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日本三角涡虫Caspase家族基因的功能研究

2020-12-02阅读(970)

日本三角涡虫Caspase家族基因的功能研究

论文摘要

凋亡是有机体细胞自主程序性死亡方式之一,是生物体正常的生理机能。再生主要指生物体组织或器官遭受损伤后,重建恢复的过程。淡水涡虫具有较强的再生能力,但是,细胞凋亡在涡虫组织再生过程中的作用以及两者之间关系报道较少。本文以再生能力较强的日本三角涡虫（Dugesia japonica）为实验材料,从转录组数据库选择了4个凋亡基因DjCasp3a、DjCasp3b、DjCasp3c和DjCasp8a,利用多种生物学软件对4个基因及其编码蛋白进行生物信息学分析;利用Real-time PCR、RNAi、TUNEL染色、H3P免疫荧光等分子生物学技术,对4基因在整体涡虫及再生过程的作用进行了研究。生物信息学分析结果表明:DjCasp3a和DjCasp3c编码的凋亡蛋白均含有保守的五肽序列QACRG,DjCasp3b和DjCasp8a编码的凋亡蛋白五肽序列分别为QACKG和DACRG。4基因编码蛋白均为亲水性稳定蛋白;没有跨膜结构和分泌信号肽,因此都不属于膜蛋白及分泌蛋白;亚细胞定位显示它们均位于细胞质中。Real-time PCR结果表明:在涡虫再生过程中4基因呈动态表达,在再生3小时,DjCasp3a、DjCasp3b和DjCasp3c表达极显著性调高2-5倍;在再生72小时3基因的表达量升高3-10倍。而DjCasp8a在再生3小时和72小时分别调高,达到极显著性,但没有前3个基因表达量高。原位杂交结果显示:4基因在涡虫体内广泛表达,主要在身体两侧实质组织内。4基因RNAi结果显示:DjCasp3a和DjCasp3b RNA干扰后整体涡虫出现少量的头部损伤或头部完全溃烂现象,但是涡虫不致死,且一段时间后逐渐恢复。干扰后再生涡虫没有明显的表型变化。DjCasp3c和DjCasp8a干扰后整体涡虫和再生涡虫均没有明显的表型变化。TUNEL染色结果表明:整体涡虫TUNEL阳性细胞呈散点状分布,在涡虫再生3小时凋亡细胞主要集中在伤口150μm内,在涡虫切割后72小时TUNEL阳性细胞呈全身性分布。4基因干扰后整体涡虫TUNEL阳性细胞数量极显著降低,在涡虫再生3小时TUNEL阳性细胞数量有降低趋势,在涡虫再生72小时TUNEL阳性细胞数量极显著降低。H3P免疫荧光结果表明:与对照整体涡虫相比,DjCasp3a、DjCasp3b、DjCasp3c和DjCasp8a RNA干扰后整体涡虫H3P阳性细胞数量极显著降低,达到极显著性水平。在涡虫再生3小时H3P阳性细胞数量极显著降低,但在涡虫再生72小时H3P阳性细胞数量与对照相比没有显著变化。综上结果表明,4基因调节涡虫体内细胞凋亡和干细胞增殖,在涡虫头部组织稳态维持中起重要作用。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 前言
  •   1.1 涡虫概述
  •   1.2 涡虫再生的方式
  •   1.3 细胞凋亡及其相关的酶
  •   1.4 细胞凋亡途径
  •   1.5 凋亡在涡虫中研究进展
  •   1.6 细胞凋亡与细胞增殖的关系
  •   1.7 立题依据及意义
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验动物
  •   2.2 实验所用引物
  •   2.3 基因克隆及RNAi喂食方法
  •   2.4 RNA提取和Real-time PCR
  •   2.5 原位杂交、TUNEL染色和H3P免疫荧光
  •   2.6 生物信息学分析
  • 第三章 实验结果
  •   3.1 凋亡蛋白Caspase家族基因生物信息学分析
  •     3.1.1 DjCasp3a生物信息学分析
  •     3.1.2 DjCasp3b生物信息学分析
  •     3.1.3 DjCasp3c生物信息学分析
  •     3.1.4 DjCasp8a生物信息学分析
  •     3.1.5 DjCasp3 基因同源性分析
  •   3.2 四凋亡基因在再生期间表达模式
  •     3.2.1 DjCasp3a在涡虫再生过程中的表达模式
  •     3.2.2 DjCasp3b在涡虫再生过程中的表达模式
  •     3.2.3 DjCasp3c在涡虫再生过程中的表达模式
  •     3.2.4 DjCasp8a在涡虫再生过程中的表达模式
  •     3.2.5 四凋亡基因在再生过程中的表达趋势
  •   3.3 四凋亡基因整体原位杂交
  •   3.4 RNA干扰喂食策略及干扰效果检测
  •     3.4.1 喂食策略
  •     3.4.2 四凋亡基因干扰效果检测
  •   3.5 四基因RNA干扰结果
  •     3.5.1 DjCasp3a RNA干扰后涡虫形态变化
  •     3.5.2 DjCasp3a RNA干扰后涡虫标记基因检测
  •     3.5.3 DjCasp3b RNA干扰后涡虫形态变化
  •     3.5.4 DjCasp3b RNA干扰后涡虫标记基因检测
  •     3.5.5 DjCasp3c RNA干扰后涡虫形态变化
  •     3.5.6 DjCasp3c RNA干扰后涡虫标记基因检测
  •     3.5.7 DjCasp8a RNA干扰后涡虫形态变化
  •     3.5.8 DjCasp8a RNAi涡虫标记基因检测
  •   3.6 日本三角涡虫TUNEL检测
  •     3.6.1 正常涡虫TUNEL检测
  •     3.6.2 凋亡基因干扰后整体涡虫TUNEL检测
  •     3.6.3 干扰涡虫切割后3 小时TUNEL检测
  •     3.6.4 干扰涡虫切割后72 小时TUNEL检测
  •   3.7 四基因干扰后整体涡虫H3P免疫荧光
  •     3.7.1 干扰涡虫整体H3P检测
  •     3.7.2 干扰涡虫切割后3 小时H3P检测
  •     3.7.3 四基因干扰涡虫切割后72 小时H3P检测
  • 第四章 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 高帅

    导师: 董自梅,陈广文

    关键词: 日本三角涡虫,细胞凋亡,再生,细胞增殖

    来源: 河南师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 河南师范大学

    分类号: Q75

    DOI: 10.27118/d.cnki.ghesu.2019.000305

    总页数: 70

    文件大小: 7464K

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