果显示，部分化合物对多种肿瘤株的GI50小于3nM，表现出广谱、高效的体外抗肿瘤活性。裸鼠体内肠癌和肺癌模型显示，部分高活性衍生物表现出很好的体内抗肿瘤效果。例如在裸鼠肠癌模型中，化合物E135在2mg/kg条件下抑瘤率达到50.39%，并表现低毒和高耐受性特点。细胞凋亡实验显示，高活性化合物(E38, E112和E133)能够诱导A549肿瘤细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G2/M期。在分子作用靶点上，发现吴茱萸碱衍生物是首次报道的Top1/Top2/微管蛋白的叁靶点抑制剂。其中化合物E112和E135对微管蛋白的抑制活性(IC50分别为5.3μM和4.5μM)优于对照药秋水仙碱(IC50为10.8μM)。吴茱萸碱衍生物多靶点抗肿瘤作用特点对于提高肿瘤化疗效果和克服肿瘤耐药性问题具有重要的意义。叁、基于有机合成方法学构建类药性骨架和抗肿瘤先导结构的发现近年来，有机小分子催化的不对称串联反应发展迅速。这类反应仅需通过一步反应即能够以较好的反应收率和高立体选择性构建手性骨架，具有环境友好和原子经济性等特点，成为有机合成方法学的研究热点。3,4-二氢-2H-硫代吡喃骨架是药物活性分子中的优势骨架。本研究首次采用有机小分子催化的硫-[3+3]环合反应，一步构建了含有两个手性中心的二氢硫代吡喃骨架。反应具有很好的反应收率(51%-84%)和较好的立体选择性(最高值>20:1dr,>99%ee)，并通过Nazarov反应构建得到含有四个手性中心的全新类药性骨架。在此基础上，首次采用有机小分子催化的Michael-Michael串联反应，以较好的反应收率(58%-78%)、中等的非对映选择性(最高值为5.2:1dr)和高对映选择性(最高值>99%ee)，一步构建了含有四个手性中心的四氢硫代吡喃骨架。通过简单的化学转化，能够得到结构更加复杂、骨架更加新颖的类药性分子。螺吲哚酮骨架是天然产物和药物活性分子中的优势骨架，成为近年来药物研究的热点结构。采用有机小分子催化的方法将吲哚酮和四氢硫代吡喃骨架相结合，通过Michael-Michael串联反应一步构建了含有四个手性中心的吲哚酮螺四氢硫代吡喃骨架。反应具有很好的反应收率(55%-74%)和高立体选择性(dr>30:1,ee≥99%)。通过简单的化学转化，能够得到骨架更加新颖、结构更加复杂的结构。基于上述叁类骨架建立了一个小型化合物库，并进行了体外抗肿瘤活性测试。结果表明，吲哚酮螺四氢硫代吡喃类衍生物表现出广谱的抗肿瘤活性。其中化合物3b的体外抗肿瘤活性总体要优于对照药nutlin-3，具有深入研究的价值。在本部分研究中，通过发展有机合成方法学构建了叁种含硫类药性骨架，并通过体外抗肿瘤活性筛选首次发现吲哚酮螺四氢硫代吡喃衍生物具有广谱抗肿瘤的特点。这项工作体现了有机合成方法学与药物化学的相结合，为新药发现提供了一种新思路，并为抗肿瘤化学生物研究提供了分子探针。四、总结综上所述，本研究将多种先导物发现和优化策略应用于抗真菌和抗肿瘤新药发现中，总共设计合成了191个新化合物，并发现四种结构类型的抗真菌或抗肿瘤活性化合物。本论文的创新性主要体现在如下叁个方面：(1)首次发现咔啉类化合物是全新作用机制的抗真菌先导结构，发现化合物C27在克服真菌耐药性方面具有潜在的应用价值；(2)首次发现并证实吴茱萸碱衍生物是Top1/Top2/微管蛋白的叁靶点抑制剂，并获得了高效、低毒和广谱的抗肿瘤新化学实体，为开发具有自主知识产权的抗肿瘤原创药物奠定了基础；(3)将有机合成方法学和药物化学紧密结合，提出了先导化合物发现新策略。通过有机小分子催化的不对称串联反应，快速构建了叁类含硫优势分子骨架，并发现吲哚酮螺四氢硫代吡喃类衍生物具有广谱的抗肿瘤活性。本论文研究工作为开发具有自主知识产权的抗真菌和抗肿瘤创新药物奠定了基础。
何珊[10]2013年在《半边莲生物碱对白血病细胞抑制作用的初步研究》文中指出目的：从半边莲植物中提取分离出半边莲生物碱,观察其在体外对白血病细胞增殖的影响；并初步探讨了其抑制K562细胞增殖的可能机制,为半边莲生物碱抗肿瘤活性的开发利用提供科学根据。方法：通过正交试验对半边莲总生物碱的提取工艺进行了优化,并采用LC-MS技术对其的化学成分进行了初步鉴定；分别采用台盼蓝拒染法及MTT法检测半边莲生物碱在体外对四种白血病细胞的抑制作用；以抑制效果最好的K562细胞为机制探讨的实验对象,通过AO/EB染色、DNA凝胶电泳、PI单染及Annexin V-FICT/PI双染等方法来探讨半边莲生物碱对K562细胞凋亡的影响；通过瑞氏—吉姆萨染色、联苯胺染色来探讨低浓度的半边莲生物碱对K562细胞的诱导分化作用的影响。结果：半边莲生物碱的提取的最佳条件为乙醇浓度85%、固液比1：4、提取时间2.5h,提取率可达0.263%,所提取的生物碱主要成分为半边莲碱A、半边莲碱B、半边莲定、去甲半边莲定、8,10-二乙基山梗二酮、8,10-二乙基半边莲醇酮；半边莲生物碱在体外对四种白血病细胞均有抑制作用,且抑制作用具有时间和剂量依赖性；而其抑制可能是通过诱导细胞分化和诱导细胞凋亡两个方面的作用来实现的。结论：半边莲生物碱能显着抑制K562白血病细胞的增殖,具有很好的开发前景。
参考文献：
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[7]. 基于清热解毒功效的二甲双胍对前列腺癌细胞迁移的抑制作用及其机制研究[D]. 于涛. 大连医科大学. 2017
[8]. 抗肿瘤药物的合成及活性研究[D]. 王玉玲. 黑龙江大学. 2004
[9]. 抗真菌和抗肿瘤先导结构的发现和优化研究[D]. 王胜正. 第二军医大学. 2014
[10]. 半边莲生物碱对白血病细胞抑制作用的初步研究[D]. 何珊. 福建师范大学. 2013
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