导读:本文包含了淀粉分支酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:淀粉,分支,水稻,大肠杆菌,相互作用,小麦,碳源。
淀粉分支酶论文文献综述
李苗,陈晓军,马斯霜,白海波,郑国保[1]（2019）在《小麦淀粉分支酶CRISPR/Cas9基因敲除系统gRNA表达载体构建》一文中研究指出本研究以小麦淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIa)为研究对象,选取SBEIIa基因外显子5'端的第一及第二个外显子区域的4个SBEIIa-gRNA参试靶点进行靶位点活性检测,确定最佳基因敲除靶点。采用试剂盒法,以选定基因敲除靶点序列设计gRNA引物,通过oligo二聚体(Oligoduplex)合成、oligo二聚体插入载体、转化及鉴定等步骤,构建具有表达小麦淀粉分支酶gRNA (guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得小麦淀粉分支酶基因敲除载体。根据载体中插入序列,进行测序分析;测序结果能够确认gRNA已经完整准确地连入载体。研究构建的小麦淀粉分支酶基因敲除载体能对小麦SBEIIa基因表达量进行负向调控,对后续小麦淀粉分支酶基因及向其它相关基因编辑调控研究提供科学依据。(本文来源于《分子植物育种》期刊2019年20期）
汪金玺,李鸽子,王永华,康国章[2]（2019）在《小麦淀粉分支酶基因SBEIIb上游转录因子的分离及功能研究》一文中研究指出淀粉是小麦籽粒最重要的组分,它决定粒重与食用品质,因此,研究小麦淀粉合成的分子机制对深入解析小麦产量和品质的调控网络具有重要意义。淀粉分支酶(Starch-branching enzyme,SBE)能够在葡聚糖链上引入α-1,6糖苷键,被认为是控制支链淀粉合成关键酶,由多个同工酶组成(SBEI、SBEIIa、SBEIIb、SBEIII等)。实验室前期利用iTRAQ蛋白质组学方法发现SBE的一个同工酶(SBEIIb)在灌浆期小麦籽粒内表达丰度显着高于其它同工酶,表明其在支链淀粉合成中发挥了重要作用。为解析调控TaSBEⅡb基因表达的分子机制,本研究分离出该基因的启动子序列,进而对该启动子不同片段进行了活性测定,找出驱动TaSBEⅡb表达的主要功能区域;并将该功能区域与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出了两个转录因子-TaNAC15 (NAC domain-containing protein 15)和TaHSF (Heat stress transcription factor);进一步通过酵母单杂交和LUC试验分别验证了转录因子与启动子之间的结合能力;同时,在田间条件下利用病毒诱导基因沉默技术(BSMV-VIGS),获得了TaNAC15和TaHSF瞬时沉默的小麦植株,发现2个转录因子沉默小麦植株籽粒内TaSBEⅡb的表达量、粒长、粒宽与千粒重均显着下降,表明TaNAC15和TaHSF通过与TaSBEⅡb基因的启动子结合,进而调控了该基因的表达,参与了小麦籽粒淀粉的合成。(本文来源于《第十届全国小麦基因组学及分子育种大会摘要集》期刊2019-08-11）
张鸣明,马泽业,张春园,李素岳,胡先望[3]（2019）在《碳源诱导嗜热脂肪芽孢杆菌生产淀粉分支酶的研究》一文中研究指出利用嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生产淀粉分支酶,研究不同碳源种类及浓度对嗜热脂肪芽孢杆菌产酶性能的影响。结果表明,以0.20%麦芽糊精为碳源时,淀粉分支酶的酶活最高,达20.02 U/m L,是其他碳源的2～10倍。采用最优培养基在小试试验的基础上进行了扩大培养中试试验,淀粉分支酶酶活稳定,为19.87 U/m L,是小试试验的1.1倍。(本文来源于《中国酿造》期刊2019年07期）
陈琛[4]（2019）在《分支酶修饰蜡质大米淀粉结构与性质研究》一文中研究指出淀粉改性能改善大多数天然淀粉不溶于冷水、糊化后易老化、低温发生凝沉等不足,在食品工业中有广泛的应用。其制备途径包括物理改性、化学改性和酶法改性。其中,酶法反应效率高、反应条件温和且产物环保,适于大规模工业生产应用。分支酶具有断裂α-1,4-糖苷键和形成α-1,6-糖苷键的水解转苷催化特性,是修饰改性淀粉的一种重要的酶类。本课题利用分支酶对蜡质大米淀粉进行修饰改性,并对得到的酶改性淀粉进行结构分析,在此基础上,以β-胡萝卜素为例考察该酶改性淀粉在营养素载运方面的应用,主要研究内容及结果如下:首先,本课题利用基因工程获得来源于Bacillus stearothermophilus的分支酶基因片段,将其连接到pET-22b(+)载体上,构建得到重组质粒。重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷(IPTG)诱导表达获得重组分支酶,经测定,该蛋白酶相对分子质量为70 kDa,最适温度为75℃且具有良好的热稳定性,最适pH为7.0,在pH 6.0~9.5均保持稳定。其次,利用分支酶对蜡质大米淀粉进行修饰改性。对改性淀粉的结构分析,表明经分支酶处理后,一方面蜡质大米淀粉相对分子质量的重均值Mw和分散性均降低,链段呈现A链(DP≤13)增多,B链(DP>13)含量减少的分布变化,推测该分支酶更倾向于将中长链段水解成短链段,作为后续反应的片段;另一方面α-1,6糖苷键的含量由5.0%提高至6.6%,产生DP 19~34的环状结构,形成分支环状改性结构。对酶改性淀粉的溶解度、粘度和消化特性分析,结果表明,酶改性淀粉在冷水中的溶解度达到83.3g/100 mL(25℃),在室温下即可溶解形成均一的溶液;粘度相比于蜡质大米淀粉显着降低,只有蜡质大米淀粉的1/10000左右;经过分支酶处理后,慢消化淀粉(SDS)含量由8.5%提高至21.0%,抗消化淀粉(RS)的含量由6.9%增加至18.5%,推测与分支酶改性修饰形成的分支环状结构有关。随后,对酶改性淀粉中的分支环状特征结构分析,表明该分支环状特征结构平均由21个葡萄糖单元组成,环状结构中含有19个葡萄糖单元,其余的两个葡萄糖单元以α-1,6糖苷键连接在环上作为端基,结构中键型包括α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,其中α-1,6糖苷键以平均间隔5.6个葡萄糖单元进行分布。结合分子动力学模拟软件Discovery Studio 3.5(DS 3.5)、紫外-可见光谱仪全波长扫描仪和等温滴定量热仪(ITC)对该分支环状结构特性分析,发现该分支环状特征结构具有与大环糊精类似的疏水性空腔,可复合碘类的疏水性物质。最后,以该酶改性淀粉制备β-胡萝卜素/酶改性淀粉的包合物。经测定,由质量比为1:5(β-胡萝卜素:酶改性淀粉)形成的包合物中,β-胡萝卜素的溶解度为179.1μg/mL,负载率和包埋量分别为1.3%和8.9μg/mg。利用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、X-射线衍射(XRD)、热重分析仪(TGA)和差示热量扫描仪(DSC)等现代分析技术对包合物进行特性表征显示,β-胡萝卜素包合后由晶型结构转变为无定型结构。以β-胡萝卜素为对照,进行稳定性实验,结果表明在室温下光照六周后,β-胡萝卜素/酶改性淀粉包合物中β-胡萝卜素的保留率高于对照组;在FeCl_3化学氧化下1 h后,β-胡萝卜素/酶改性淀粉包合物中β-胡萝卜素保留率仍高于80%,表明该酶改性淀粉对β-胡萝卜素的光照稳定性和氧化稳定性具有提高作用。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
辛辰昊[5]（2019）在《淀粉分支酶在大肠杆菌中的非经典分泌研究》一文中研究指出淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,GBE)能水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,然后合成α-1,6-糖苷键,从而提高淀粉的分支度,故在酶法改性淀粉中发挥着重要作用。据文献报道,绝大多数微生物来源的GBE都是胞内酶,而本实验室前期也分别构建了两种不同来源GBE(Gt-GBE和Ro-GBE)的大肠杆菌胞内表达系统,却意外发现它们能在不含信号肽的条件下分泌到培养基中。若能了解这两种GBE的无信号肽分泌机理,则可以为外源蛋白的分泌表达提供一种新的思路,同时也可以为促进GBE分泌表达的策略提供理论指导。因此,本文对这两种GBE的无信号肽分泌机理进行了研究,其主要研究结果如下:首先,对这两种GBE的无信号肽分泌现象进行了分析比较。通过测定酶活和蛋白电泳发现,它们在大肠杆菌中都可以大量分泌表达并不需要诱导剂,同时Gt-GBE的分泌速率要大于Ro-GBE。使用多个生物信息学网站对两种GBE进行分析,结果显示它们均为无信号肽的胞内蛋白,因此推测其分泌属于非经典分泌。为了考察这些无信号肽蛋白是否也会通过经典分泌途径进行分泌,对它们进行了亚细胞定位分析,发现它们的分泌都是“两步跨膜运输”,但并不属于“两步跨膜运输”中最主要的Sec途径。尽管Ro-GBE具有符合Tat途径特征的双精氨酸结构,但通过定点突变也排除了该分泌途径的可能。由于N端通常是影响蛋白分泌的关键因素,故通过将两种GBE的N端进行互换和截断,从而分析其N端与分泌的关系,结果发现N端不仅会影响它们的分泌还会影响它们的表达。其次,由于蛋白质分泌是一个跨膜运输的过程,因此细胞膜对分泌的影响也不可忽视。故以乳酸脱氢酶为指示物,测定发酵过程中大肠杆菌细胞膜的通透性,发现与含空载质粒的大肠杆菌相比,能分泌表达Gt-GBE和Ro-GBE的大肠杆菌细胞膜通透性更大,并通过流式细胞仪检测得到了一致的结果。由于大肠杆菌是具有两层细胞膜的革兰氏阴性菌,为了进一步分析两种GBE对其细胞膜的作用,分别测定了它们对细胞内膜和细胞外膜通透性的影响。结果均显示,非经典分泌蛋白Gt-GBE和Ro-GBE都会使大肠杆菌细胞内外膜通透性显着增加。然后,根据上述实验结果推测了GBE可能的非经典分泌模型,该模型指出GBE是通过提高大肠杆菌细胞膜通透性的方式分泌至培养基的。因此,尝试了加入几种能影响大肠杆菌细胞膜通透性的培养基添加剂,以期促进两种GBE的分泌。结果显示,甘氨酸和曲拉通X-100都可以显着促进GBE的分泌。而添加剂对两种GBE分泌的促进作用,进一步验证了上述模型的可靠性。综上所述,Gt-GBE和Ro-GBE在大肠杆菌内大量合成后,会引起细胞膜通透性的增大,从而以“两步跨膜运输”的方式分泌至培养基,这种分泌属于非经典分泌。同时N端对其分泌表达也有显着影响,并且可以通过加入添加剂促进其分泌。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
胡盼[6]（2018）在《抑制淀粉分支酶表达引起水稻胚乳异形淀粉形成的酶学基础》一文中研究指出国内外的研究表明,抑制淀粉分支酶(SBE)表达可以提高禾谷类作物胚乳直链淀粉和抗性淀粉含量,具有促进人体健康的作用。然而伴随直链淀粉含量不同程度的增加,胚乳形成不同形态的淀粉粒(被称为异形淀粉)。这些异形淀粉的淀粉组分、晶体结构和理化特性具有明显差异,并在胚乳中呈区域性分布,但它们的形成机制及其胚乳区域性分布的原因尚未澄清。本研究以来源于水稻品种特青(TQ)抑制SBEⅠ/Ⅱb表达的高直链抗性淀粉水稻TRS为材料,在胚乳发育过程中,研究TRS胚乳多角形、多聚体、细长形和中空状等异形淀粉在发育籽粒中的时空积累和淀粉组分变化,分析淀粉合成关键酶的转录、表达和活性,调查SBE在籽粒中的区域性分布,从而揭示抑制SBE表达引起胚乳异形淀粉形成的酶学基础。研究结果不仅为高直链抗性淀粉禾谷类作物的培育提供帮助,而且丰富和充实植物淀粉的形成和发育等知识。主要研究结果如下:1.异形淀粉在发育籽粒中的时空积累。完整籽粒的切片观察表明,TRS胚乳含有多角形、多聚体、细长形和中空状等异形淀粉。多角形淀粉为复粒淀粉的亚颗粒,从花后4d开始形成,主要在TRS胚乳中央区域积累。多聚体和细长形淀粉从花后7d开始形成,主要在中间胚乳中积累。中空状淀粉从花后10 d开始形成,主要在外围亚糊粉层区域积累。2.异形淀粉的淀粉组分。发育籽粒内的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量分析表明,花后7 d之后,TRS籽粒内的支链淀粉和总淀粉含量显着低于TQ,而直链淀粉含量明显高于TQ,并且支链淀粉含量降低的幅度比直链淀粉含量升高的幅度大。因此,与TQ相比,TRS粒重降低和分离淀粉中的直链淀粉含量的升高主要是支链淀粉在籽粒内的合成受阻造成的,同时直链淀粉在籽粒内的合成增加进一步提高了分离淀粉的直链淀粉含量。分离淀粉及其支链淀粉的淀粉分子量分布测定表明,TRS多角形、多聚体、细长形和中空状淀粉的真实直链淀粉含量依次为26.1%、38.3%、62.4%和74.9%,支链淀粉分支度依次降低,但它们的支链淀粉超长链含量反而比TQ淀粉低。支链淀粉链长分布测定显示,从TRS多角形、多聚体、细长形到中空状淀粉,支链淀粉短支链含量逐渐降低,而长支链和支链平均链长逐渐增加。3.淀粉合成关键酶的转录、表达和活性动态。发育胚乳的qRT-PCR、免疫印迹和Native-PAGE/活性染色的结果表明,与TQ相比,TRS中的SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb的转录、表达和活性均被显着抑制,可溶性淀粉合成酶SSSI活性降低,淀粉磷酸化酶Pho1表达增强,而其它支链淀粉合成关键酶没有显着变化。淀粉粒绑定蛋白的分析结果表明,从TRS多角形、多聚体、细长形到中空状淀粉,SBEⅠ、SBEⅡa、SBEⅡb和SSSⅠ的含量逐渐降低,而Pho1含量逐渐升高,但颗粒结合淀粉合成酶GBSSⅠ的转录、表达和活性在TQ和TRS之间及各 TRS异形淀粉之间没有明显差异。4.SBE在籽粒中的区域性分布。花后10d籽粒的免疫荧光分析表明,SBEI、SBEIIa和SBEⅠb在TQ胚乳中表现均质分布,而在TRS胚乳中表现出特定的空间分布,荧光信号强度从胚乳的内部向外部逐渐减弱。上述结果表明,TRS胚乳中SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb的表达抑制减少了支链淀粉的合成,从而在淀粉粒内释放出更多的空间供直链淀粉合成和积累。SBE剂量影响淀粉中的支链淀粉含量和结构及直链淀粉含量,进一步改变淀粉粒的形态。SBE表达在TRS发育籽粒中从胚乳内部到外部逐渐降低,导致多角形、多聚体、细长形和中空状淀粉依次在TRS籽粒中从胚乳内部到外部逐渐形成和积累。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-04-01）
潘婷[7]（2018）在《抑制淀粉分支酶表达对水稻籽粒淀粉原位糊化和水解的影响》一文中研究指出禾谷类作物胚乳富含淀粉,不仅作为人类摄取碳水化合物的重要来源,还为种子萌发和幼苗生长提供主要的能量。抑制淀粉分支酶(SBE)表达提高胚乳抗性淀粉含量,具有促进人体健康的功能,因此SBE表达抑制的禾谷类作物已被大量培育。虽然抑制SBE表达对胚乳分离淀粉的结构和特性影响已有大量报道,但对籽粒淀粉的原位糊化和水解影响尚不清楚。本研究以不同直链淀粉含量的常规水稻籼稻特青、粳稻武香9915和糯稻广陵香糯及其来源的抑制SBEⅠ/Ⅱb表达的水稻株系成熟籽粒为材料,研究籽粒蒸煮过程和幼苗生长中淀粉形态结构和理化特性的变化,查明抑制SBE表达对水稻籽粒淀粉原位糊化和水解的影响,并揭示影响产生的原因。研究结果为高抗性淀粉作物的培育和利用提供参考资料,丰富和充实淀粉结构和特性相关知识。主要研究结果如下:1.完整籽粒树脂切片法观察水稻籽粒淀粉的原位糊化和水解。将课题组建立的禾谷类作物完整籽粒树脂切片法应用于水稻籽粒蒸煮和幼苗生长过程中胚乳淀粉形态变化的研究。结果表明,利用该方法,蒸煮的稻米和幼苗生长过程中的水稻种子可以被切成2 μm厚的完整籽粒切片。蒸煮稻米切片经碘染色,清晰呈现出稻米糊化从胚乳外围向内部进行;在糊化过程中,淀粉粒体积增加,直链淀粉溢出,淀粉粒逐渐失去颗粒形态而相互粘连在一起。幼苗生长过程中,胚乳淀粉的水解从近胚端向远胚端、从胚乳外侧向内侧逐步进行。2.抑制SBEⅠ/Ⅱb表达对水稻籽粒淀粉原位糊化的影响。将糙米在沸水浴中蒸煮不同时间,调查籽粒的蒸煮品质、观察淀粉的糊化过程、测定淀粉的结构特性。结果表明,常规水稻籽粒蒸煮30 min已完全糊化,但SBE表达抑制的水稻籽粒蒸煮60 min仍没有完全糊化。.籽粒体积、湿重和浸出物质随蒸煮时间延长而增加,常规水稻籽粒增加的幅度显着比SBE表达抑制的水稻高。常规水稻籽粒糊化从外向内逐渐进行,而SBE表达抑制水稻籽粒糊化最早开始于胚乳外围,但不能完全糊化,而籽粒中央区域可以完全糊化。常规水稻胚乳淀粉为均一的多角形复粒淀粉,易被糊化而相互粘连;SBE表达抑制的水稻胚乳外围区域含有多聚体、细长状和中空状等异质淀粉,难糊化阻止了淀粉相互粘连。蒸煮对籽粒淀粉的分子量分布没有影响,但常规水稻A-型淀粉易糊化变成无定形淀粉,而SBE表达抑制的水稻胚乳含有C-型淀粉,晶体结构难糊化,导致糊化的籽粒具有很高的消化抗性。上述结果表明,抑制SBE表达改变淀粉形态和晶体结构,淀粉抗糊化而提高籽粒的消化抗性。3.抑制SBEⅠ/Ⅱb表达对水稻籽粒淀粉原位水解的影响。将稻谷在黑暗条件下用水培养,在幼苗生长过程中,调查籽粒淀粉消耗与幼苗生长动态的关系、观察胚乳淀粉水解过程、测定淀粉结构和特性。结果表明,籽粒淀粉消耗与幼苗生长呈正相关,抑制SBE表达明显降低了籽粒淀粉的水解,导致幼苗生长缓慢。幼苗生长过程中,胚乳淀粉的水解从近胚端向远胚端、从胚乳外侧向内部逐步进行;常规水稻胚乳淀粉能被完全水解;SBE表达抑制的水稻胚乳多聚体、细长状和中空状等异质淀粉抗水解,导致胚乳外周的淀粉不能完全被降解。在常规水稻中,胚乳淀粉中的直链和支链淀粉同步被降解,淀粉的晶体结构在幼苗生长过程中没有发生变化;在SBE表达抑制的水稻中,淀粉中的直链淀粉优先被水解,支链淀粉长侧链较难水解,C-型淀粉中的A-型晶体比B-型晶体降解快。上述结果表明,SBE表达抑制的水稻胚乳异质淀粉的支链淀粉长侧链和B-型晶体结构抗淀粉水解酶的水解,导致水稻幼苗因缺少营养物质而生长缓慢。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-04-01）
班宵逢[8]（2017）在《静电相互作用对淀粉分支酶热稳定性影响的研究》一文中研究指出淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme;GBE;EC 2.4.1.18)是属于糖苷水解酶家族13(GH 13)的一类糖基转移酶,能够催化淀粉分子α-1,4-糖苷键的断裂形成游离短链,并通过转糖苷作用将切割下的短链以α-1,6-糖苷键的形式连接于受体链上,在淀粉分子原主链上形成新的α-1,6-分支点。通过转糖基反应,GBE能够增加淀粉的分支度,提高淀粉的抗消化性和慢消化性,延缓淀粉的回生过程,增强淀粉的稳定性并改善淀粉的使用性能,可用于生产具有良好应用价值的淀粉衍生物。因此,该种酶在淀粉工业中具有广阔的应用潜力。目前,大部分来源的GBE热稳定性相对较差,限制了其在淀粉工业中的应用。为了克服这一弊端,着力于提高GBE的热稳定性成为了扩展GBE工业化应用的研究关键点和热点。本论文研究了来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的GBE的生化性质,深入探究了金属离子与酶蛋白分子表面之间静电相互作用和酶分子内部静电相互作用(即盐桥)两方面对GBE热稳定性的影响。结果显示,加强酶分子外部的静电相互作用(金属离子和酶分子表面氨基酸之间)显着提升GBE的热稳定性。依据此现象,通过序列比对、结构分析和基因删除策略构建具有更高热稳定性的GBE的C末端缺失型突变体,并进一步证实溶剂中金属离子与GBE分子表面氨基酸残基之间存在较强的静电相互作用;另一方面,以酶分子内部静电相互作用(即盐桥)的生物信息学分析为基础,通过在GBE内部构建盐桥,从而强化GBE内部静电相互作用,提高了GBE的热稳定性。与此同时,对GBE分子表面和内部的静电相互作用对GBE热稳定性影响的机理进行了系统研究。主要研究成果总结如下:(1)对重组GBE的生化性质进行了分析,结果表明,该酶的热稳定性较差,在65?C下的半衰期只有约6.9 min,不利于淀粉高温糊化过程中GBE的应用,因此,有必要着力改善GBE的热稳定性。研究显示,GBE的活力和稳定性受溶剂中金属离子影响较大,去除溶剂中金属离子(添加不同浓度EDTA)和在溶剂中额外添加不同类型金属离子对GBE的活力和稳定性产生显着影响。其中,钾离子和钠离子对GBE的活力具有激活作用,钙离子、钴离子、镍离子、铜离子和铁离子等不同程度地抑制GBE的活力。进一步研究发现,0.5 mM的钾离子和1.0 mM的钠离子能显着提升GBE的热稳定性。钾、钠离子能够提高GBE的热稳定性,可能是通过钾、钠离子结合于酶分子中金属离子结合位点或聚集于酶分子表面形成静电相互作用这两种机制,以此达到稳定酶分子空间构象的目的。然而,本研究所使用GBE结构中未发现有特定金属离子结合位点。钾离子和钠离子具有提高GBE热稳定性的作用,更可能是通过钾、钠离子聚集于GBE分子表面与其产生静电相互作用,并形成金属离子-酶分子的静电网络结构这种机制达到。甘油分子可以排除酶分子周围的水分子,减少水分子与酶分子表面的接触,强化金属离子与酶分子表面之间的静电相互作用。结果显示,甘油的加入进一步提高了GBE的稳定性,暗示加强GBE分子与溶剂中金属离子之间的静电相互作用可以提高GBE的稳定性。(2)GBE分子表面的静电相互作用可能形成于金属离子与酶分子表面带电荷氨基酸残基之间。对比、分析来源于G.thermoglucosidans STB02的GBE(GBE_(Gt))和Escherichia coli的GBE(GBE_(Ec))的一级序列和结构发现,相比于GBE_(Ec),GBE_(Gt)的C末端延伸出26个氨基酸残基,且该区域中约50%的氨基酸残基为带电荷氨基酸残基,可能与溶剂中金属离子形成静电相互作用。以这26个氨基酸残基为基因删除对象,构建删除这26个氨基酸残基的C端缺失型突变体GBE_(Gt)(35)C。对比研究GBE_(Gt)和GBE_(Gt)(35)C性质发现,这两种酶具有相似的催化特性,但GBE_(Gt)(35)C具有更强的热稳定性,其T_m比GBE_(Gt)高约5°C。另外,GBE_(Gt)(35)C具有比GBE_(Gt)更强的恢复性,在各自T_m下保温后,GBE_(Gt)(35)C的恢复溶解性能力约为GBE_(Gt)的2倍。研究还发现,GBE_(Gt)和GBE_(Gt)(35)C的活力对EDTA和金属离子的响应值不同,GBE_(Gt)(35)C不仅对EDTA具有更强的耐受性,还对金属离子有更低的响应值。GBE_(Gt)(35)C可以稳定地存在于不含金属离子的溶剂中,而GBE_(Gt)在同等条件下则呈现出聚集状态。机理分析显示,GBE_(Gt)和GBE_(Gt)(35)C对EDTA和金属离子响应值及其热稳定性的差异可能是由于删除GBE_(Gt)的C末端26个氨基酸残基所引起的GBE_(Gt)在溶剂中的分布状态发生变化,且这种变化导致两种酶嗜热机制的不同。具有完整序列的GBE_(Gt)与溶剂中金属离子之间存在静电相互作用,加强这种静电相互作用有利于具有完整序列GBE_(Gt)的稳定性。(3)先前的研究表明加强酶分子外部的静电相互作用可以提高GBE的热稳定性,而强化酶分子内部的静电相互作用(即盐桥)也可能对GBE的热稳定性产生一定影响。实验首先对蛋白分子内部盐桥在生物中分布的普遍规律进行了研究。通过生物信息学分析和统计学方法对盐桥的特性进行分析,总结出适用于蛋白分子内构建盐桥的基本规律。在此基础上,从生物进化学的角度发现,盐桥中一个氨基酸残基为保守时,该盐桥中所涉及的另一个氨基酸残基超过80%的几率是保守的;相反,盐桥中一个氨基酸残基为非保守时,该盐桥中所涉及的另一个氨基酸残基只有10-20%的几率是保守的。此外,盐桥对其所处区域的遗传稳定性有重要意义:当一对盐桥为保守时,该盐桥所处区域的氨基酸残基的遗传稳定性为61-100%;相反地,当一对盐桥为非保守时,该盐桥所处区域的氨基酸残基的遗传稳定性不高于45%。以上研究从遗传稳定性的角度,证明了盐桥对蛋白分子稳定性具有重要作用,并暗示对蛋白分子稳定性贡献较大的盐桥更可能出现于遗传稳定性较强的区域中。(4)依据蛋白分子内部盐桥生物信息学特征,在GBE分子中筛选出符合盐桥形成条件的氨基酸残基位点进行突变,构建了一系列旨在提高GBE热稳定性的盐桥突变体。构建于GBE?-螺旋结构中的盐桥H224E、H224D、Q231R、Q231K、T339E和T339D,强化了盐桥所处区域的稳定性并增强了GBE的耐热性,使GBE在60?C下的半衰期t_(1/2)(min,60°C)分别延长约40%、38%、21%、26%、16%和21%;构建于GBE的?-折迭结构中的盐桥V37E、V37D、G98E、G98D和I571D显着地提高了GBE的热稳定性,使GBE在60?C下的半衰期t_(1/2)(min,60°C)分别延长约80%、88%、95%、109%和52%;而构建于GBE无规卷曲中的I266E则对GBE的热稳定性贡献较小,表明在GBE中强化无规卷曲结构对GBE的热稳定性不产生显着影响。(5)在此基础上,进一步构建了在GBE的?-螺旋和?-折迭结构中涉及到叁个带电荷的氨基酸残基的盐桥,即网络盐桥。结果显示,构建于GBE?-螺旋结构中的网络盐桥Q231R-D227-D131H、Q231K-D227-D131H、T339E-K335-I291H和T339D-K335-I291H可以在原有盐桥的基础上进一步强化该盐桥所处区域的稳定性,进而提高GBE的热稳定性。而构建于GBE?-折迭中结构中的网络盐桥I571D-R569-R617H,虽然进一步加强了该区域的结构稳定性,但未在原有盐桥的基础上进一步提升GBE的热稳定性。具有较高热稳定性的C末端缺失型突变体GBE_(Gt)(35)C和盐桥突变体用于改性淀粉,使淀粉在获得同等效力的抗消化和慢消化性时,减少了改性过程中酶的添加量,提高了淀粉分支酶的使用性能。另外,在淀粉糊化后降温过程中,具有较高热稳定性的突变体GBE可以相对较早地添加到淀粉糊化乳中,缩短反应时间并减少反应过程中的能耗。此外,通过删除GBE的C末端氨基酸残基部分片段和在酶分子内部理性构建盐桥的手段,进一步丰富了淀粉酶热稳定性的改造策略。(本文来源于《江南大学》期刊2017-12-01）
刘艺婷[9]（2017）在《淀粉分支酶在大肠杆菌中的分泌表达及其分子改造研究》一文中研究指出淀粉分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme,简称GBE;EC 2.4.1.18)是一种直接参与淀粉生物合成的糖基转移酶,它能够切断淀粉分子中的α-1,4-糖苷键,并将切下的链段以α-1,6-糖苷键的形式连接至受体链上形成新的分支。关于不同来源的GBE在大肠杆菌(Escherichia coli)中的胞内表达的研究已有很多报导,如果实现其分泌表达,将大大提高应用潜力。此外,目前GBE酶活普遍较低,限制了其工业发展。同时,对GBE结构与功能的研究尚未深入,确定其活性中心将对采用分子手段提高酶活具有十分重要的意义。本论文以来源于Geobacillus thermoglucosidans STB02的GBE为研究对象,首先实现了GBE在大肠杆菌中的分泌表达,并进行机理分析。其次研究了GBE的作用机制,为生产改性淀粉提供理论指导。然后以310位氨基酸为突变对象,探究此位点对催化活性、底物特异性、转苷模式的影响规律。最后,以活性中心处的349位氨基酸为突变对象,构建具有更高酶活的突变体,并分析其可能的机理。主要研究结果如下:(1)实现了GBE在大肠杆菌BL21(DE3)中的分泌表达,在不同发酵条件下进行重复验证,先后考察了初始培养基、发酵温度、发酵时间、初始pH、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度等因素对GBE分泌表达的影响。结果表明,在不同发酵条件下都能在发酵上清液中测得GBE酶活。尤其是在培养基为TB、发酵温度为30°C、初始pH为7.5、IPTG浓度为0.005 mM的条件下培养48 h最有利于GBE的胞外生产。这是国内外首次关于GBE在大肠杆菌中的分泌表达的报道。(2)探究了GBE不依赖信号肽在大肠杆菌中进行分泌表达的机理。首先,大肠杆菌分泌表达GBE与菌体生长具有明显的同步效应。对GBE进行定位发现细胞各组分中都存在GBE,说明了GBE的胞外运输需要两步跨膜。通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察细胞形态结构,排除了由细胞自溶而造成GBE渗漏的可能。其次,通过N-端测序以及构建含有pe1B信号肽质粒发现重组菌分泌GBE的过程与含原载体pET-20b(+)/gbe的重组菌明显不同。说明构建载体pET-20b(+)/gbe时已经去除了pe1B信号肽。接着,分别构建不同载体的重组质粒发现含有不同重组质粒的菌株分泌GBE的过程十分接近,证明GBE的分泌表达不是由载体造成的。利用定点突变构建的保守氨基酸残基突变体(D352N、E452Q、D420N)胞外上清液中均存在GBE且分泌量与野生型相当,但却检测不到酶活,说明了GBE的分泌表达和酶的活性形式无关。最后,N-端截断的突变体(Nd1-10)胞外酶活、目的蛋白分泌量都受到了明显的抑制,推测GBE的分泌表达与N-端氨基酸密切相关。(3)探究了GBE与淀粉的作用方式,在最适反应条件下测定其底物特异性,发现GBE更倾向作用于支链淀粉。以直链淀粉为底物,测定GBE的水解作用和转苷作用,反应初期两者同时进行,但以转苷作用为主导。使用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析GBE的转苷模式,推测其最小作用链段为聚合度(DP)20,倾向于转移链段DP 7~17。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定产物相对分子质量,发现有环状聚合物的生成,说明GBE可以进行环化反应。(4)验证了GBE的活性中心。通过氨基酸序列比对得到GBE催化位点为Asp309、Glu452,同时发现310位丙氨酸在原核生物来源GBE亚族中非常保守。通过定点突变对关键氨基酸310位丙氨酸进行功能研究。将310位丙氨酸分别替换为甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺后,比酶活均不足野生型的10%~25%。HPAEC-PAD分析显示突变体没有改变GBE的转苷模式,但使其转苷能力受到限制。动力学分析表明310氨基酸残基影响着GBE的底物特异性。以上结果表明310位丙氨酸与GBE的催化活性、底物特异性密切相关。(5)在确定了GBE的活性中心之后,通过氨基酸序列分析发现349位蛋氨酸在相似性较高的细菌型来源GBE中较保守。通过定点突变在349位上引入羟基类氨基酸残基,相比于野生型GBE,突变体M349T和M349S的比酶活分别增加了24.5%、21.1%。通过GBE改性淀粉应用研究,发现马铃薯淀粉经过突变体M349T、M349S改性后,α-1,6-分支度分别提高了25.5%、16.5%。机理分析结果表明,将蛋氨酸替换成苏氨酸和丝氨酸提高了GBE的比酶活,可能是因为349位氨基酸残基可以与周围氨基酸残基形成了额外的氢键,同时对活性位点环境的疏水性影响较小。(本文来源于《江南大学》期刊2017-06-01）
李明月[10]（2017）在《水稻淀粉分支酶基因表达特性及启动子结构比较分析》一文中研究指出淀粉的组成与结构是决定稻米品质最主要的因素。淀粉分支酶(SBE)是水稻淀粉合成过程中的关键调控酶之一,有Os SBEI、Os SBEIIb和Os SBEIIa叁种同工酶基因型。基因启动子决定了基因的表达时间、部位及强度,对基因启动子结构的研究能够在一定程度上说明基因的表达特性。本研究以直链淀粉含量超亲变异的子代和亲本及籼稻品种八十儿和糯稻品种龙稻8号为供试材料,通过盆栽试验分析不同灌浆时期籽粒各淀粉组份含量、SBE活性、SBE同工酶基因型表达量以及克隆6个供试材料的Os SBEI、Os SBEIIb和Os SBEIIa启动子,分析启动子克隆序列的碱基变化和调控元件的变化等,旨在为阐明直链淀粉积累的调控机制及启动子结构变异与转录表达量的关系和创制品质改良的分子手段提供理论依据。研究结果如下:灌浆过程中6个供试材料的直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量呈直线增长,籼稻品种八十儿的直链淀粉积累量及积累速度优于粳稻超亲变异系品种优于糯稻品种龙稻8号;直链淀粉含量低的品种,最高粘度、热浆粘度和崩解值比较大,降低直链淀粉含量有利于提高稻米的蒸煮食味品质。灌浆过程中籽粒SBE活性变化趋势呈单峰曲线,在抽穗后20 d左右达到峰值后下降,直链淀粉含量高的品种其酶活性高于直链淀粉含量低的品种,即籼稻>粳稻>糯稻。灌浆过程中SBE同工酶基因型的转录表达量变化动态与酶活性变化动态一致,二者呈极显着正相关关系。OsSBEIIb在胚乳中的表达量最高,Os SBEI次之,Os SBEIIa最低,几乎不表达。在6个供试材料的SBE同工酶基因型中,Os SBEIIb启动子序列变异程度最低,与NCBI已公布的日本晴同源性高达99.93%,Os SBEI基因启动子为99.20%,而Os SBEIIa基因启动子为96.90%,但其变异程度却最高。供试材料间各SBE同工酶基因型启动子虽然有不同程度的碱基变异,但这些变异位点并没有引起启动子调控元件种类的变化,只是引起了数量上的变化。Os SBEI、Os SBEIIb和Os SBEIIa启动子序列均包含多种顺式作用元件,不仅包含基本核心调控元件、加强转录水平的调控元件、种子特异表达必需元件,还包含大量的光相应相关元件、激素响应相关元件、逆境诱导相关元件、组织表达相关元件等。超亲变异子代各SBE同工酶基因型启动子序列与亲本存在不同程度的变异,Os SBEI只有1处碱基变化,该变化引起2种调控元件的改变;Os SBEIIb的碱基序列存在4处变化,引起了4种调控元件的改变;Os SBEIIa的5处碱基变化导致7种调控元件的改变。(本文来源于《东北农业大学》期刊2017-06-01）
淀粉分支酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
淀粉是小麦籽粒最重要的组分,它决定粒重与食用品质,因此,研究小麦淀粉合成的分子机制对深入解析小麦产量和品质的调控网络具有重要意义。淀粉分支酶(Starch-branching enzyme,SBE)能够在葡聚糖链上引入α-1,6糖苷键,被认为是控制支链淀粉合成关键酶,由多个同工酶组成(SBEI、SBEIIa、SBEIIb、SBEIII等)。实验室前期利用iTRAQ蛋白质组学方法发现SBE的一个同工酶(SBEIIb)在灌浆期小麦籽粒内表达丰度显着高于其它同工酶,表明其在支链淀粉合成中发挥了重要作用。为解析调控TaSBEⅡb基因表达的分子机制,本研究分离出该基因的启动子序列,进而对该启动子不同片段进行了活性测定,找出驱动TaSBEⅡb表达的主要功能区域;并将该功能区域与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出了两个转录因子-TaNAC15 (NAC domain-containing protein 15)和TaHSF (Heat stress transcription factor);进一步通过酵母单杂交和LUC试验分别验证了转录因子与启动子之间的结合能力;同时,在田间条件下利用病毒诱导基因沉默技术(BSMV-VIGS),获得了TaNAC15和TaHSF瞬时沉默的小麦植株,发现2个转录因子沉默小麦植株籽粒内TaSBEⅡb的表达量、粒长、粒宽与千粒重均显着下降,表明TaNAC15和TaHSF通过与TaSBEⅡb基因的启动子结合,进而调控了该基因的表达,参与了小麦籽粒淀粉的合成。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
淀粉分支酶论文参考文献
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[4].陈琛.分支酶修饰蜡质大米淀粉结构与性质研究[D].江南大学.2019
[5].辛辰昊.淀粉分支酶在大肠杆菌中的非经典分泌研究[D].江南大学.2019
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[9].刘艺婷.淀粉分支酶在大肠杆菌中的分泌表达及其分子改造研究[D].江南大学.2017
[10].李明月.水稻淀粉分支酶基因表达特性及启动子结构比较分析[D].东北农业大学.2017
论文知识图
