刘遥测[1]2005年在《番茄TTOM1基因的克隆及其RNA沉默表达载体的构建》文中进行了进一步梳理根据本实验室克隆的番茄TTOM1基因的全长cDNA序列设计一对特异性引物，用PCR的方法获得番茄TTOM1基因。该基因长6726bp，包含有11个外显子和10个内含子11个外显子的长度依次为150，91，55，88，73，82，38，68，56，74和90，10个内含子的长度依次为680，87，874，78，830，202，126，2281，447和78bp。通过构建RNA沉默表达载体(RNA干扰表达载体、病毒表达载体等)，用叁亲结合的方法将其导入农杆菌EHA105中，并侵染番茄Flamingo-Bill外植体，获得3株转基因番茄。PCR反应及Southern杂交实验表明，外源基因片段已经插入到番茄的染色体中。
陈冰[2]2006年在《烟草与番茄TOM类基因克隆与功能初步分析》文中研究指明在植物中已发现一些寄主因子与病毒的复制有关,如拟南芥中的AtTOM1基因与烟草花叶病毒(TMV)的复制相关。本论文根据拟南芥、番茄和水稻中的TOM1基因序列设计简并引物,利用RT-PCR手段在本氏烟及番茄中扩增了TOM1基因的同源序列片断(NbTOM1和TTOM1),通过序列比较发现这两个片断与其它几种植物中TOM1类基因都有较高的同源性。分别将NbTOM1和TTOM1引入中国番茄黄化曲叶病毒卫星分子改造的沉默载体(DNAmβ),获得了重组载体DNAmβ:NbTOM1和DNAmβ:TTOM1。将DNAmβ:NbTOM1与中国番茄黄化曲叶病毒共同接种本氏烟,Northern blot分析证明病毒诱导NbTOM1沉默后,几乎完全遏制了本氏烟中TMV的复制,并且,半定量RT-PCR分析发现本氏烟中NbTOM1 mRNA的积累几乎被完全遏制。本论文证明通过沉默NbTOM1是一种有效的获得抗TMV植株的方法,同时表明病毒诱导的基因沉默是一种切实有效的鉴定基因功能的工具。
张会敏[3]2004年在《辣椒CTOM1基因的克隆与基因沉默表达质粒的构建》文中研究说明利用5’RACE和3’RACE方法从辣椒中克隆到CTOM1基因，其全长cDNA共1244个碱基对，编码一个由282个氨基酸组成的六次跨膜蛋白。CTOM1与拟南芥TMV寄主因子基因AtTOM1在核苷酸水平有65.2％的同源性，在氨基酸水平上有74.9％的同源性；与番茄CMV寄主因子基因TTOM1在核苷酸水平上有81.7％的同源性，在氨基酸水平上有91.7％的同源性，表明CTOM1很可能也是辣椒RNA病毒的寄主因子基因。构建了研究该基因功能的叁种质粒：基于CTOM1基因的近5’端序列的反义RNA植物表达质粒；基于CTOM1全长cDNA的pTV00：CTOM1病毒表达质粒和基于CTOM1 cDNA片段的RNAi表达质粒。用叁亲结合方法将上述质粒导入农杆菌，并用于转化辣椒“天等一号”和“桂研99”外植体，获得转CTOM1 RNAi表达质粒阳性“天等一号”转基因植株22株、转CTOM1反义RNA载体抗卡那霉素小苗12株和转CTOM1反义RNA质粒的“桂研99”抗卡那霉素小苗19株。用烟草花叶病毒接种转CTOM1 RNAi阳性植株，在观察期15天内，未观察到症状表现，而非转基因植株在第9天已显示明显症状，表明CTOM1功能的干扰能导致植株抗病毒能力的提高，暗示CTOM1可能是一个与烟草花叶病毒在辣椒中复制与维持相关的寄主因子基因。
汪丽[4]2011年在《草莓乙烯受体Etr1基因克隆及其植物表达载体的构建》文中研究说明草莓是一种经济价值很高的果品,但果实采后极易软化腐烂,不耐贮运,造成很大的经济损失。乙烯受体Etr1基因在草莓果实成熟阶段表达较多,可能与果实的成熟密切相关。深入研究Etr1基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此,本研究以全明星草莓基因组DNA为模板,PCR扩增到了草莓乙烯受体Etr1基因片段,构建了该基因的反义和RNA干扰植物表达载体。主要结果如下:(1)根据已发表的Chandlar草莓乙烯受体Etr1的保守氨基酸序列,设计了一对特异性引物,PCR扩增得到一个长617bp的基因片段,序列分析表明该片段与GenBank中Chandlar草莓Etr1基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性高达98%,无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓Etr1基因片段。(2)将克隆到的全明星草莓Etr1核苷酸序列反向克隆到了pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Etr1。用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI221-anti-Etr1和pBI121质粒,切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和Etr1的反义序列,将其定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达载体pBI121-anti- Etr1。(3)将Etr1的序列正向插入到中间载体pBI221质粒的BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-sense-Etr1。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切构建好的反义表达载体pBI121-anti- Etr1和中间载体pBI221-sense-Etr1。切下中间载体质粒上的GusA、NOS终止子和正义序列,将其插入到切除了GusA和NOS终止子的pBI121-anti-Etr1质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Etr1-RNAi。(4)利用冻融法将pBI121-anti-Etr1、pBI121-Etr1-RNAi两个植物表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。
刘思思[5]2012年在《草莓乙烯受体FaErs1基因克隆及RNAi植物表达载体构建》文中认为草莓(Fragaria ananassa Duch.)属于蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生草本植物。草莓果实鲜美,多汁,营养价值高,含有丰富Vc,草莓果实富含的营养容易被人体消化、吸收,是老少皆宜的健康食品。每年夏季6~7月间是果实成熟采摘季节。但由于其果皮极薄,含水量高,容易受微生物侵染和机械损伤而腐烂变质,不耐贮运,传统的贮藏保鲜技术对草莓果实的保存时间并不长,在运输贮藏过程中造成很大的经济损失。自上世纪八十年代末开始,国外一些试验室开展了利用转基因技术延长果蔬成熟衰老过程的研究,我国在相关方面的研究起步较晚但发展很快,目前已有多种植物利用反义ACS或ACO基因技术来延迟果实的成熟衰老过程。相关研究表明,在草莓果实成熟阶段,乙烯的大量表达可能与受体基因FaErs1有关。深入研究FaErs1基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。因此,本试验以全明星草莓组培叶片为原材料,提取植物DNA基因组,设计特定引物,经PCR扩增得到目的片段。用于构建Ers1目的片段的反义载体和RNAi表达载体。从而达到封闭该基因的效果。主要结果如下:⑴根据草莓乙烯受体FaErs1的基因序列,设计一对特异性引物,通过PCR的方法,从总长为2082bp的全明星草莓乙烯受体基因中克隆到一段长为667bp的乙烯受体FaErs1基因片段。通过测序及使用DNAMAN生物学软件进行同源性等分析,结果表明克隆片段与GenBank中注册的Chandler-Ers1同源性高达99%。可以表明克隆片段即为全明星草莓乙烯受体FaErs1基因片段。⑵设计一对带有SmaⅠ-BamHⅠ酶切位点特异性引物,反向克隆全明星草莓FaErs1基因片段,连接至pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Ers1。酶切下中间表达载体pBI221-anti-Ers1的CaMV 35S启动子和FaErs1的反义序列,定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达中间载体pBI121-anti- Ers1。⑶设计一对带有XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点特异性引物,正向克隆全明星草莓FaErs1基因片段,连接至pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Ers1。切下中间表达载体pBI221-anti-Ers1上的35S启动子和正义序列,将其插入到切除了35S启动子的pBI121-anti-Ers1质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Ers1-RNAi。⑷利用冻融法将pBI121-anti-Ers1、pBI121-RNAi-Ers1两个表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。
宋春丽[6]2009年在《草莓乙烯受体FaEtr2基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究》文中提出草莓是一种经济价值很高的果品,但果实采后极易软化腐烂,不耐贮运,造成很大的经济损失。乙烯受体FaEtr2基因在草莓果实成熟阶段大量表达,可能与果实的成熟密切相关。深入研究FaEtr2基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此,本研究以全明星草莓基因组DNA为模板,PCR扩增到了草莓乙烯受体FaEtr2基因片段,构建了该基因的反义和RNA干扰植物表达载体。以全明星草莓组培苗叶片为试材,研究了基本培养基、激素配比、外植体生理状态、苗龄、暗培养时间等,对草莓不定芽再生的影响,优化了草莓再生条件,获得了草莓高效再生体系。通过叶盘与农杆菌共培养的方法建立了全明星草莓的遗传转化体系,获得了Kanamycin抗性植株。Gus化学组织染色和PCR检测分析表明FaEtr2-RNAi基因已转入全明星草莓植株。主要结果如下:(一)全明星草莓FaEtr2基因克隆及表达载体构建⑴根据已发表的Chandlar草莓乙烯受体FaEtr2的保守氨基酸序列,设计了一对特异性引物,PCR扩增得到一个长1049bp的基因片段,序列分析表明该片段与GenBank中Chandlar草莓FaEtr2基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性高达100%,无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓FaEtr2基因片段。⑵将克隆到的全明星草莓FaEtr2核苷酸序列反向克隆到了pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Etr2。用BamHⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI221-anti-Etr2和pBI121质粒,切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和FaEtr2的反义序列,将其定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达载体pBI121-anti- Etr2。⑶将FaEtr2的序列正向插入到中间载体pBI221质粒的BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-sense-Etr2。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切构建好的反义表达载体pBI121-anti- Etr2和中间载体pBI221-sense-Etr2。切下中间载体质粒上的GusA、NOS终止子和正义序列,将其插入到切除了GusA和NOS终止子的pBI121-anti-Etr2质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Etr2-RNAi。⑷利用冻融法将pBI121-anti-Etr2、pBI121-Etr2-RNAi两个表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。(二)叶片再生体系的建立⑴对所试的叁种基本培养基,MS(1 /2N)、MS和1/2MS,MS(1 /2N)基本培养基最好,分化率可达75.76 %。30天和35天叶龄的叶片外植体分化率高,分别为58.62 %和58.86 %。以幼嫩叶片为外植体,分化率和平均不定芽位点数分别为35.71%和0.46,显着高于老叶片处理(分化率和平均不定芽位点数分别为19.23%和0.23),二者的玻璃化率差异不显着。⑵随着TDZ浓度的升高,叶片分化率、平均不定芽位点数都呈上升趋势,同时玻璃化率也呈上升趋势。TDZ 1.0 mg·L-1和1.5 mg·L-1处理叶片分化率(分别为32.98%和36.67%)、平均不定芽位点数(分别为0.42和0.47)均较高,但TDZ 1.5mg·L-1处理的玻璃化率显着高于TDZ 1.0 mg·L-1处理。综合考虑确定TDZ 1.0 mg·L-1为全明星草莓叶片再生的适宜浓度。⑶IBA和NAA都是在浓度为0.05 mg·L-1时再生效果最好,叶片分化率分别为68.99 %和38.93 %。0.05 mg·L-1的IBA和1.0 mg·L-1的TDZ配合使用是适用于的全明星草莓叶片再生的最佳激素处理。较高浓度的NAA(0.2 mg·L-1~0.3 mg·L-1)处理中,再生的不定芽玻璃化率较高。同水平的IBA与TDZ组合,叶片分化率、平均不定芽位点数和平均每叶片再生不定芽数均显着高于NAA与TDZ组合。⑷不经暗培养的叶片再生频率较低,随着暗培养时间的延长,叶片分化率和平均不定芽位点数都呈上升趋势,暗培养9天和12天的叶片分化率分别为40.54%和34.29%,显着高于其他处理。(叁)遗传转化体系的建立⑴Cef 200 mg·L-1时组培苗植株及侧芽生长都基本正常,达到或超过300 mg·L-1植株生长及侧芽分化都受到明显抑制。200 mg·L-1 Cef可基本抑制农杆菌的生长。Km 20 mg·L-1可抑制非转化芽分化,可用于抗性不定芽筛选。⑵农杆菌LBA4404在菌液浓度为OD600=0.5左右时,菌体增殖最快;预培养3天的叶片抗性不定芽生成率最高,为18.9 %,与其他预培养时间处理间差异极显着;附加10 mg·L-1或20 mg·L-1的AS,抗性不定芽的分化率从7.53%分别提高到15.09 %和14.55 %。⑶用OD600为1.0重悬菌液侵染叶片比用OD600为0.5的原菌液侵染效果好,抗性不定芽分化率由6.15 %提高到15.8 %;用不同浓度的重悬菌液侵染叶片,OD600为1.0时效果最好,抗性不定芽生成率为18.55%。适宜的浸染时间为10 min,抗性不定芽生成率最高,为21.46 %。⑷不同共培养时间和脱菌培养时间的组合以共培养3天,脱菌培养3天的叶片分化率、抗性不定芽位点数、每叶盘不定芽数最高,分别为13.49 %、0.18、0.22,是全明星草莓遗传转化的最适时间组合。经Km筛选,GUS组织化学染色和PCR检测,共得到7个株系的转基因植株。
谢玲[7]2006年在《CfTOM1抗病毒转基因辣椒的遗传分析》文中研究表明拟南芥AtTOM1基因是拟南芥中系统获得的支持烟草花叶病毒复制的寄主因子基因。为了鉴定辣椒的一个与拟南芥AtTOM1基因同源的CfTOM1基因的功能，本实验室构建了一个以CfTOM1为靶基因的RNA干涉辣椒表达载体pBICRNAi3，并用根癌农杆菌介导法转化辣椒“天等一号”，共获得33株抗性再生苗。对T_0、T_1和T_2代植株进行PCR检测、PCR产物测序和PCR-Southern杂交分析，证实了这些再生苗为转基因植株。对T_2代植株分别进行烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和番茄花叶病毒接种实验，结果表明转基因植株对叁种病毒的抗性显着增强，证明辣椒CfTOM1基因是支持病毒复制与维持相关的寄主因子，其作用机制很可能与拟南芥的AtTOM1基因相似。
参考文献：
[1]. 番茄TTOM1基因的克隆及其RNA沉默表达载体的构建[D]. 刘遥测. 广西大学. 2005
[2]. 烟草与番茄TOM类基因克隆与功能初步分析[D]. 陈冰. 浙江大学. 2006
[3]. 辣椒CTOM1基因的克隆与基因沉默表达质粒的构建[D]. 张会敏. 广西大学. 2004
[4]. 草莓乙烯受体Etr1基因克隆及其植物表达载体的构建[D]. 汪丽. 河北农业大学. 2011
[5]. 草莓乙烯受体FaErs1基因克隆及RNAi植物表达载体构建[D]. 刘思思. 河北农业大学. 2012
[6]. 草莓乙烯受体FaEtr2基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究[D]. 宋春丽. 河北农业大学. 2009
[7]. CfTOM1抗病毒转基因辣椒的遗传分析[D]. 谢玲. 广西大学. 2006