唐强1王芳2赵振峰3李刚4李洪梅5
（1黑龙江中医药大学附属二院康复医学科黑龙江哈尔滨150001）
（2黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040）
（3大庆市人民医院康复医学科黑龙江大庆163318）
（4齐齐哈尔市第一医院康复医学科黑龙江齐齐哈尔161000）
（5黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040）
【中图分类号】R743.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2011）8-0012-02
【摘要】目的探讨康复训练对大鼠海马梗死后SDF-1α蛋白表达的影响。方法55只健康SD大鼠(雄性，体重200-250g)采用数字随机方法，选取5只作为正常对照组，其余大鼠造模后分为模型组和康复组。每组分为训练前、3天、7天、14天、21天五个亚组，每个亚组各5只。康复训练组给予水迷宫训练，模型组不给予任何处理。与各时间点采用免疫组化法检测大鼠海马组织中SDF-1α蛋白表达情况。结果与对照组比较，模型组、康复训练组海马缺血区SDF-l蛋白表达增加(P<0.05)；与模型组比较，康复训练3、7、14、21天，康复训练组SDF-1α蛋白的表达增加，两者有统计学差异(P<0.05)。结论康复训练能够促进大鼠海马梗死后缺血区SDF-1α蛋白的表达。
【关键词】康复训练海马梗死SDF-1α
脑缺血时，缺血组织内的基质细胞衍生因子(SDF-lα)表达增加，其与内皮祖细胞(EPC)表面的CXCR4受体结合，进而促进骨髓EPC的动员、增殖并向缺血区迁移和归巢。EPC能在缺血区分化为成熟的血管内皮细胞，促进新血管形成，从而改善缺血组织的血液[1]。本研究以海马梗死的大鼠为受试对象，以康复训练为干预手段，探讨康复训练方法对海马梗死后缺血区SDF-1α表达的影响。
1实验材料
1.1实验动物
清洁级成年SD雄性大鼠55只，体重200～250g，由黑龙江中医药大学动物中心提供。动物使用许可证号：许可证号scxk(京)2007—0001。
1.2主要试剂
虎红（四氯四碘荧光素纳）粉剂，国药集团化学试剂有限公司，批号：F20091021。SDF-1α抗体购自武汉博士德公司；生物素化山羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森公司；SP二抗试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉公司。
1.3主要仪器
冷光源由本实验室与哈尔滨工业大学联合研制，激光为发光光源，滤去全部紫外线与红外线，投射出单一绿光束，波长为（530±30）nm。Morris水迷宫，华北正华生物仪器设备有限公司。
2实验方法
2.1实验分组
采用随机数字方法，将55只大鼠选取5只作为正常对照组、其余大鼠造模后随机模型组和康复训练组。每组分为训练前、训练3天、7天，14天，21天五个亚组，每小组各5只。
2.2模型制备
参照[2-3]采用光化学法诱导海马梗死模型：大鼠用10％水合氯醛按35mg/kg常规麻醉后，将其俯卧于脑立体定位仪上，沿头颅正中切开头皮暴露颅骨，在前囟后3.5mm、中线向左旁开2mm处，用牙科钻轻轻钻一个直径约1mm的骨窗，光纤管尾端至硬膜下3.5mm。虎红按70mg/kg于腹腔注射。注射时间1.5分钟。5min后通过光纤管照射局部海马组织。照射时间：5min。术后缝合头皮，正常喂养。
2.3康复训练方法
Morris水迷宫训练:从站台所占象限外的另三个象限随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入池中，观察并记录大鼠寻找并爬上平台的潜伏期。如2分钟内找不到站台，则将其在站台上放置30s后再放回笼中，此时潜伏期记为120s。训练时分别从三个不同的入水点入水，每次不同动物的入水点相同，训练顺序固定。每日训练3次，早中晚各一次。
2.4标本采集及检测
2.4.1取材：大鼠在各自观察时间点结束后常规麻醉，剖胸暴露心脏，升主动脉插管，用200ml生理盐水快速灌注冲洗，再用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液500ml先快后慢灌注固定；断头取脑，取视交叉前后2mm脑组织，常规包埋切片。
2.4.2SDF-1α免疫组化步骤：切片脱蜡至水，92～98℃抗原热修复15min；血清封闭，滴加兔抗大鼠一抗(SDF-1α与抗体稀释液比例为1：300)，同时滴加PBS代替一抗做阴性对照；4℃过夜，37℃复温1h，滴加生物素化二抗，37℃下作用20min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃下作用20min；DAB显色，苏木素复染，分化、透明、封片。
2.4.3结果判定：SDF-1α蛋白定量分析：在200倍视野下，采用LeicaQwin图像测量分析软件自动测定观察区阳性细胞平均光密度(opticaldensity，OD)值，即为蛋白质表达结果。
2.5统计学分析
用SPSS13.0软件进行数据的统计学处理，所得数据用均数±标准差（x-±s）表示，各组组间差异采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
实验各组大鼠海马缺血区SDF-1α检测结果：实验结果显示：对照组大鼠脑内有少量SDF-1α蛋白表达。与对照组比较，模型组缺血区SDF-1α蛋白表达在缺血后就开始增加，其后呈增高趋势(P<0.05)，第7天达峰值(P<0.01)，第14天开始回落，但仍有较高表达，第21天时仍未回到对照组水平。康复训练组SDF-1α蛋白表达规律及部位同模型组，训练开始前表达增加，高峰仍在第7天。与模型组相应时间点比较，康复组SDF-1α蛋白表达更加明显，训练前表达开始增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；训练第3天表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；再灌注第7，14，21天组间比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。
表1各组大鼠缺血区SDF-1α蛋白表达结果（x-±s）
4讨论
既往对脑缺血后神经再生及修复机制的研究较多，而对血管再生的关注相对较少。脑缺血后，缺血区新生血管的范围和程度直接影响到缺血区血流灌注状态，进而影响神经功能的恢复。血管再生分血管新生和血管发生两个途径：血管新生指血管内皮细胞的出芽生长，是被人们所接受和认识的传统的血管生成方式；而血管发生则指EPCs的成血管方式。既往在对缺血性脑血管病的血管修复机制研究中，对血管新生研究较多，而对血管再生研究很少。
脑组织缺血后，脑内的新生血管可以源于血管发生[4]。因此，脑缺血发生后，脑外的成血管因素-EPCs可被动员入血，从而起到促进缺血区血管再生的作用。而且脑内释放的某些细胞因子正是动员脑外成血管的条件之一。具有代表性的促血管发生细胞因子为SDF-1，分SDF-lα和SDF-1β两型。其中，SDF-1α在促进EPCs增殖、归巢方面的作用已被肯定[5]。SDF-1α是CXC趋化因子家族成员之一，是为数不多的表达于脑组织中的趋化因子之一，近年来SDF-1及其受体CXCR4轴成为研究组织新生的热点，其作用机制为SDF-1α可促进血管发生，从而进一步促进新生组织生长。SDF-1α促进血管发生的机制可能为：缺血后，损伤组织释放缺氧诱导因子-1等刺激SDF-1α释放入血，并改变骨髓微环境，SDF-1α与其受体CXCR4结合后激活磷脂酰肌醇-3激酶(P13K)/蛋白激酶B(Akt)信号途径，促进骨髓EPCs释放并归巢到缺血组织参与血管生成[6]。GuerinE等[7]认为SDF-1α常伴随EPCs出现在新生血管周围。
本实验结果显示：正常脑组织可以少量表达SDF-1α蛋白质。脑缺血后，缺血区脑组织释放出大量SDF-1α,缺血后第7天达高峰，第2l天仍未回到对照组水平。康复训练组SDF-1α的表达规律同模型组；与模型组比较，康复训练组各观察时间点SDF-1α的表达水平增高，差异具有统计学意义。提示康复训练能够促进缺血区促血管发生的细胞因子－SDF-1α蛋白表达增加，这与赵旺[8]研究结果相似。因此我们初步推测：康复训练可能通过上调脑缺血大鼠脑组织SDF-1a水平来促进骨髓EPCs释放并归巢到脑缺血区，从而促进脑内血管发生。
参考文献
[1]张珊珊,罗勇.SDF-1／CXCR4轴在内皮祖细胞治疗脑缺血中的作用[J].国际脑血管病杂志,2009,17（10）:792-796.
[2]WastonDB,DietrichWD,BustoR,etal.Inductionofreproduciblebraininfarctionbyphotochemicallyinitiatedthrombosis[J].AnnNeurol,1985,17:497-504.
[3]潘惠娟,李玲,刘卫,等.光化学法诱导大鼠双侧海马梗死模型的建立[J].中华物理医学与康复杂志,2005,27(11):645-648．
[4]ZhangZG，ZhangL，JiangQ，eta1．Bonemarrow-derivedendothelialprogenitorcellsparticipateincerebralneovascularizationafterfocalischemicintheadultmouse[J]．CircRes，2002，90：284-288．
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[8]赵旺,罗勇.电针对局灶脑缺血再灌注大鼠大脑皮质基质细胞衍生因子-1α表达的影响及其促进脑内血管再生的作用[J].中华物理医学与康复杂志,2010，32(6):409-413.